纳米材料和其他难物质藻类毒性试验的小型装置

摘要

我们使用使用 LED 垂直照明的装置，演示对困难物质（如彩色物质或纳米材料）的藻类毒性测试。

摘要

生态毒性数据是欧洲和国际法规（例如 REACH）对化学品进行上市前和上市后注册的要求。藻类毒性试验经常用于化学品的法规风险评估。为了实现高可靠性和可重复性，制定标准化准则至关重要。对于藻类毒性测试，指南要求参数条件稳定且统一，如pH值、温度、二氧化碳水平和光强度。纳米材料和其他所谓的困难物质会干扰光，导致结果变化很大，妨碍了其监管的接受。为了应对这些挑战，我们开发了LEVITATT（藻类毒性试验LED垂直照明表）。该设置利用下面的 LED 照明，实现均匀的光分布和温度控制，同时最大限度地减少样品内阴影。该设置优化了生物量定量的样本量，同时确保 CO₂ 的充分流入，以支持藻类的指数级增长。此外，可定制测试容器的材料，以最大限度地减少吸附和挥发。在测试彩色物质或颗粒悬浮液时，LED 灯的使用还允许增加光强，而无需额外产生热量。紧凑的设计和最小的设备要求增加了在广泛的实验室中实施 LEVITATT 的可能性。在符合标准化ISO和经合组织藻类毒性测试指南的同时，LEVITATT还显示出两种参考物质（3，5-5-Dicholorophenol和K₂Cr₂O_7）和三种纳米材料（ZnO、CeO₂和BaSO_4）的样品间变异性低于埃伦迈尔烧瓶和微蒂特板。

引言

藻类毒性试验是用于生成欧洲和国际法规（例如 REACH 1 和 TSCA（美国））对化学品上市前和上市后注册所需的生态毒性数据所需的^三种强制性测试之一。为此，国际组织（如ISO和经合组织）制定了标准化藻类测试准则。这些测试标准和准则在 pH、温度、二氧化碳水平和光强方面规定了理想的测试条件。然而，在藻类试验期间保持稳定的测试条件实际上是困难的，结果存在一系列化学物质和纳米材料（通常称为"困难物质"）的可重复性和可靠性^问题2。大多数现有的藻类毒性测试装置都位于孵化器内的轨道摇床上，其体积相对较大（100–250 mL）。这种设置限制了测试浓度和可复制的海藻培养和测试材料的数量。此外，这些设置很少具有均匀的光场，在大型烧瓶中还难以获得可靠的照明条件，部分原因是光强度在光传播得更远时呈指数级下降，部分由于烧瓶几何形状。替代设置包括塑料微刺激器³板，包含小样本量，不允许足够的采样量来测量 pH 值、额外的生物量测量、颜料提取或其他需要破坏性采样的分析。利用现有的纳米材料和形成彩色悬浮物的物质的藻类毒性测试的一个特别挑战是干扰或阻挡藻类细胞可用的光，通常被称为"阴影^"4，5。,5测试材料和/或测试材料与藻类细胞之间的相互作用可能发生小瓶内的阴影，或者由于小瓶相对于彼此和光源的定位，在小瓶之间可能发生阴影。

该方法基于阿伦斯伯格等人^提出的 小规模藻类毒性测试装置，允许按照经合组织201^7和ISO 8692^{8等标准进行测试}。该方法得到进一步优化，以解决上述限制:1） 利用 LED 光技术确保均匀的光条件，产生最少的热量;2） 在保持恒定 pH、CO 2 水平的同时，为化学/生物分析提供足够的样品量_;3） 允许使用多功能测试容器材料来测试挥发性物质或具有高吸附潜力的物质。

研究方案

1. 莱维特设置的描述

1. 使用20 mL闪烁玻璃瓶（图1，插入1），允许光线穿透。或者，可以使用轻的可塑胶瓶。使用光度计量化光强。
2. 在测试开始时至少使用 4 mL 测试悬浮液，以便对生物量进行定量，并在孵化期间和之后对纳米材料进行表征/定量（图 1，插入 2）。
3. 将 20 mL 闪烁小瓶与盖（图1，插入 3）配合，其中钻了一个小孔（直径约 1 mm），以便与大气交换_CO2。 这种交换对于确保测试期间稳定的pH和CO₂ 水平至关重要。
4. 对于挥发性物质，使用气密特氟龙涂层盖，允许使用注射器⁹或完全封闭的烧瓶对头部空间进行 CO₂富集，其中 CO₂由富集的碳酸氢钠 （NaHCO_3）缓冲液系统¹⁰在溶液中保持 CO 2 。
5. 用安装在外套管上的夹子固定小瓶（图1，插入4）。
6. 使用位于测试小瓶下方的 LED 光源（图 1，插入 5），提供"冷白"或"日光"类型的均匀荧光照明，以及 60×120 μE μ^m-2μs-1范围内的光照强度，在光合作用有效波长范围 400 nm 至 700 nm 中测量。该装置通过将光调光器安装到光源上，在 5~160 μEμ^m-2[s-1）范围内采用可调光强。^-1这允许在更高和更低的光强度下进行测试。
7. 将设置安装在轨道摇床上，以在整个测试期间搅拌样品。这保持细胞自由悬浮，并促进_CO2质量 从空气转移到水（图1，插入6）。
8. 将设置放在温度控制室或恒温柜中，以在整个测试过程中保持稳定的温度（图 1，插入 7）。

图1:藻类毒性试验LED垂直照明表图片（LEVITATT）。1） 20 mL 玻璃闪烁小瓶用于孵化，2） 4 mL 样品用于分析，3） 带钻孔的盖子用于 CO₂ 交换，4） 用于定义光条件的外壳，5） 位于外壳中心的 LED 光源，6） 用于实验期间搅拌的轨道摇床，以及 7） 恒温柜。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 准备藻类生长介质

1. ISO 8692 藻类生长介质由四种不同的库存解决方案组成。根据表1称量出适当量的盐，并在超纯 水中稀释。

库存解决方案	营养	库存溶液中的浓度	测试溶液中的浓度
1: 宏量营养素	NH4Cl	1.5 克/升	15毫克/升（N:3.9毫克/升）
	Mgcl2+6H2O	1.2 克/升	12毫克/升（毫克:2.9毫克/升）
	CaCl2+2H2O	1.8 克/升	18毫克/升（卡:4.9毫克/升）
	MgSO4+7H2O	1.5 克/升	15毫克/升（S:1.95毫克/升）
	Kh2PO4	0.16 克/升	1.6毫克/升（P:0，36毫克/升）
2: 费-埃塔	费克3+6H2O	64毫克/升	64 μg/L （费: 13 μg/L）
	Na2EDTA=2H2O	100毫克/升	100 μg/L
3: 微量元素	H3BO3a	185毫克/升	185 μg/L （B: 32 μg/L）
	MnCl2+4H2O	415毫克/升	415 μg/L （Mn: 115 μg/L）
	ZnCl2	3毫克/升	3 μg/L （Zn: 1.4 μg/L）
	CoCl2+6H2O	1.5毫克/升	1.5 μg/L （公司: 0.37 μg/L）
	CuCl2+2H2O	0.01毫克/升	0.01 μg/L （铜: 3.7 纳克/升）
	Na2MOO4+2H2O	7毫克/升	7 μg/L （摩尔: 2.8 μg/L）
4: 纳赫科3	纳赫科3	50 克/升	50毫克/升（C: 7.14毫克/升）

表1:藻类生长介质库存溶液中的养分浓度

注: H₃BO₃ 可以通过添加 0.1 M NaOH 溶解。测试金属时应去除EDTA，以避免与金属离子混为一格。通过膜过滤（平均孔径 0.2 μm）或高压灭菌（120°C，15分钟）对库存溶液进行灭菌。不要使用 2 和 4 的灭菌剂库存解决方案，但通过膜过滤进行消毒。将溶液存放在4°C的黑暗中。

2. 要生产1升藻类生长介质，将500 mL灭菌超纯水转移到1L灭菌体积瓶中，并加入10 mL的库存溶液1:微量营养剂，1 mL的库存溶液2:Fe-EDTA，1 mL的库存溶液3:微量元素，1mL的库存溶液4:NaHCO₃。
3. 用消毒的超纯水填充高达 1 L，塞下烧瓶，彻底摇动，使藻类生长介质均匀。
4. 在使用前，通过让溶液与空气接触过夜或用无菌过滤空气冒泡 30 分钟来平衡溶液。平衡后，如有必要，将 pH 调整为 pH 8.1 ± 0.2，使用 1 M HCl 或 1 M NaOH。

3. 设置藻类测试

注:图2显示了藻类试验程序的 流程图。

图2:藻类测试设置流程图。请单击此处查看此图的较大版本。

1. 按照步骤2，在藻类生长介质中，以所需的最高测试浓度准备试验化合物的库存溶液。如要制备库存溶液/悬浮液，请遵循经合组织201（可溶性化合物）或经合组织318（纳米材料）。
2. 测量库存溶液中的 pH 值。如果与藻类生长介质偏离多个单位，则使用 1 M HCl 或 1 M NaOH 将 pH 值调整为 8。
3. 在 25 mL 测试溶液中计算最终细胞浓度达到 1 x 10^{4 细胞} /mL 所需的中分量。
   注意: 幼崽应该来自使用 LEVITATT 设置生长的未污染指数级 生长的 Raphidocelis 子胶囊的文化。
4. 计算要添加到每个 25 mL 体积烧瓶中的库存溶液量，以获得所需的测试浓度。每个浓度之间的系数不应超过3.2。
5. 标记每个选定浓度的 25 mL 体积烧瓶，并标记另外 25 mL 体积烧瓶标记控制。
6. 将达到所需浓度所需的测试化合物的库存溶液量添加到 25 mL 体积烧瓶中。不要 向 控件添加库存溶液。
7. 将介质添加到每个 25 mL 体积烧瓶中，达到约 20 mL 的体积。
8. 将步骤 3.3 中计算的 inolum 体积添加到每个 25 mL 体积烧瓶中。将介质添加到每个 25 mL 体积烧瓶中，最终总体积为 25 mL。
9. 通过垂直转动烧瓶两次，止塞烧瓶并彻底混合。
10. 将 0.4 mL 从每个烧瓶转移到单独的螺帽小瓶中，并添加 1.6 mL 的丙酮（饱和与 MgCO_3）:每个测试浓度和控制一个样本。紧闭盖子，在室温下存放在黑暗中，直到荧光测量（第 4 节）。
11. 将每个测试溶液的 4 mL 移入 20 mL 闪烁小瓶（每次浓度 3 次复制，控制 5 次）。在闪烁小瓶上拧紧盖子。 请记住 ，盖子必须有一个钻孔（直径约 1 mm），以便进行 CO₂ 交换。
12. 24 小时、48 小时和 72 小时后，将每瓶 0.4 mL 移入螺帽小瓶中，并加入 1.6 mL 丙酮（饱和 MgCO₃）。紧闭盖子，在室温下存放在黑暗中，直到荧光测量（第 4 节）。
13. 在72小时取最后一个样本后，轻轻地将给定浓度的三个复制物汇集在一个小瓶中，并测量pH值。对所有浓度和控件重复。对于任何测量的样品，pH 值不应超过 1.5 个单位的初始 pH。
14. 按照您的机构规则和规定，将剩余的液体排放到废物容器中。

4. 分析藻类试验样品

1. 使用荧光分光光度计测量藻类生物量（此处表示为叶绿素A）。1 叶绿素 A 的峰值发射量为 420 nm，用于激发波长，671 nm 表示发射波长。
2. 测量每个样品的荧光三次，并计算每个样品的平均值。
3. 使用方程 1 计算增长率。测量荧光（相对单位）可直接用作方程1中的生物量参数。
   方程 1: μ = （ln N_t = ln N₀） / t
   其中μ是增长率^{（d-1），N}₀是初始生物量，N_t是时间t时的生物量，t是测试周期（d）的长度。请注意，N₀和 N_t应以同一单位表示。
4. 使用统计软件将非线性回归曲线（例如，日志逻辑或 Weibull 函数）拟合到增长率数据中，以获得 10%、20% 和 50% 抑制的有效浓度值。在补充信息中，提供了使用DRC包¹¹ 在统计软件R中拟合的代码示例。

结果

对参考物质进行初始测试，以确定藻类菌株的敏感性。经常用于R. 亚卡皮塔的参考物质是二氯酸钾和 3，5-二氯酚^7，,8。图 3 和表 2显示了藻类测试的代表性结果，包括曲线拟合和统计输出，当 DRC 包装在 R 中应用于增长率时。

讨论

浮游植物将太阳能和二氧化碳转化为有机物，因此在水生生态系统中起着关键作用。因此，藻类生长率抑制试验是化学品监管风险评估所需的三项强制性水生毒性试验之一。在这方面，进行可靠和可重复的藻类毒性测试的能力是关键。使用 Erlenmeyer 烧瓶的测试设置引入了一系列变化和不便，如简介 中所述。为了规避这个问题，已经提出了微刺激^板3。虽然微刺激板最大限度地减?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086