Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Résumé

Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.

Résumé

La sclérose en plaques (SP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) causée par la combinaison de facteurs environnementaux et de milieux génétiques sensibles. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle typique de la maladie de MS largement utilisé pour étudier la pathogénie dans laquelle les lymphocytes T spécifiques aux antigènes de myéline initient une réaction inflammatoire dans le SNC. Il est très important d’évaluer comment les lymphocytes du SNC régulent le développement de la maladie. Cependant, l’approche pour mesurer la quantité et la qualité des lymphocytes infiltrés dans le SNC est très limitée en raison des difficultés à isoler et à détecter les lymphocytes infiltrés du cerveau. Ce manuscrit présente un protocole qui est utile pour l’isolement, l’identification, et la caractérisation des lymphocytes infiltrés du SNC et sera utile pour notre compréhension de la façon dont les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune du SNC.

Introduction

En tant que maladie de démyélinisation chronique du SNC, la SP touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde et manque de traitements curatifs¹. Il est également considéré comme une maladie auto-immune, dans laquelle les lymphocytes T spécifiques à l’antigène myélin initient une réaction inflammatoire et conduisent à la démyélinisation et aux lésions axonales dans le SNC². L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) a été largement utilisée pour étudier les mécanismes pathogènes de la SP comme modèle classique de maladie auto-immune de la maladie de démyélinisation dans le SNC³. Il existe deux façons d’induire EAE: l’une est d’induire EAE activement en immunisant les animaux avec des composants de myéline, un autre est le transfert d’adoption en transférant les lymphocytes T encéphalitogènes dans le récepteur^2,4,5. Les susceptibilités à l’EAE sont différentes dans différentes souches animales⁶. Chez les souris C57BL/6, le défi de la glycoprotéine de l’oligodendrocyte de myéline (MOG) 35–55 induit une maladie monophasique avec une démyélinisation et une inflammation étendues dans le SNC, qui est fréquemment utilisé dans des expériences avec des souris^géniquesciblées 7 .

La génération de lymphocytes T réactifs spécifiques à la myéline est nécessaire pour l’apparition et le développement de la maladie dans l’EAE et est un signe immunologique de l’EAE et de la SP. Les lymphocytes T autoréactifs activés traversent la barrière hémato-encéphalique (BBB) dans le SNC sain et initient la maladie d’EAE. Lorsque MOG 35–55 Ag est rencontré, ces lymphocytes T induisent l’inflammation et le recrutement de cellules effecteurs dans le SNC, ce qui entraîne la démyélinisation et la destruction de l’axone^8,9. Dans le modèle EAE, il existe de nombreuses preuves que les cellules CD4⁺ T spécifiques aux neuroantigènes peuvent initier et soutenir la neuroinflammation et la pathologie^3,10. Selon les principales cytokines produites, les lymphocytes CD4⁺ T ont été classés en différents sous-ensembles : Th1 (caractérisé par la production d’interféron-γ), Th2 (caractérisé par la production d’interleukine 4) et Th17 (caractérisé par la production d’interleukine 17). On croit que l’activation des cellules Th1 et Th17 contribuent à l’induction, l’entretien et la régulation de la démyélinisation inflammatoire dans EAE et sp en sécrétant les cytokines effecteurs IFN-γ et IL-17, qui sont capables d’activer les macrophages et de recruter des neutrophiles aux sites inflammatoires pour accélérer les lésions¹¹.

Étant donné que les lymphocytes T autoréactifs traversent le BBB dans le SNC et induisent le développement de maladies dans la SP et l’EAE, il est très important d’analyser les lymphocytes T dans le SNC. Cependant, il existe très peu de protocoles établis pour l’isolement des lymphocytes du SNC¹². Par conséquent, une méthode optimisée pour isoler les cellules mononucléaires du cerveau et analyser les lymphocytes T avec des marqueurs CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g et IL-17 pour la cytométrie de flux a été développée. La méthode utilise MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxine Working Solution (PTX) pour induire un modèle de vaccination active de l’EAE chez les souris. Ensuite, des méthodes mécaniques de centrifugation de gradient de séparation et de densité sont utilisées pour l’isolement des cellules mononucléaires du SNC. Enfin, une stratégie optimisée de gating de cytométrie de flux est employée pour identifier les lymphocytes T et les sous-ensembles du cerveau en tachant plusieurs marqueurs.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le comité animal de l’École des sciences médicales de base de l’Université Jiao Tong de Shanghai.

1. Préparation des matériaux

1. Utilisez la séquence MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35–55 pour obtenir le peptide lyophilisé de sources commerciales. Assurez-vous que la pureté du peptide est >95%. Préparer une solution de bouillon de MOG de 10 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à -20 °C.
2. Préparer une solution de stock de 4 mg/mL de M. tuberculosis H37 Ra en mettant un tube de 100 mg de M. tube H37 Ra dans 25 ml d’Adjuvant complet de Freund (CFA) et le mélange. Conserver la solution de stock à -20 °C.
3. Préparer 1 ng/μL Pertussis Toxine Solution de travail (PTX) en ajoutant 50 μg de PTX dans 50 mL de PBS. Conserver la solution de travail à -20 °C.
4. Stockez tous les anticorps (c.-à-d. CD3 anti-souris FITC, CD4 anti-souris PE/Cy7, CD11b anti-souris PerCP/Cy5.5, Alexa Fluor700 anti-souris CD45.2, PE anti-souris IL-17A et APC anti-souris IFN-γ) à 4 °C.
5. Faire le tampon de coloration de cytométrie de flux (FCS) en ajoutant 2 mM d’acide tétraacétique de diamine difamine (EDTA) et 1% de sérum bovin foetal (FBS) dans 500 mL de PBS.

2. Logement des souris C57BL/6

1. Utilisez des souris femelles C57BL/6 à l’âge de 8 à 12 semaines.
2. Acclimater les souris C57BL/6J pendant au moins 7 jours avant l’injection.
3. Loger des souris dans une installation animale dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à température et à humidité constantes dans un cycle clair/foncé de 12 h et offrir un accès gratuit à l’eau et aux granulés standard.

3. Vaccination des souris C57BL/6

1. Laissez toutes les solutions de stock pendant 15 min à température ambiante (RT) pour assurer une réhydratation complète.
2. Diluer 300 μL de solution de stock de peptides MOG avec 700 μL de PBS pour la préparation d’une solution de travail de 3 mg/mL.
3. Mettre 1 mL de M. tuberculosis H37 Ra solution de stock et 1 mL de peptides MOG35–55 solution de travail dans des seringues séparées de 10 mL, puis utiliser un coq d’arrêt à quatre voies pour émulsionner pendant au moins 10 min. Assurez-vous d’une émulsification complète avant l’injection.
4. Anesthétiser les souris au sommet de l’EAE avec une injection intrapéritoniale de 1% de pentobarbital de sodium (50 mg/kg).
5. À l’aide d’une seringue de 1 mL, injectez sous-cutanéement des souris avec 100 μL d’émulsion MOG 35–55/CFA (300 μg/200 μL) à deux sites, tous deux à l’arrière près du cou. Injecter sous-cutanéement des souris témoins avec 200 μL de PBS.
6. Le même jour (jour 0) et le jour 2 après la vaccination (PI), intraperitoneally injecter des souris avec 200 μL de 1 ng/μL PTX solution de travail. Intraperitoneally injectez des souris témoins avec 200 μL de PBS.
7. Transférer les souris dans leur cage avec un coussin chauffant.
8. Examiner et classer toutes les souris tous les jours après l’injection d’une manière aveuglée pour les signes neurologiques indiqués dans le tableau 1^11,13. Euthanasier les animaux si les scores sont pires que la 4e année.
9. Enregistrez les changements de poids pendant le cours de la maladie. Il s’agit d’une mesure supplémentaire précieuse pour l’activité de la maladie dans le modèle^{EAE 11,13}.
10. Ajouter le premier jour de signes cliniques pour les souris individuelles et diviser par le nombre de souris dans le groupe; le résultat est le début. Ajouter le premier jour du score d’EAE maximum pour les souris individuelles et diviser par le nombre de souris dans le groupe; le résultat est le pic.

4. Préparation de suspension à cellule unique du cerveau

1. Diluer le gradient de densité moyen en rapport 9:1 avec PBS dans un tube conique de 15 mL pour produire une solution finale de 100%.
2. Anesthétiser les souris au sommet de l’EAE avec une injection intrapéritoniale de 1% de pentobarbital de sodium (50 mg/kg) et perfuse intracardially avec 20 mL de PBS stérile de glace froide. Réalisez ceci en injectant lentement et régulièrement pbs dans le ventricule gauche du coeur utilisant une seringue de 20 mL et en ouvrant l’atrium droit.
3. Couper soigneusement le crâne du nez jusqu’au cou, puis retirer le cerveau de la boîte crânienne en 10 mL de RPMI dans des tubes coniques de 50 mL. Bien mélanger pour éliminer les globules rouges adhérents. Retirez ensuite le milieu par aspiration et ajoutez 10 mL de RPMI.
4. Placer le cerveau et le milieu dans un plat de 100 mm. Hacher finement à l’aide d’une lame de rasoir.
5. Transférer 6 mL du plat dans un homogénéisant en verre sinteré de 7 m L glacé avec une pipette propre. Évitez de laisser de grandes quantités de tissu dans la pipette. Une petite quantité est inévitable.
6. Broyer le cerveau à l’aide du piston « lâche » du pilon d’abord, puis utiliser le piston « serré » jusqu’à ce que la suspension soit homogène, et verser dans un tube conique de 15 m L préchillé et garder sur la glace.
7. Après que tous les échantillons sont homogénéisés, estimer le volume. Ajuster le volume avec RPMI à 7 mL. Placez ensuite 3 ml de matrice de membrane de 100% de sous-sol glacée dans un tube de centrifugeuse conique réfrigéré de 15 mL et ajoutez 7 ml de l’homogénéate de cerveau pour produire un dernier milieu de gradient de densité de 30%. Mélanger par inversion une couple de fois. Ne pas vortex.
8. Pour assurer une interface nette, ajoutez soigneusement et lentement 1 mL de 70% de gradient de densité de sous-couche moyenne en RPMI avec une pipette de 3 mL.
9. Centrifugeuse à 800 x g pour seulement 20 min à 4 °C. Réglez l’accélération à 1 et la décélération à 0. Après centrifugation, aspirate la quasi-totalité de la phase supérieure, en prenant soin d’enlever complètement la myéline en haut (Figure 1).
10. Retirez l’interface dans un nouveau tube de 15 centrifugeuses. Ajuster le volume à 10 mL avec RPMI.
11. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min. Après centrifugation, apirate le supernatant. Resuspendez le granulé dans ~200 μL de tampon de coloration de cytométrie de flux (FSC). Les granulés sont alors prêts à tacher pour facs.

5. Analyse cytométrique de flux des cellules uniques du cerveau

1. Utilisez un hémocytomètre et un microscope pour compter les cellules. Ajouter 10 μL des cellules à 10 μL de bleu trypan, bien mélanger et placer 10 μL sur un hémocytomètre pour compter les cellules. Calculez ensuite le nombre de cellules vivantes par microliter au microscope inversé (p. ex., microscope inversé Olympus).
2. Aliquot environ 2 x 10⁶ de cellules dans RPMI dans un seul puits d’une plaque de puits de 96.
3. Ajoutez un cocktail de stimulation cellulaire 500x ainsi que des inhibiteurs du transport des protéines aux puits.
4. Incuber la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 4 h.
5. Centrifugez les cellules à 400 x g pendant 5 min à RT. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans 100 μL de tampon FCS.
6. Préincuber les cellules avec un bloc CD16/CD32 Fc anti-souris (1:33) pendant 10 min à 4 °C avant de les tacher pour bloquer les interactions non spécifiques sous médiation fc.
7. Marqueurs de surface de cellules de tache sans lavage. Ajoutez des anticorps CD45.2 (1:200), des CD11b anti-souris (1:200), des anticorps CD3 anti-souris (1:200) et des anticorps CD4 anti-souris (1:200).
   REMARQUE : Pour déterminer les barrières positives et négatives, une fluorescence moins une (FMO) pour chaque couleur et un anticorps de contrôle de l’isotype doivent être tachés.
8. Incuber la plaque pendant au moins 30 min à 4 °C ou sur la glace. Protégez-vous de la lumière.
9. Lavez les cellules en ajoutant le tampon FCS. Utilisez 200 μL/bien pour les plaques de microtitre. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à RT. Jeter le supernatant.
10. Ajouter 200 μL de tampon de fixation intracellulaire (IC) à chaque puits pour fixer les cellules. Assurez-vous que les cellules sont entièrement resuspendées dans la solution.
11. Incuber 30–60 min à RT. Protégez-vous de la lumière.
12. Centrifugez les échantillons à 400 x g à RT pendant 5 min. Jetez le supernatant.
13. Ajouter 200 μL de tampon de perméabilisation de 1 x à chaque puits et centrifuger les échantillons à 400 x g à RT pendant 5 min. Jetez le supernatant.
14. Resuspendez le granulé en volume résiduel et ajustez le volume à environ 100 μL avec tampon de perméabilisation 1x.
15. Ajoutez des anticorps anti-souris IL-17A (1:200) et des anticorps anti-souris IFN-g (1:200) pour la détection des antigènes intracellulaires aux cellules.
16. Incuber pendant au moins 30 min à 4 °C. Protégez-vous de la lumière.
17. Ajouter 100 μL de tampon de perméabilisation de 1 x à chaque puits et centrifuger les échantillons à 400 x g à RT pendant 5 min. Jetez le supernatant.
18. Resuspendez les cellules tachées dans 100 μL de tampon de coloration de cytométrie de flux.
19. Analyser par cytométrie de flux.
    REMARQUE : Les réglages laser et de compensation du cytomètre d’écoulement sont ajustés, les échantillons sont placés sur le cytomètre et tous les événements sont enregistrés conformément aux recommandations du fabricant.

6. Analyse des données

1. Singlets de porte utilisant FSC-A vs FSC-H et SSC-A vs SSC-H.
2. Gate cellules vivantes utilisant FSC-A et SSC-A en fonction de la taille.
3. Ensuite, identifier les leucocytes, à l’exclusion des monocytes, en gating sur CD45⁺ CD11b^- cellules.
4. Ensuite, identifiez les lymphocytes CD4 T en gating sur les cellules CD3+CD4+.
5. Enfin, identifiez séparément les sous-ensembles Th1 et Th17 en gating sur les cellules IFN-γ+ et il-17+ séparément, et déterminez les populations positives et négatives à l’aide de contrôles isotypes et de FMO.

Résultats

Après la vaccination des souris C57BL/6, toutes les souris ont été pesées, examinées et classées quotidiennement pour des signes neurologiques. Le cours clinique représentatif de l’EEE devrait entraîner une courbe de la maladie telle qu’elle est présentée à la figure 2A et un changement de poids corporel chez la souris tel que présenté à la figure 2B. C57BL/6 souris immunisées avec MOG35-55 ont généralement commencé à développer des sympt...

Discussion

Cette étude présente un protocole pour induire et surveiller l’EAE à l’aide de MOG35-55 chez les souris C57BL/6, qui sont considérées comme un modèle animal expérimental neuroimmunologique typique de la SP. EAE peut être induit variant les souches de souris ou le type de protéine utilisé pour l’induction selon le but de l’étude. Par exemple, l’utilisation du peptide PLP139–151 chez les souris SJL peut induire un cours de la maladie eae qui est particulièrement bien adapté pour évaluer les effets...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2	eBioscience	56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block	BioLegend	101302
APC anti-mouse IFN-g	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
Dounce homogenizer	Wheaton	353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)	eBioscience	00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set	eBioscience	88-8824-00
FITC anti-mouse CD3	BioLegend	100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA)	Sigma-Aldrich	F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience	eBioscience	56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE anti-mouse IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400617
Percoll	GE	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400631
pertussis toxin (PTX)	Sigma-Aldrich	P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience	eBioscience	17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience	eBioscience	12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK