Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Resumen

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central (SNC) causada por la combinación de factores ambientales y antecedentes genéticos susceptibles. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad típico de la EME ampliamente utilizado para investigar la patogénesis en la que los linfocitos T específicos para los antígenos de mielina inician una reacción inflamatoria en el SNC. Es muy importante evaluar cómo los linfocitos en el SNC regulan el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, el enfoque para medir la cantidad y calidad de los linfocitos infiltrados en el SNC es muy limitado debido a las dificultades para aislar y detectar linfocitos infiltrados del cerebro. Este manuscrito presenta un protocolo para el cual es útil para el aislamiento, identificación y caracterización de linfocitos infiltrados del SNC y será útil para nuestra comprensión de cómo los linfocitos están involucrados en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Introducción

Como enfermedad desmielinizante crónica del SNC, la SME afecta a unos 2,5 millones de personas en todo el mundo y carece de tratamientos curativos¹. También se considera una enfermedad autoinmune, en la que los linfocitos T específicos del antígeno de mielina inician una reacción inflamatoria y conducen a la desmielinización y lesión axonal en el SNC^2. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) se ha utilizado ampliamente para investigar mecanismos patógenos de la EME como un modelo clásico de la enfermedad de desmielinización autoinmune en el SNC³. Hay dos maneras de inducir EAE: una es inducir EAE activamente inmunizando animales con componentes de mielina, otra es la transferencia adoptiva mediante la transferencia de células T encefalitgénicas al receptor^2,4,5. Las susceptibilidades a EAE son diferentes en diferentes cepas animales⁶. En ratones C57BL/6, el desafío de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) 35–55 induce una enfermedad monofásica con desmielinización e inflamación extensas en el SNC, que se utiliza con frecuencia en experimentos con ratones dirigidos a genes⁷.

La generación de células T reactivas específicas de mielina es necesaria para la aparición y el desarrollo de la enfermedad en EAE y es un signo inmunológico de EAE y MS. Los linfocitos T autoreactivos activados cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) hacia el SNC sano e inician la enfermedad de EAE. Cuando se encuentra MOG 35–55 Ag, estos linfocitos T inducen inflamación y el reclutamiento de células efectores en el SNC, lo que resulta en desmielinización y destrucción de axones^8,,9. En el modelo EAE, hay una amplia evidencia de que las células CD4⁺ T específicas de neuroantigen pueden iniciar y sostener la neuroinflamación y la patología^3,,10. Dependiendo de las principales citoquinas producidas, los linfocitos CD4⁺ T se han clasificado en diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado por la producción de interferón-γ), Th2 (caracterizado por la producción de interleucina 4), y Th17 (caracterizado por la producción de interleucina 17). Se cree que la activación de las células Th1 y Th17 contribuyen a la inducción, mantenimiento y regulación de la desmielinización inflamatoria en EAE y EM mediante el secretamiento de las citoquinas efectoras IFN-γ e IL-17, que son capaces de activar macrófagos y reclutar neutrófilos a los sitios inflamatorios para acelerar las lesiones¹¹.

Debido a que las células T autorreactivas cruzan el BBB hacia el SNC e inducen el desarrollo de la enfermedad en la EMA y eas, es muy importante analizar las células T en el SNC. Sin embargo, hay muy pocos protocolos establecidos para el aislamiento de linfocitos del SNC^12. Por lo tanto, se desarrolló un método optimizado para aislar células mononucleares del cerebro y analizar linfocitos T con marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para la citometría de flujo. El método utiliza la solución de trabajo Mycobacterium tuberculosis de toxinas de perersis (PTX) adyuvante MOG35–55 para inducir un modelo de inmunización activa de EAE en ratones. Luego, los métodos de separación mecánica y centrifugación de gradiente de densidad se utilizan para el aislamiento de células mononucleares del SNC. Por último, se utiliza una estrategia de medición de citometría de flujo optimizada para identificar linfocitos T y subconjuntos del cerebro mediante la tinción de múltiples marcadores.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el comité animal de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas, Shanghai Jiao Tong University.

1. Preparación de los materiales

1. Utilice la secuencia MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35–55 para obtener el péptido liofilizado de fuentes comerciales. Asegúrese de que la pureza del péptido es >95%. Preparar 10 mg/ml de solución en stock de MOG en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y almacenar a -20 oC.
2. Preparar una solución de 4 mg/ml en stock de M. tuberculosis H37 Ra poniendo un tubo de 100 mg de M. tuberculosis H37 Ra en 25 ml de adyuvante completo de Freund (CFA) y mezclando. Almacene la solución de stock a -20 oC.
3. Preparar 1 ng/L Solución de Trabajo de Toxinas (PTX) añadiendo 50 g de PTX en 50 mL de PBS. Almacene la solución de trabajo a -20 oC.
4. Almacene todos los anticuerpos (es decir, EL DR3 antiratón FITC, PE/Cy7 antiratón CD4, PerCP/Cy5.5 antiratón CD11b, Alexa Fluor700 antiratón CD45.2, PE antiratón IL-17A y APC antiratón IFN-γ) a 4 oC.
5. Haga que la Tinción de Citometría de Flujo (FCS) Tampón añadiendo 2 mM de ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA) y 1% de suero bovino fetal (FBS) en 500 mL de PBS.

2. Carcasa de ratones C57BL/6

1. Utilice ratones hembra C57BL/6 a las 8–12 semanas de edad.
2. Aclimate C57BL/6J ratones durante al menos 7 días antes de la inyección.
3. Ratones domésticos en una instalación animal bajo condiciones libres de patógenos a temperatura y humedad constantes en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y proporcionan acceso gratuito al agua y a los alimentos estándar para pellets.

3. Inmunización de ratones C57BL/6

1. Deje todas las soluciones de stock durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) para garantizar una rehidratación completa.
2. Diluir 300 ml de solución en stock de MOG-péptido con 700 l de PBS para preparar una solución de trabajo de 3 mg/ml.
3. Poner 1 ml de solución de M. tuberculosis H37 Ra y 1 ml de solución de trabajo de péptidos MOG35–55 en jeringas separadas de 10 ml, luego utilizar un grifo de tope de cuatro vías para emulsionar durante al menos 10 minutos. Asegurar la emulsión completa antes de la inyección.
4. Anestesia a los ratones en el pico de EAE con una inyección intraperitonial de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg).
5. Con una jeringa de 1 ml, inyectar por vía subcutánea a ratones con 100 l de una emulsión MOG 35–55/CFA (300 g/200 l) en dos sitios, ambos en la parte posterior cerca del cuello. Inyectar por vía subcutánea ratones de control con 200 l de PBS.
6. En el mismo día (día 0) y en el día 2 después de la inmunización (PI), inyectar por vía intraperitoneal a los ratones con 200 l de 1 ng/L de solución de trabajo PTX. Inyectar intraperitonealmente ratones de control con 200 ml de PBS.
7. Transfiera los ratones a la jaula de su casa con una almohadilla de calentamiento.
8. Examine y califique todos los ratones todos los días después de la inyección de forma cegada para los signos neurológicos que se muestran en la Tabla 1^11,13. Eutanasia a los animales si las puntuaciones son peores que el grado 4.
9. Registre los cambios de peso durante el curso de la enfermedad. Esta es una medida adicional valiosa para la actividad de la enfermedad en el modelo^{EAE 11,13}.
10. Añadir el primer día de signos clínicos para ratones individuales y dividir por el número de ratones en el grupo; el resultado es el inicio. Añadir el primer día de la puntuación máxima EAE para ratones individuales y dividir por el número de ratones en el grupo; el resultado es el pico.

4. Preparación de suspensión de una sola célula del cerebro

1. Diluir el medio de gradiente de densidad en relación 9:1 con PBS en un tubo cónico de 15 ml para producir una solución final del 100%.
2. Anestesia a los ratones en el pico de EAE con una inyección intraperitonial de 1% pentobarbital sódico (50 mg/kg) y perfunde intracardialmente con 20 ml de PBS estéril helado. Para lograrlo, inyecte lenta y constantemente PBS en el ventrículo izquierdo del corazón con una jeringa de 20 ml y abriendo la aurícula derecha.
3. Cortar el cráneo cuidadosamente de la nariz al cuello, luego quitar el cerebro de la caja craneal en 10 ml de RPMI en tubos cónicos de 50 ml. Mezclar bien para eliminar los glóbulos rojos adherentes. A continuación, retire el medio por aspiración y añada 10 ml de RPMI.
4. Coloque el cerebro y el medio en un plato de 100 mm. Pica finamente con una cuchilla de afeitar.
5. Transfiera 6 ml del plato a un homogeneizador de vidrio sinterado de 7 ml helado con una pipeta limpia. Evite dejar grandes cantidades de tejido en la pipeta. Una pequeña cantidad es inevitable.
6. Moler el cerebro usando el émbolo "flojo" del pestle primero, luego utilizar el émbolo "apretado" hasta que la suspensión sea homogénea, y verter en un tubo cónico prechilled 15 mL y mantener en hielo.
7. Después de homogeneizar todas las muestras, estime el volumen. Ajuste el volumen con RPMI a 7 mL. A continuación, coloque 3 ml de matriz de membrana sótano 100% helada en un tubo de centrífuga cónica refrigerado de 15 ml y agregue 7 ml de homogeneidad cerebral para producir un medio de gradiente de densidad final del 30%. Mezclar por inversión un par de veces. No vórtice.
8. Para asegurar una interfaz nítida, agregue cuidadosamente y lentamente 1 ml de 70% de medio de gradiente de densidad subyacente en RPMI con una pipeta de 3 ml.
9. Centrifugar a 800 x g durante sólo 20 min a 4oC. Establezca la aceleración en 1 y la desaceleración en 0. Después de la centrifugación, aspirar casi toda la fase superior, teniendo cuidado de eliminar completamente la mielina en la parte superior (Figura 1).
10. Retire la interfaz en un nuevo tubo de 15 centrífugas. Ajuste el volumen a 10 ml con RPMI.
11. Centrífuga a 500 x g durante 10 min. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 200 l de tampón de tinción de citometría de flujo (FSC). Los pellets están listos para manchar para FACS.

5. Análisis citométrico de flujo de células individuales del cerebro

1. Utilice un hemocitociómetro y un microscopio para contar las células. Agregue 10 l de las células a 10 l de azul tripano, mezcle bien y coloque 10 l en un hemocitoómetro para contar las células. A continuación, calcule el número de células vivas por microlitro bajo un microscopio invertido (por ejemplo, microscopio invertido Olympus).
2. Aliquot aproximadamente 2 x 10⁶ de células en RPMI en un solo pozo de una placa de 96 pozos.
3. Añadir 500x cóctel de estimulación celular más inhibidores de transporte de proteínas a los pozos.
4. Incubar la placa en la incubadora a 37oC durante 4 h.
5. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 100 l de búfer FCS.
6. Preincucha las células con bloque antiratón CD16/CD32 Fc (1:33) durante 10 min a 4 oC antes de manchar para bloquear interacciones mediadas por Fc inespecíficos.
7. Manche los marcadores de la superficie celular sin lavarse. Agregue CD45.2 antiratón (1:200), CD11b antiratón (1:200), CD3 antiratón (1:200) y anticuerpos CD4 antiratón (1:200).
   NOTA: Para determinar las puertas positivas y negativas, se debe teñir una fluorescencia menos una (FMO) para cada color y un anticuerpo de control de isotipo.
8. Incubar la placa durante al menos 30 minutos a 4oC o sobre hielo. Proteger de la luz.
9. Lave las células agregando el búfer FCS. Utilice 200 l/pozo para placas de microtíter. Centrifugar a 400 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.
10. Agregue 200 l de búfer de fijación intracelular (IC) a cada pocóver para fijar las celdas. Asegúrese de que las células estén completamente resuspendidas en la solución.
11. Incubar 30–60 min en RT. Proteger de la luz.
12. Centrifugar las muestras a 400 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
13. Añadir 200 l de 1x tamplización de permeabilización a cada pocóter y centrifugar las muestras a 400 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
14. Resuspender el pellet en volumen residual y ajustar el volumen a aproximadamente 100 l con 1x tampabilización.
15. Agregue anticuerpos antiratón IL-17A (1:200) y antiratón IFN-g (1:200) para la detección de antígenos intracelulares a las células.
16. Incubar durante al menos 30 min a 4oC. Proteger de la luz.
17. Añadir 100 l de 1x tamplización de permeabilización a cada pocóter y centrifugar las muestras a 400 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
18. Resuspender las células manchadas en 100 l de tampón de tinción de citometría de flujo.
19. Analizar por citometría de flujo.
    NOTA: Los ajustes de láser y compensación en el citómetro de flujo se ajustan, las muestras se colocan en el citómetro y todos los eventos se registran según las recomendaciones del fabricante.

6. Análisis de datos

1. Singlets de puerta que utilizan FSC-A frente a FSC-H y SSC-A frente a SSC-H.
2. Puerta de celdas vivas utilizando FSC-A y SSC-A en función del tamaño.
3. A continuación, identifique los leucocitos, excluyendo los monocitos, mediante el gating en CD45⁺ CD11b^- células.
4. A continuación, identifique los linfocitos CD4 T mediante el gating en células CD3+CD4+.
5. Por último, identifique los subconjuntos Th1 y Th17 mediante el gating en celdas IFN-γ+ y células IL-17+ por separado, y determine las poblaciones positivas y negativas utilizando controles de isotipo y FMO.

Resultados

Después de la inmunización de ratones C57BL/6, todos los ratones fueron pesados, examinados y clasificados diariamente en busca de signos neurológicos. El curso clínico representativo de EAE debe dar lugar a una curva de la enfermedad como se presenta en la Figura 2A y un cambio de peso corporal en el ratón como se presenta en la Figura 2B. Los ratones C57BL/6 inmunizados con MOG35-55 generalmente comenzaron a desarrollar síntomas de la enfermedad alrededo...

Discusión

Este estudio presenta un protocolo para inducir y monitorear EAE utilizando MOG35-55 en ratones C57BL/6, que se consideran un modelo animal experimental neuroinmunológico típico de MS. EAE se puede inducir variando las cepas de ratones o el tipo de proteína utilizada para la inducción de acuerdo con el propósito del estudio. Por ejemplo, el uso de péptido PLP139–151 en ratones SJL puede inducir un curso de enfermedad eaE recurrente-remitante que es especialmente adecuado para evaluar los efectos terapéuticos en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK