זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הנגרמת על ידי שילוב של גורמים סביבתיים ורקע גנטי רגיש. אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הוא מודל מחלה טיפוסי של טרשת נפוצה בשימוש נרחב לחקירת הפתוגנזה שבה לימפוציטים T ספציפי לאנטיגנים מיאלינים ליזום תגובה דלקתית ב- CNS. חשוב מאוד להעריך כיצד לימפוציטים במערכת העצבים תסדיר את התפתחות המחלה. עם זאת, הגישה למדידת הכמות והאיכות של לימפוציטים חדרו ב-CNS מוגבלת מאוד בשל הקשיים בבידוד ואיתור לימפוציטים חדרו מהמוח. כתב יד זה מציג פרוטוקול לכך שימושי לבידוד, זיהוי, ואפיון של לימפוציטים הסתננו ממערכת העצבים הצרפתית ויהיה מועיל להבנתנו כיצד לימפוציטים מעורבים בפיתוח המחלה האוטואימונית CNS.

Introduction

כמחלה demyelinating כרונית של CNS, טרשת נפוצה משפיעה על 2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם וחסר טיפולים^{מרפאים 1}. הוא נחשב גם מחלה אוטואימונית, שבה לימפוציטים T אנטיגן מימין ספציפיים ליזום תגובה דלקתית ולהוביל demyelination ופציעה סקסונית ב CNS². אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) שימשה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים פתוגנים של טרשת נפוצה כמודל קלאסי מחלת דמיאליציה אוטואימונית ב CNS³. ישנן שתי דרכים לגרום EAE: אחת היא לגרום EAE באופן פעיל על ידי חיסון בעלי חיים עם רכיבים מילין, אחר הוא העברה מאמצת על ידי העברת תאי T encephalitogenic לתוך^{קולטן 2,,4,,5}. הרגישות ל-EAE שונה בזני בעלי חיים^{שונים 6.} בעכברים C57BL/6, מיטלין אוליגודנדרוציט גליקופרוטין (MOG) 35-55 אתגר גורם למחלה monophasic עם demyelination נרחב ודלקת ב-CNS, אשר משמש לעתים קרובות בניסויים עם עכברים ממוקדים^{בגן 7}.

הדור של תאי T תגובתיים ספציפיים מילין נדרש להתרחשות ופיתוח של מחלה בEAE והוא סימן חיסוני של EAE ו טרשת נפוצה. לימפוציטים T אוטומטי פעיל לחצות את מחסום מוח הדם (BBB) לתוך CNS בריא ליזום מחלת EAE. כאשר MOG 35-55 Ag נתקל, לימפוציטים T אלה לגרום לדלקת וגיוס של תאי אפקט לתוך CNS, וכתוצאה מכך demyelination והרס axon^8,9. במודל EAE, יש ראיות רבות כי נוירואנטיגן ספציפי CD4⁺ T תאים יכולים ליזום ולקיים דלק עצבי ופתולוגיה^3,,10. בהתאם ציטוקינים העיקריים המיוצרים, CD4⁺ T לימפוציטים סווגו לתוך קבוצות משנה שונות: Th1 (מאופיין בייצור של אינטרפרון-γ), Th2 (מאופיין בייצור של interleukin 4), ו Th17 (מאופיין בייצור של interleukin 17). הוא האמין כי ההפעלה של תאי Th1 ו Th17 לתרום אינדוקציה, תחזוקה, ורגולציה של demyelination דלקתי ב EAE ו טרשת נפוצה על ידי הפרשת ציטוקינות effector IFN-γ ו IL-17, אשר מסוגלים להפעיל מקרופאגים וגיוס נויטרופילים לאתרים דלקתיים כדי להאיץ את^{הנגעים 11}.

בגלל תאי T תגובה אוטומטית לחצות את BBB לתוך CNS ול לגרום להתפתחות המחלה ב-MS ו- EAE, חשוב מאוד לנתח תאי T ב-CNS. עם זאת, יש מעט מאוד פרוטוקולים מבוססים לבידוד של לימפוציטים מ CNS¹². לכן, שיטה אופטימיזציה לבידוד תאים חד-נו-קוטריים מהמוח וניתוח לימפוציטים T עם סמנים CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g, ו IL-17 עבור ציתימטריית זרימה פותחה. השיטה משתמשת MOG35-55 adjuvant Mycobacterium שחפת H37 Ra ו פתרון עבודה רעלן Pertussis (PTX) כדי לגרום מודל חיסון פעיל של EAE בעכברים. לאחר מכן, שיטות צנטריפוגציה הדרגתית של הפרדה מכנית ושיפוע צפיפות משמשים לבידוד של תאים חד-נו-נו-קוטביים CNS. לבסוף, אסטרטגיה ממוטבת cytometry gating זרימה משמש כדי לזהות לימפוציטים T ותת קבוצות מהמוח על ידי הכתמת סמנים מרובים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת בעלי החיים של בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים, אוניברסיטת שנגחאי Jiao טונג.

1. הכנת החומרים

1. השתמש ברצף MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK של MOG35-55 כדי להשיג את הפפטיד lyophilized ממקורות מסחריים. ודא כי טוהר הפפטיד הוא >95%. הכן 10 מ"ג/מ"ל MOG פתרון מניות בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) ולאחסן ב -20 °C.
2. להכין פתרון מניות 4 מ"ג /מ"ל של M. שחפת H37 Ra על ידי הצבת אחד 100 מ"ג שפופרת של M. שחפת H37 Ra לתוך 25 מ"ל של Adjuvant של פרוינד שלם (CFA) ומערבוב. אחסן את פתרון המלאי ב- -20 °C.
3. להכין 1 ng/μL Pertussis רעלן פתרון עבודה (PTX) על ידי הוספת 50 μg של PTX לתוך 50 מ"ל של PBS. אחסן את פתרון העבודה ב- -20 °C.
4. אחסן את כל הנוגדנים (כלומר, FITC נגד עכבר CD3, PE/Cy7 נגד עכבר CD4, PerCP/Cy5.5 נגד עכבר CD11b, Alexa Fluor700 נגד עכבר CD45.2, PE נגד עכבר IL-17A ו- APC נגד עכבר IFN-γ) ב 4 °C.
5. להפוך את זרימת Cytometry כתמים (FCS) מאגר על ידי הוספת 2 mM אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) ו 1% סרום שור עוברי (FBS) לתוך 500 מ"ל של PBS.

2. דיור של C57BL /6 עכברים

1. השתמש בעכברים C57BL/6 נקבה בגיל 8-12 שבועות.
2. התאקלם C57BL/6J עכברים לפחות 7 ימים לפני הזריקה.
3. עכברי בית במתקן בעלי חיים בתנאים ללא פתוגן בטמפרטורה ולחות קבועות במחזור אור/כהה של 12 שעות ומספקים גישה חופשית למים ולמזון רגיל.

3. חיסון של עכברים C57BL/6

1. השאר את כל פתרונות המלאי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להבטיח התייבשות מלאה.
2. לדלל 300 μL של פתרון מניות MOG-פפטיד עם 700 μL של PBS להכנת 3 מ"ג / מ"ל פתרון עבודה.
3. לשים 1 מ"ל של M. שחפת H37 Ra פתרון מניות 1 מ"ל של MOG35-55 פפטידים עובד פתרון לתוך מזרקים נפרדים 10 מ"ל, ולאחר מכן להשתמש ב זין עצירה ארבעה דרך כדי לחקות לפחות 10 דקות. ודאו את ההתמהמה המלאה לפני ההזרקה.
4. עכברים מרדים בשיא ה-EA עם הזרקה תוך-אפרטיטונאלית של 1% נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג לק"ג).
5. עם מזרק 1 מ"ל, תת עורית להזריק עכברים עם 100 μL של MOG 35-55/ CFA אמולסיה (300 μg/200 μL) בשני אתרים, שניהם בחלק האחורי ליד הצוואר. תת עורית להזריק עכברי שליטה עם 200 μL של PBS.
6. באותו יום (יום 0) וביום 2 לאחר חיסון (PI), תוך-אפרטון להזריק עכברים עם 200 μL של 1 ng/μL PTX פתרון עבודה. תוך-פריטנלית להזריק עכברי שליטה עם 200 μL של PBS.
7. להעביר את העכברים לכלוב הבית שלהם עם משטח חימום.
8. לבחון ולדרג את כל העכברים כל יום לאחר הזריקה באופן עיוור עבור סימנים נוירולוגיים המוצגים בטבלה 111^11,13. להמתת החיות אם הציונים גרועים מכיתה ד'.
9. להקליט את שינויי המשקל במהלך קורס המחלה. זהו מדד נוסף בעל ערך לפעילות המחלה במודל EAE^11,13.
10. להוסיף את היום הראשון של סימנים קליניים עבור עכברים בודדים ולחלק על ידי מספר העכברים בקבוצה; התוצאה היא ההתחלה. הוסף את היום הראשון של הציון המרבי של EAE עבור עכברים בודדים וחלוק לפי מספר העכברים בקבוצה; התוצאה היא הפסגה.

4. הכנת השעיה חד-תאית מהמוח

1. תדלל את צפיפות מעבר הצבע בינוני ביחס של 9:1 עם PBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל כדי להניב פתרון סופי של 100%.
2. עכברים מרדים בשיא ה-EA עם הזרקה תוך-פרקתית של 1% נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג לק"ג) וטפטוף תוך-לב עם 20 מ"ל של PBS קר כקרח סטרילי. להשיג את זה על ידי לאט ובהתמדה הזרקת PBS לתוך החדר השמאלי של הלב באמצעות מזרק 20 מ"ל ופתיחת האטריום הימני.
3. חותכים את הגולגולת בזהירות מהאף לצוואר, ואז להסיר את המוח מתיבה גולגולת לתוך 10 מ"ל של RPMI בצינורות חסונים 50 מ"ל. מערבבים היטב כדי להסיר תאי דם אדומים דבקים. לאחר מכן להסיר את המדיום על ידי שאיפה ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI.
4. מניחים את המוח והבינוני בצלחת של 100 מ"מ. קוצצים דק עם סכין גילוח.
5. מעבירים 6 מ"ל מהצלחת להומוגניזר זכוכית קר כקרח של 7 מ"ל עם פיפטה נקייה. הימנע מהשארת כמויות גדולות של רקמות בפיפטה. כמות קטנה היא בלתי נמנעת.
6. לטחון את המוח באמצעות הבוכנה "רופף" של העלי הראשון, לאחר מכן להשתמש בוכנה "הדוק" עד המתלים הוא הומוגני, ולשפוך לתוך צינור 15 מ"ל חוטי מראש ולשמור על קרח.
7. לאחר שכל הדגימות הומוגניות, העריכו את עוצמת הקול. כוונן את עוצמת הקול עם RPMI ל- 7 מ"ל. לאחר מכן מניחים 3 מ"ל של קר כקרח 100% מטריצת קרום מרתף בצינור צנטריפוגה צנטריפוגה חונית 15 מ"ל ולהוסיף 7 מ"ל של המוח homogenate כדי להניב סופי 30% צפיפות צפיפות בינונית הדרגתית. מערבבים על ידי היפוך כמה פעמים. אל תמערבולת.
8. כדי להבטיח ממשק חד, בזהירות ולאט להוסיף 1 מ"ל של 70% שכבה בינונית הדרגתית ב- RPMI עם פיפטה 3 מ"ל.
9. צנטריפוגה ב-800 x g ל-20 דקות בלבד ב-4°C. g הגדר את ההאצה ל- 1 והאטה ל- 0. לאחר צנטריפוגה, לשאוף כמעט את כל השלב העליון, להיות זהיר להסיר לחלוטין את המילין בראש(איור 1).
10. הסר את הממשק לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15. כוונן את עוצמת הקול ל- 10 מ"ל באמצעות RPMI.
11. צנטריפוגה ב-500 x גרם ל-10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, לשאוף את supernatant. תחשוף מחדש את הכדור ב- כ- 200 μL של כתמים ציטומיטריה זרימה (FSC). הכדורים מוכנים להכתים עבור FACS.

5. זרימה ניתוח ציטומטרי של תאים בודדים מהמוח

1. השתמשו בהמוציטומטר ובמיקרוסקופ כדי לספור את התאים. להוסיף 10 μL של התאים 10 μL של טריפאן כחול, לערבב היטב, ולמקם 10 μL על hemocytometer לספור את התאים. לאחר מכן לחשב את מספר התאים החיים לכל מיקרוליטר תחת מיקרוסקופ הפוך (למשל, מיקרוסקופ הפוך אולימפוס).
2. Aliquot כ 2 x 10⁶ של תאים RPMI לתוך באר אחת של צלחת 96 באר.
3. להוסיף קוקטייל גירוי תא 500x בתוספת מעכבי הובלת חלבון לבארות.
4. דגירה את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
5. צנטריפוגה התאים ב 400 x g עבור 5 דקות ב RT. בטל את supernatant ולתוח מחדש את התאים ב 100 μL של מאגר FCS.
6. קדם לצנרר את התאים עם בלוק CD16/CD32 Fc נגד עכבר (1:33) במשך 10 דקות ב- 4 °C לפני הכתמה כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות בתיווך FC.
7. כתם סמנים פני השטח של התא ללא כביסה. הוסף CD45.2 נגד עכבר (1:200), CD11b נגד עכבר (1:200), CD3 נגד עכבר (1:200) ונוגדנים נגד עכבר CD4 (1:200).
   הערה: כדי לקבוע שערים חיוביים ושליליים, יש להכתים פלואורסץ מינוס אחד (FMO) עבור כל צבע ונוגדן בקרת איזוטיפ.
8. דגירה את הצלחת לפחות 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח. הגן מפני אור.
9. שטוף את התאים על-ידי הוספת מאגר FCS. השתמש 200 μL / גם עבור צלחות microtiter. צנטריפוגה ב- 400 x g עבור 5 דקות ב RT.
10. הוסף 200 μL של מאגר קיבעון תאי (IC) לכל באר כדי לתקן את התאים. ודא שהתאים יתווסתו מחדש במלואם בפתרון.
11. דגירה 30-60 דקות ב RT. הגן מפני אור.
12. צנטריפוגה הדגימות ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
13. הוסף 200 μL של 1 x permeabilization מאגר לכל באר צנטריפוגה את הדגימות ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
14. תוסתה מחדש את הכדורי בנפח שיורית והתאימה את עוצמת הקול ל-100 μL עם מאגר אחד של יציבות.
15. הוסף נוגדנים נגד עכבר IL-17A (1:200) ואנטי-עכבר IFN-g (1:200) לזיהוי אנטיגנים תאיים לתאים.
16. דגירה לפחות 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הגן מפני אור.
17. הוסף 100 μL של 1 x permeabilization מאגר לכל באר צנטריפוגה את הדגימות ב 400 x g ב RT במשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
18. תוסתה מחדש את התאים המוכתמים ב-100 μL של חוצץ הכתמים של ציתומיה זרימה.
19. נתח לפי ציתום זרימה.
    הערה: הגדרות הלייזר והפיצוי על ציטומטר הזרימה מותאמות, הדגימות ממוקמות על ציטוטומטר, וכל האירועים נרשמים בהתאם להמלצות היצרן.

6. ניתוח נתונים

1. סינגלים שער באמצעות FSC-A לעומת FSC-H ו SSC-A לעומת SSC-H.
2. גייט תאים חיים באמצעות FSC-A ו- SSC-A בהתבסס על גודל.
3. לאחר מכן, זהה את הלוקוציטים, לא כולל המונוציטים, על-ידי גתות ב- CD45⁺ CD11b^- תאים.
4. לאחר מכן, זהה את הלימפוציטים CD4 T על-ידי gating על CD3 + CD4+ תאים.
5. לבסוף, זהה את ערכות המשנה Th1 ו- Th17 על-ידי גתות בתאי IFN-γ+ ותאי IL-17+ בנפרד, ולקבוע את האוכלוסיות החיוביות והשליליות באמצעות פקדי איזוטיפ ו-FMO.

תוצאות

לאחר חיסון של עכברים C57BL/6, כל העכברים נשקלו, נבדקו, ותודרגו מדי יום עבור סימנים נוירולוגיים. הקורס הקליני המייצג של EAE צריך לגרום עקומת מחלה כפי שמוצג איור 2A ושינוי משקל הגוף בעכבר כפי שמוצג איור 2B. C57BL/6 עכברים מחוסנים עם MOG35-55 בדרך כלל התחיל לפתח תסמיני מחלה ס?...

Discussion

מחקר זה מציג פרוטוקול כדי לגרום ולפקח EAE באמצעות MOG35-55 בעכברים C57BL/6, אשר נחשבים מודל בעלי חיים ניסיוני נוירואימונולוגי טיפוסי של MS. EAE יכול להיות מושרה משתנה זנים עכברים או סוג של חלבון המשמש אינדוקציה על פי מטרת המחקר. לדוגמה, באמצעות PLP139-151 פפטיד בעכברים SJL יכול לגרום קורס מחלת EAE relapsing remitting ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK