Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Резюме

Эта рукопись представляет собой протокол, чтобы вызвать активный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) у мышей. Метод изоляции и характеристики проникли лимфоцитов в центральной нервной системе (ЦНС) также представлен, чтобы показать, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.

Аннотация

Рассеянный склероз (МС) является аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), вызванным сочетанием факторов окружающей среды и восприимчивого генетического фона. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) является типичной моделью заболевания MS широко используется для исследования патогенеза, в котором Т-лимфоциты, характерные для миелин антигенов инициировать воспалительные реакции в ЦНС. Очень важно оценить, как лимфоциты в ЦНС регулируют развитие болезни. Тем не менее, подход к измерению количества и качества проникли лимфоцитов в ЦНС очень ограничен из-за трудностей в изоляции и обнаружения проникли лимфоцитов из мозга. Эта рукопись представляет собой протокол для того, что полезно для изоляции, идентификации и характеристики проникли лимфоцитов из ЦНС и будет полезно для нашего понимания того, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.

Введение

Как хроническое демиелинизирующей болезни ЦНС, MS затрагивает около 2,5 миллионов человек во всем мире и не хватает лечебного^{лечения 1}. Он также считается аутоиммунным заболеванием, при котором миелин антиген специфических Т-лимфоцитов инициировать воспалительные реакции и привести к демиелинизации и аксональной травмы в^{ЦНС 2}. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) широко используется для исследования патогенных механизмов MS как классическая модель аутоиммунных демиелинизации в^{ЦНС 3}. Есть два способа индуцировать ЕАЭ: один заключается в том, чтобы индуцировать EAE активно иммунизации животных с компонентами миелина, другой является приемная передача путем передачи энцефалитогенных^{Т-клеток в рецептор 2,4,5}. Восприимчивость к ЕАЕ различна в различных штаммах животных^6. У мышей C57BL/6, миелин олигодендроцит гликопротеин (MOG) 35-55 вызов вызывает монофазное заболевание с обширной демиелинизации и воспаления в ЦНС, который часто используется в экспериментах с генно-целевых^{мышей 7}.

Генерация миелин-специфических реактивных Т-клеток необходима для возникновения и развития заболевания в ЕАЭ и является иммунологическим признаком как ЕАЕ, так и MS. Активированные аутореактивные Т-лимфоциты пересекают геммозефалический барьер (BBB) в здоровую ЦНС и инициируют болезнь ЕАЭ. Когда MOG 35-55 Ag встречается, эти Т-лимфоциты вызывают воспаление и набор клеток-эффекторов в ЦНС, что приводит к демиелинизации и разрушению^{аксона 8,9}. В модели EAE, есть достаточно доказательств того, что нейроантиген-специфические CD4^И Т-клетки могут инициировать и поддерживать нейровоспламенение^{и патологию 3,10}. В зависимости от основных производимых цитокинов,^CD4 и T лимфоциты были классифицированы на различные подмножества: Th1 (характеризуется производством интерферона-γ), Th2 (характеризуется производством интерлейкина 4) и Th17 (характеризуется производством интерлейкина 17). Считается, что активация клеток Th1 и Th17 способствует индукции, техническому обслуживанию и регуляции воспалительной демиелинизации в ЕАЭ и МС путем секреции эффекторных цитокинов IFN-γ и IL-17, которые способны активировать макрофаги и набирать нейтрофилов в^{воспалительные участки для ускорения поражений 11}.

Поскольку аутореактивные Т-клетки пересекают BBB в ЦНС и вызывают развитие болезни в MS и EAE, очень важно анализировать Т-клетки в ЦНС. Тем не менее, Есть очень мало установленных протоколов для изоляции лимфоцитов от ЦНС¹². Поэтому был разработан метод, оптимизированный для изоляции моноядерных клеток из мозга и анализа Т-лимфоцитов с маркерами CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g и IL-17 для цитометрии потока. Метод использует MOG35-55 адъювант mycobacterium туберкулеза H37 Ra и коклюша токсина рабочего решения (PTX), чтобы вызвать активную модель иммунизации ЕАЭ у мышей. Затем для изоляции моноядерных клеток ЦНС используются методы механического разделения и центрифугации плотности. Наконец, оптимизированная стратегия цитометрии потока используется для идентификации Т-лимфоцитов и подмножества из мозга путем окрашивания нескольких маркеров.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены комитетом по животным Школы фундаментальных медицинских наук Шанхайского университета Цзяо Тонг.

1. Подготовка материалов

1. Используйте последовательность MEVGWYRSPFSRHLYRNGK MOG35-55 для получения лиофилизированного пептида из коммерческих источников. Убедитесь, что чистота пептида составляет 95%. Приготовьте раствор 10 мг/мл MOG в фосфатно-буферной солевой растворе (PBS) и храните при -20 градусов по Цельсию.
2. Приготовьте 4 мг/мл раствора бульона M. tuberculosis H37 Ra, поставив одну 100 мг трубки M. tuberculosis H37 Ra в 25 мл адъюванта Complete Freund (CFA) и смешивая. Храните решение на складе при -20 градусов по Цельсию.
3. Приготовьте 1 нг/йл коклюша токсина Рабочее решение (PTX), добавив 50 мкг PTX в 50 мл PBS. Храните рабочий раствор при -20 градусов по Цельсию.
4. Храните все антитела (например, FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A и APC anti-mouse IFN-γ) при 4 градусах Цельсия.
5. Сделайте поток цитометрии окрашивания (FCS) Буфер, добавив 2 мМ этилена диамин тетраатетической кислоты (EDTA) и 1% плода бычьей сыворотки (FBS) в 500 мл PBS.

2. Корпус мышей C57BL/6

1. Используйте самок мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель.
2. Акклиматизировать C57BL/6J мышей, по крайней мере 7 дней до инъекции.
3. Дом мышей в животном объекте в условиях, свободных от патогенов при постоянной температуре и влажности в 12 ч свет / темный цикл и обеспечить свободный доступ к воде и стандартной пищи гранул.

3. Иммунизация мышей C57BL/6

1. Оставьте все растворы на 15 минут при комнатной температуре (RT), чтобы обеспечить полную регидратацию.
2. Разбавить 300 мкл раствора MOG-пептидного бульона 700 л PBS для подготовки 3 мг/мл рабочего раствора.
3. Положите 1 мл раствора M. tuberculosis H37 Ra и 1 мл пептидов MOG35-55 в отдельные шприцы 10 мл, а затем используйте четырехдневный стоп-кран для эмульгировать в течение не менее 10 мин. Обеспечь полную эмульгификацию перед инъекцией.
4. Анестезировать мышей на пике ЕАО с внутриперитониальной инъекцией 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг).
5. С помощью шприца 1 мл подкожно вводят мышам 100 МКЛ МОГ 35-55/CFA эмульсии (300 мкг/200 МКЛ) на двух участках, как сзади, так и вблизи шеи. Подкожно вводят контрольных мышей с 200 йл PBS.
6. В тот же день (день 0) и на второй день после иммунизации (PI), Intraperitoneally вводить мышей с 200 йл 1 нг / ЗЛ PTX рабочего решения. Интраперитонально вводят контрольных мышей с 200 МКЛ PBS.
7. Перенесите мышей в их домашнюю клетку с согревающим колодка.
8. Осмотр и оценка всех мышей каждый день после инъекции в слепой манере для неврологических признаков, показанных втаблице^{1 11,13}. Euthanize животных, если оценки хуже, чем класс 4.
9. Запись изменения веса во время курса болезни. Это ценная дополнительная мера для активности заболеваний в модели^{ЕАЭС 11,,13}.
10. Добавить первый день клинических признаков для отдельных мышей и разделить на количество мышей в группе; результатом является начало. Добавьте первый день максимального балла EAE для отдельных мышей и разделите на количество мышей в группе; результатом является пик.

4. Одноклеточная подготовка подвески от мозга

1. Разбавить плотность градиента среды в соотношении 9:1 с PBS в 15 мл конической трубки, чтобы дать окончательный 100% раствор.
2. Анестезировать мышей на пике ЕАЕ с внутриперитониальной инъекцией 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг) и перфузировать интракардиально с 20 мл стерильного ледяного PBS. Достичь этого путем медленного и неуклонного введения PBS в левый желудочек сердца с помощью шприца 20 мл и открытия правого атриума.
3. Вырезать череп тщательно от носа до шеи, а затем удалить мозг из черепной коробки на 10 мл RPMI в 50 мл конических труб. Хорошо перемешать, чтобы удалить адепт красных кровяных телец. Затем удалите среду с помощью аспирации и добавьте 10 мл RPMI.
4. Поместите мозги и средний в 100 мм блюдо. Мелко нарезать лезвием бритвы.
5. Перенесите 6 мл из блюда в ледяной 7 мл спекаемого стеклянного гомогенизатора с чистой пипеткой. Избегайте оставляя большое количество ткани в пипетки. Небольшое количество неизбежно.
6. Измельчить мозг с помощью "свободного" поршеня пестика во-первых, а затем использовать "жесткий" поршень, пока подвеска однородна, и залить в prechilled 15 мл конической трубки и держать на льду.
7. После того, как все образцы гомогенизированы, оцените объем. Отрегулируйте громкость с помощью RPMI до 7 мл. Затем поместите 3 мл ледяной 100% мембранной матрицы подвала в охлажденную 15 мл конической центрифуги трубки и добавить 7 мл однородного мозга, чтобы дать окончательный 30% плотности градиента среды. Смешайте с инверсией пару раз. Не вихрь.
8. Для обеспечения острого интерфейса, тщательно и медленно добавить 1 мл 70% среды плотности ложения в RPMI с 3 мл пипетки.
9. Центрифуга при 800 х г всего 20 мин при 4 градусах Цельсия. Установите ускорение до 1 и замедление до 0. После центрифугации, аспирировать почти всю верхнюю фазу, будьте осторожны, чтобы полностью удалить миелин в верхней части(рисунок 1).
10. Удалите интерфейс в новую 15 центрифугную трубку. Отрегулируйте громкость до 10 мл с помощью RPMI.
11. Центрифуга по 500 х г в течение 10 мин. После центрифугации, аспирировать супернатанта. Повторное окрашивание гранул в буфер цитометрии потока (FSC) в размере 200 мл. Гранулы затем готовы к пятнам для FACS.

5. Поток цитометрического анализа одиночных клеток из мозга

1. Используйте гемоцитометр и микроскоп для подсчета клеток. Добавьте 10 МКЛ клеток в 10 МКЛ трипан-голубого цвета, хорошо перемешайте и поместите 10 МКЛ на гемоцитометр для подсчета клеток. Затем вычислите количество живых клеток на микролитер под перевернутым микроскопом (например, перевернутый микроскоп Olympus).
2. Aliquot приблизительно 2 x 10^{6 клеток} в RPMI в один колодец пластины 96 хорошо.
3. Добавить 500x клеточной стимуляции коктейль плюс ингибиторы транспортировки белка в скважины.
4. Инкубировать пластину в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию в течение 4 ч.
5. Центрифуга клетки на 400 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант и повторно потекут клетки в 100 МКЛ буфера FCS.
6. Преднавите клетки с анти-мышь CD16/CD32 Fc блок (1:33) в течение 10 минут при 4 градусов по Цельсию, прежде чем окрашивание, чтобы блокировать неспецифические Fc-опосредованного взаимодействия.
7. Маркеры поверхности пятна клетки без мытья. Добавьте антимошки CD45.2 (1:200), антимошки CD11b (1:200), антимошки CD3 (1:200), и анти-мышь CD4 (1:200) антитела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения положительных и отрицательных ворот, флуоресценция минус один (FMO) для каждого цвета и антитела контроля изотипа должны быть окрашены.
8. Инкубировать пластину, по крайней мере 30 мин при 4 градусов по Цельсию или на льду. Защитите от света.
9. Вымойте ячейки, добавив FCS Buffer. Используйте 200 мкл/колодец для микротитрных пластин. Центрифуга при 400 x g в течение 5 мин в RT. Отбросьте супернатант.
10. Добавьте 200 МКЛ внутриклеточного буфера фиксации (IC) к каждой хорошо, чтобы исправить клетки. Убедитесь, что ячейки полностью перерасходуются в растворе.
11. Инкубация 30-60 мин на RT. Защита от света.
12. Центрифуга образцов на 400 х г на RT в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта.
13. Добавьте 200 МКЛ 1x буфера пермяки к каждой колодец и центрифугировать образцы на 400 х г в RT в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта.
14. Переусердствить гранулы в остаточном объеме и настроить объем примерно до 100 мкл с 1x буфером проницаемости.
15. Добавьте антимышечные ИЛ-17А (1:200) и антимошечные антитела IFN-g (1:200) для обнаружения внутриклеточных антигенов в клетки.
16. Инкубировать в течение по крайней мере 30 мин при 4 градусов по Цельсию. Защитите от света.
17. Добавьте 100 МКЛ 1x буфера пермяки к каждой колодец и центрифугировать образцы на 400 х г в RT в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта.
18. Resuspend окрашенных клеток в 100 йл потока цитометрии окрашивания буфера.
19. Анализ по цитометрии потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки лазера и компенсации на цитометре потока корректируются, образцы помещаются на цитометр, и все события регистрируются в соответствии с рекомендациями производителя.

6. Анализ данных

1. Ворота синглеты с использованием FSC-A против FSC-H и SSC-A против SSC-H.
2. Ворота живых ячеек с использованием FSC-A и SSC-A в зависимости от размера.
3. Далее, определить лейкоциты, за исключением моноцитов, путем gating на CD45^и CD11b^{- клетки.}
4. Затем определите лимфоциты CD4 T, заготовив клетки CD3-CD4.
5. Наконец, определите подмножества Th1 и Th17, поразив ячейки IFN-γ и IL-17 по отдельности, а также определите положительные и отрицательные популяции, использующие изотипные элементы управления и FMO.

Результаты

После иммунизации мышей C57BL/6, все мыши были взвешены, рассмотрены, и градуированных ежедневно для неврологических признаков. Репрезентативный клинический курс ЕАЭ должен привести к кривой заболевания, представленной на рисунке 2A, и изменению массы тела в мыши, представ...

Обсуждение

Это исследование представляет собой протокол для индуцирования и мониторинга ЕАЕ с использованием MOG35-55 у мышей C57BL/6, которые считаются типичной нейроиммунологической экспериментальной животной моделью MS. EAE может быть индуцирована с изменением штаммов мышей или типа белка, используе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK