JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Özet

Multipl skleroz (MS), çevresel faktörler ve duyarlı genetik arka planın birleşimi ile oluşan merkezi sinir sisteminin (CNS) otoimmün bir hastalığıdır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), Miyelin antijenlerine özgü T lenfositlerinin CNS'de inflamatuar reaksiyon başlattığı patogenezi araştırmak için yaygın olarak kullanılan tipik bir MS hastalığı modelidir. CNS lenfositler hastalığın gelişimini nasıl düzenleyen değerlendirmek için çok önemlidir. Ancak, CNS'de infiltrasyonlu lenfositlerin miktarını ve kalitesini ölçme yaklaşımı, beyinden sızmış lenfositlerin izole edilmesi ve saptanmasındaki güçlükler nedeniyle çok sınırlıdır. Bu el yazması, CNS'den infiltrasyona geçen lenfositlerin izolasyonu, tanımlanması ve karakterizasyonu için yararlı olan bir protokol sunar ve lenfositlerin CNS otoimmün hastalığının gelişiminde nasıl rol aldığını anlamamıza yardımcı olacaktır.

Giriş

CNS kronik bir demiyelinating hastalık olarak, MS dünya çapında yaklaşık 2,5 milyon kişi etkiler ve küratif tedavileryoksun 1. Ayrıca bir otoimmün hastalık olarak kabul edilir, hangi miyelin antijen spesifik T lenfositler inflamatuar bir reaksiyon başlatmak ve CNS demiyelinasyon ve aksonal yaralanmaya yol2. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) yaygın CNS bir klasik otoimmün demiyelinasyon hastalığı modeli olarak MS patojenik mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır3. EAE ikna etmek için iki yolu vardır: bir miyelin bileşenleri ile hayvanlar aşılayarak aktif EAE ikna etmektir, başka reseptöriçineensefalojenik T hücreleri aktararak benimseyen transfer 2,4,5. EAE duyarlılıkları farklı hayvan suşları farklıdır6. C57BL/6 farelerinde, myelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) 35-55 sorun cns geniş demiyelinasyon ve inflamasyon ile monophasik bir hastalığa neden olur, sık sık gen hedefli fareler ile deneylerde kullanılan7.

EAE'de hastalığın oluşumu ve gelişimi için miyelinspesifik reaktif T hücrelerinin üretimi gereklidir ve hem EAE hem de MS. Aktif otoreaktif T lenfositlerinin sağlıklı CNS'ye kan beyin bariyerini (BBB) geçmelerinin ve EAE hastalığının başlatılmasının immünolojik bir işaretidir. MOG 35-55 Ag karşılaştığında, Bu T lenfositler inflamasyon ve CNS içine efektör hücrelerin işe neden, demiyelinasyon ve akson yıkımı ile sonuçlanan8,9. EAE modelinde, nöroantijene özgü CD4+ T hücrelerinin nöroinflamasyon vepatolojiyibaşlatabildiği ve sürdürebileceğine dair yeterli kanıt vardır 3,10. Üretilen majör sitokinlere bağlı olarak, CD4+ T lenfositler farklı alt kümelere sınıflandırılmıştır: Th1 (interferon-γ üretimi ile karakterize), Th2 (interlökin üretimi ile karakterize 4), ve Th17 (interlökin üretimi ile karakterize 17). Bu Th1 ve Th17 hücrelerinin aktivasyonu indüksiyon katkıda olduğuna inanılmaktadır, bakım, ve EAE ve MS inflamatuar demiyelinasyon düzenlenmesi etki edici sitokinler IFN-γ ve IL-17 salgılayarak, hangi makrofajlar aktive yeteneğine sahip ve lezyonları hızlandırmak için inflamatuar sitelere nötrofiller işe11.

Otoreaktif T hücreleri BBB'yi CNS'ye geçtiği nden ve MS ve EAE'de hastalığın gelişmesine neden olduğundan, CNS'deki T hücrelerini analiz etmek çok önemlidir. Ancak, CNS12lenfositlerin izolasyonu için çok az kurulmuş protokoller vardır. Bu nedenle, beyinden mononükleer hücreleri izole etmek ve t lenfositleri cd45, CD11b, CD3, CD4, INF-g ve IL-17 ile analiz etmek için optimize edilmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Yöntem farelerde EAE aktif bir bağışıklama modeli neden MOG35-55 adjuvan Mycobacterium tuberculosis H37 Ra ve Pertussis Toksin Çalışma Solüsyonu (PTX) kullanır. Daha sonra CNS mononükleer hücrelerin izolasyonu için mekanik ayırma ve yoğunluk gradyan santrifüj yöntemleri kullanılır. Son olarak, bir optimize akış sitometri gating stratejisi birden fazla belirteçleri boyama tarafından beyinden T lenfositler ve alt kümeleri tanımlamak için kullanılır.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Temel Tıp Bilimleri Okulu, Şangay Jiao Tong Üniversitesi hayvan komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Ticari kaynaklardan liyofilize peptid elde etmek için MOG35-55'in MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK dizisini kullanın. Peptitin saflığının %gt;%95 olduğundan emin olun. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 10 mg/mL MOG stok çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
  2. M. tüberküloz H37 Ra'nın 4 mg/mL stok çözeltisini, Tam Freund'un Adjuvan (CFA) 25 mL'ine 100 mg m. tüberküloz H37 Ra tüpü koyarak hazırlayın ve karıştırın. Stok çözeltisini -20 °C'de saklayın.
  3. 50 mL PBS'ye 50 μg PTX ekleyerek 1 ng/μL Pertussis Toxin Çalışma Solüsyonu (PTX) hazırlayın. Çalışma çözeltisini -20 °C'de saklayın.
  4. Tüm antikorları (yani FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A ve APC anti-mouse IFN-γ) 4 °C'de saklayın.
  5. 500 mL PBS içine 2 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ve %1 fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek Akış Sitometri Boyama (FCS) Tamponu yapın.

2. C57BL/6 farelerinin gövdesi

  1. 8-12 haftalık kendişi C57BL/6 farelerini kullanın.
  2. Acclimate C57BL/6J fareler enjeksiyondan en az 7 gün önce.
  3. Ev fareleri, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsünde sabit sıcaklık ve nemde patojensiz koşullar altında bir hayvan tesisinde bulunan farelere ve su ve standart pelet gıdalarına ücretsiz erişim sağlar.

3. C57BL/6 fare bağışıklama

  1. Tam rehidrasyon sağlamak için oda sıcaklığında (RT) 15 dakika tüm stok çözümleri bırakın.
  2. 3 mg/mL çalışma çözeltisi hazırlamak için 700 μL PBS ile 300 μL MOG-peptid stok çözeltisini seyreltin.
  3. M. tüberküloz H37 Ra stok çözeltisi 1 mL ve ayrı 10 mL şırınga içine MOG35-55 peptidler çalışma solüsyonu 1 mL koyun, sonra en az 10 dakika emülsifiye etmek için dört yönlü bir stop horoz kullanın. Enjeksiyondan önce tam emülsifikasyon sağlamak.
  4. %1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitonial enjeksiyon ile EAE zirvesinde fareleranestezi.
  5. 1 mL şırınga ile farelere her ikisi de boyuna yakın iki noktada 100 μL MOG 35-55/CFA emülsiyon (300 μg/200 μL) enjekte edin. Deri altı enjekte kontrol fareleri 200 μL PBS ile.
  6. Aynı gün (gün 0) ve 2. İntraperitoneally 200 μL PBS ile kontrol farelerenjekte.
  7. Bir ısınma pedi ile kendi kafese fareler aktarın.
  8. Tablo 111,13'tegösterilen nörolojik bulgular Table 1için enjeksiyondan sonra her gün tüm fareleri kör bir şekilde inceleyin ve derecelendirin. Eğer skorlar 4.
  9. Hastalık sırasında kilo değişikliklerini kaydedin. Bu EAE modelinde hastalık aktivitesi için değerli bir ek önlemdir11,13.
  10. Bireysel fareler için klinik işaretlerin ilk gününü ekleyin ve gruptaki fare sayısına bölün; sonuç başlangıcıdır. Tek tek fareler için maksimum EAE puanının ilk gününü ekleyin ve gruptaki fare sayısına bölün; sonuç zirvedir.

4. Beyinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı

  1. Son %100 çözeltiyi elde etmek için 15 mL konik tüpte PBS ile 9:1 oranında seyreltilmiş yoğunluk gradyan ortamı.
  2. %1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitonial enjeksiyonla EAE zirvesindeki fareleri anestezik ve 20 mL steril buz gibi PBS ile intrakardiyal perfüzyon. Bunu, 20 mL şırınga kullanarak kalbin sol ventrikülüne pbs enjekte ederek ve sağ atriyumu açarak bunu başarır.
  3. Kafatasını burundan boyuna kadar dikkatlice kesin, sonra kafatası kutusundan beyni 50 mL konik tüplerde 10 mL RPMI'ye çıkarın. Yapışık kırmızı kan hücrelerini temizlemek için iyice karıştırın. Daha sonra aspirasyon ile orta çıkarın ve RPMI 10 mL ekleyin.
  4. 100 mm çanak içinde beyin ve orta yerleştirin. Jiletle ince ince doğrayın.
  5. Çanaktan 6 mL'lik buz gibi 7 mL sinterlenmiş cam homogenizer temiz pipetle aktarın. Pipette büyük miktarda doku bırakmaktan kaçının. Küçük bir miktar kaçınılmazdır.
  6. Önce havaneli "gevşek" piston kullanarak beyin Grind, sonra süspansiyon homojen olana kadar "sıkı" piston kullanın, ve önceden iliştirilmiş 15 mL konik tüp içine dökün ve buz üzerinde tutmak.
  7. Tüm örnekler homojenize edildikten sonra, hacmi tahmin edin. RPMI ile ses seviyesini 7 mL'ye ayarlayın. Daha sonra soğutulmuş 15 mL konik santrifüj tüpüne 3 mL buz gibi %100 bazal bazal membran matrisyerleştirin ve son %30 yoğunluk gradyan ortamı nı sağlamak için beynin homojen 7 mL'sini ekleyin. Birkaç kez ters tarafından karıştırın. Girdap etmeyin.
  8. Keskin bir arayüz sağlamak için, RPMI'ye 3 mL pipetle 1 mL ve yavaş yavaş %70 altkat yoğunluk gradyan ortam ekleyin.
  9. Santrifüj 800 x g'de 4 °C'de sadece 20 dk. Ivmeyi 1'e, yavaşlamayı 0'a ayarlayın. Santrifüjden sonra, üst fazın hemen hemen tümünü aspire etmek, üstteki miyelini tamamen çıkarmaya dikkat etmektir (Şekil 1).
  10. Arayüzü yeni bir 15 santrifüj tüpe çıkarın. RPMI ile ses seviyesini 10 mL'ye ayarlayın.
  11. 10 dk için 500 x g santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant aspire. ~200 μL akış sitometri boyama (FSC) tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Peletler daha sonra FACS için leke hazırdır.

5. Beyinden tek hücrelerin akış sitometrik analizi

  1. Hücreleri saymak için bir hemositometre ve mikroskop kullanın. 10 μL'lik trypan mavisine 10 μL'lik hücreleri ekleyin, iyice karıştırın ve hücreleri saymak için bir hemositometreye 10 μL yerleştirin. Daha sonra ters mikroskop altında mikrolitre başına canlı hücre sayısını hesaplayın (örneğin, Olympus Ters mikroskop).
  2. Aliquot yaklaşık 2 x 106 RPMI hücrelerinin tek bir kuyu içine 96 kuyu plaka.
  3. Kuyulara 500x hücre stimülasyon kokteyli artı protein taşıma inhibitörleri ekleyin.
  4. Plakayı kuluçka makinesinde 37 °C'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Rt 5 dakika için 400 x g hücreleri santrifüj. Supernatant atın ve FCS Tampon 100 μL hücreleri yeniden askıya.
  6. Anti-mouse CD16/CD32 Fc blok (1:33) ile hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca öninkitleyerek nonspesifik Fc aracılı etkileşimleri engelleyin.
  7. Hücre yüzey ilerleçlerini yıkamadan lekeleyin. Anti-fare CD45.2 (01:200), anti-mouse CD11b (1:200), anti-mouse CD3 (1:200) ve anti-mouse CD4 (1:200) antikorları ekleyin.
    NOT: Pozitif ve negatif kapıları belirlemek için her renk için bir floresan eksi (FMO) ve bir iyotip kontrol antikor lekeli olmalıdır.
  8. Plakayı 4 °C'de veya buzüzerinde en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Işıktan koruyun.
  9. FCS Arabellek ekleyerek hücreleri yıkayın. Mikrotiter plakalar için 200 μL/iyi kullanın. Sentrifuge 400 x g 5 dk RT. Supernatant atın.
  10. Hücreleri düzeltmek için her kuyuya 200 μL hücre içi (IC) fiksasyon tamponu ekleyin. Hücrelerin çözeltide tamamen askıya alındığından emin olun.
  11. RT'de 30-60 dk inkübat.
  12. Numuneleri RT'de 400 x g'da 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın.
  13. Her kuyuya 200°L 1x permeabilizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri 400 x g'de RT'de 5 dakika santrifüj edin. Supernatant atın.
  14. Artık hacimdeki peleti yeniden askıya alın ve 1x permeabilizasyon tamponu ile hacmi yaklaşık 100°L'ye ayarlayın.
  15. Hücrelere hücre içi antijenlerin saptanması için fare içi IL-17A (1:200) ve fare karşıtı IFN-g (1:200) antikorları ekleyin.
  16. 4 °C'de en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Işıktan koruyun.
  17. Her kuyuya 100°L 1x permeabilizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri 400 x g'de RT'de 5 dakika santrifüj edin. Supernatant atın.
  18. 100 μL akış sitometri boyama tamponunda lekeli hücreleri yeniden askıya alın.
  19. Akış sitometrisi ile analiz edin.
    NOT: Akış sitometresindeki lazer ve kompanzasyon ayarları ayarlanır, numuneler sitometreye yerleştirilir ve tüm olaylar üreticinin önerilerine göre kaydedilir.

6. Veri analizi

  1. FSC-A vs FSC-H ve SSC-A vs SSC-H kullanarak kapı singlets.
  2. Canlı hücreleri boyuta göre FSC-A ve SSC-A kullanarak geçirin.
  3. Daha sonra, cd45+ CD11b - hücrelere gating tarafından, monositler- hariç, lökositler tanımlayın.
  4. Daha sonra CD3+CD4+ hücrelerine bakarak CD4 T lenfositlerini tanımlayın.
  5. Son olarak, IFN-γ+ hücreleri ve IL-17+ hücrelerini ayrı ayrı inceleyerek Th1 ve Th17 alt kümelerini tanımlayın ve izotip kontrolleri ve FMO kullanarak pozitif ve negatif popülasyonları belirleyin.

Sonuçlar

C57BL/6 farelerinin bağışıklaştırılmasından sonra tüm fareler nörolojik bulgular için tartıldı, incelendi ve günlük olarak derecelendi. EAE'nin temsili klinik seyri Şekil 2A'da sunulduğu gibi bir hastalık eğrisi ve Şekil 2B'desunulduğu gibi farede vücut ağırlığının değişmesiile sonuçlanmalıdır. MOG35-55 ile aşılanmış C57BL/6 fareler genellikle 10-12.Figure 2A Ağırlık değişimi EAE modelinde d...

Tartışmalar

Bu çalışma, MS. EAE'nin tipik bir nöroimmünolojik deneysel hayvan modeli olarak kabul edilen C57BL/6 farelerinde MOG35-55 kullanarak EAE'yi indüklemek ve izlemek için bir protokol sunmaktadır. Örneğin, SJL farelerde PLP139-151 peptid kullanarak özelliklerelaps15terapötik etkileri değerlendirmek için uygun bir nüks-remitting EAE hastalığı ders neden olabilir. Burada özetlenen deneysel prosedür diğer EAE protokollerine de uygulanabilir7. Bu modelde C57BL/...

Açıklamalar

Yazarların beyan etmek için çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibe (31570921 ZJ, 81571533 LS), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu ve Aile Planlaması (201540206 ZJ), Ruijin Hastanesi Kuzey araştırma hibe (2017ZX01 ZJ) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2eBioscience56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc blockBioLegend101302
APC anti-mouse IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce homogenizerWheaton353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer SeteBioscience88-8824-00
FITC anti-mouse CD3BioLegend100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)Sigma-AldrichF5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 RaDifco Laboratories231141
PE anti-mouse IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4BioLegend100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl AntibodyBioLegend400631
pertussis toxin (PTX)Sigma-AldrichP-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscienceeBioscience17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscienceeBioscience12-4321-80
Rat MOG35–55 peptidesBiosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

Referanslar

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 165multipl sklerozMSdeneysel otoimm n ensefalomiyelitEAEotoimm n hastal kmerkezi sinir sistemiCNST lenfositak sitometri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır