Uma configuração em pequena escala para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e outras substâncias difíceis

Resumo

Demonstramos testes de toxicidade de algas para substâncias difíceis (por exemplo, substâncias coloridas ou nanomateriais) usando uma configuração iluminada verticalmente com um LED.

Resumo

Os dados de ecotoxicidade são um requisito para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH). O teste de toxicidade de algas é frequentemente utilizado na avaliação de risco regulatório de produtos químicos. Para alcançar alta confiabilidade e reprodutibilidade, o desenvolvimento de diretrizes padronizadas é vital. Para testes de toxicidade alga, as diretrizes requerem condições estáveis e uniformes de parâmetros como pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. Nanomateriais e outras substâncias chamadas difíceis podem interferir com a luz causando uma grande variação nos resultados obtidos dificultando sua aceitação regulatória. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos o LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). A configuração utiliza a iluminação LED de baixo permitindo uma distribuição de luz homogênea e controle de temperatura, minimizando também o sombreamento intra-amostra. A configuração otimiza o volume amostral para quantificação de biomassa e, ao mesmo tempo, garante um influxo suficiente de CO₂ para suportar o crescimento exponencial das algas. Além disso, o material dos recipientes de teste pode ser adaptado para minimizar a adsorção e a volatilização. Ao testar substâncias coloridas ou suspensões de partículas, o uso de luzes LED também permite aumentar a intensidade da luz sem geração adicional de calor. O design compacto e os requisitos mínimos de equipamentos aumentam as possibilidades de implementação do LEVITATT em uma ampla gama de laboratórios. Embora em conformidade com as diretrizes padronizadas do ISO e da OCDE para testes de toxicidade alga, a LEVITATT também mostrou uma menor variabilidade inter-amostra para duas substâncias de referência (3,5-Dicholorofenol e K₂Cr₂O₇) e três nanomateriais (ZnO, CeO₂e BaSO₄) em comparação com frascos erlen e placas de microtídeos.

Introdução

O teste de toxicidade de algas é um dos três únicos testes obrigatórios utilizados para gerar os dados de ecotoxicidade necessários para o registro pré e pós-mercado de produtos químicos por regulamentos europeus e internacionais (por exemplo, REACH¹ e TSCA (EUA)." Para isso, foram desenvolvidas diretrizes padronizadas de testes de algas por organismos internacionais (por exemplo, ISO e OCDE). Estes padrões e diretrizes de teste prescrevem condições ideais de teste em termos de pH, temperatura, níveis de dióxido de carbono e intensidade de luz. No entanto, manter condições estáveis de teste durante os testes de algas é na prática difícil e os resultados sofrem de problemas com reprodutibilidade e confiabilidade para uma gama de substâncias químicas e nanomateriais (muitas vezes chamados de "substâncias difíceis")². A maioria das configurações de teste de toxicidade de algas existentes operam com volumes relativamente grandes (100-250 mL) situados em um agitador orbital dentro de uma incubadora. Tal configuração limita o número de concentrações de teste e replica volumes alcançáveis e altos de cultura alga e material de teste. Além disso, essas configurações raramente têm um campo de luz uniforme e condições de iluminação confiáveis são ainda mais difíceis de obter em frascos grandes, em parte à medida que a intensidade da luz diminui exponencialmente quanto mais a luz viaja e em parte devido à geometria do frasco. As configurações alternativas compreendem microtiter plástico³ placas contendo pequenos volumes de amostra que não permitem volumes de amostragem adequados para medir pH, medições adicionais de biomassa, extração de pigmento ou outras análises que requerem amostragem destrutiva. Um desafio particular usando as configurações existentes para testes de toxicidade de algas de nanomateriais e substâncias que formam suspensões coloridas é a interferência ou bloqueio da luz disponível para as células algas, muitas vezes referidas como "sombreamento"^4,,5. O sombreamento pode ocorrer dentro de frascos pelo material de teste e/ou interações entre o material de teste e as células algas, ou sombreamento pode ocorrer entre frascos, devido ao seu posicionamento em relação uns aos outros e à fonte de luz.

O método baseia-se na configuração do teste de toxicidade de algas em pequena escala introduzida por Arensberg et al.⁶ que permite testar em conformidade com normas como a OCDE 201⁷e ISO 8692⁸. O método é ainda otimizado para atender às limitações acima indicadas por: 1) utilizando a tecnologia de luz LED para garantir condições uniformes de luz com geração mínima de calor, 2) fornecendo volume amostral adequado para análise química/biológica, mantendo pH constante, níveis de CO₂ e 3) permitindo o uso de material de recipiente de teste versátil para testes de substâncias voláteis ou substâncias com alto potencial de sorção.

Protocolo

1. Descrição da configuração LEVITATT

1. Use frascos de vidro cintilante de 20 mL(Figura 1, insira 1) permitindo penetração de luz. Alternativamente, podem ser usados frascos de plástico penetráveis leves. Quantifique a intensidade da luz usando um fotômetro.
2. Use pelo menos uma suspensão de teste de 4 mL no início do teste para permitir a quantificação da biomassa e para caracterização/quantificação de nanomateriais durante e após a incubação(Figura 1, inserir 2).
3. Encaixe os frascos de cintilação de 20 mL com uma tampa(Figura 1, insira 3) onde um pequeno orifício é perfurado (aproximadamente 1 mm de diâmetro) para permitir a troca de CO₂ com a atmosfera. Esta troca é crucial para garantir níveis estáveis de pH e CO₂ durante os testes.
4. Para substâncias voláteis, use uma tampa revestida de Teflon a ar para permitir o enriquecimento de CO₂ do espaço para a cabeça usando uma seringa⁹ ou frascos completamente fechados sem fase de gás em que o CO₂ é mantido em solução por um sistema tampão de sódio enriquecido (NaHCO₃)^{sistema tampão 10}.
5. Aperte os frascos com grampos montados na carcaça externa(Figura 1, insira 4).
6. Use uma fonte de luz LED localizada abaixo dos frascos de teste(Figura 1, insira 5) fornecendo uma iluminação fluorescente uniforme do tipo "branco-frio" ou "luz do dia" e uma intensidade de luz na faixa de 60-120 μE∙m^-2∙s^-1 medida na faixa de comprimento de onda fotointtheticamente eficaz de 400 nm a 700 nm. A configuração emprega intensidade de luz ajustável na faixa de 5-160 μE∙m^-2∙s^-1, encaixando um dimmer leve na fonte. Isso permite testar em intensidades de luz mais altas e mais baixas.
7. Monte a configuração em um agitador orbital para agitar amostras durante toda a duração do teste. Isso mantém as células em suspensão livre e facilita a transferência de massa de CO₂ do ar para a água (Figura 1, insira 6).
8. Coloque a configuração em uma sala controlada pela temperatura ou em um armário termostático para manter temperaturas estáveis durante os testes (Figura 1, insira 7).

Figura 1: Imagem da tabela de iluminação vertical led para testes de toxicidade de algas (LEVITATT). 1) Frascos de cintilação de vidro de 20 mL para incubação, 2) amostra de 4 mL para análise, 3) tampa com orifício perfurado para troca de CO_2, 4) invólucro para condições de luz definidas, 5) fonte de luz LED localizada no centro do invólucro, 6) shaker orbital para agitação durante o experimento e 7) um armário termostático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação do meio de crescimento de algas

1. O meio de crescimento de algas ISO 8692 consiste em quatro soluções de estoque diferentes. Pesar a quantidade apropriada de sais e diluir em água ultrauso de acordo com a Tabela 1.

Soluções de estoque	Nutrientes	Concentração na solução de estoque	Concentração na solução de teste
1: Macronutrientes	NH4Cl	1,5 g/L	15 mg/L (N: 3,9 mg/L)
	MgCl2∙6H2O	1,2 g/L	12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)
	CaCl2∙2H2O	1,8 g/L	18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)
	MgSO4∙7H2O	1,5 g/L	15 mg/L (S: 1,95 mg/L)
	KH2PO4	0,16 g/L	1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA	FeCl3∙6H2O	64 mg/L	64 μg/L (Fe: 13 μg/L)
	Na2EDTA∙2H2O	100 mg/L	100 μg/L
3: Traços	H3BO3a	185 mg/L	185 μg/L (B: 32 μg/L)
	MnCl2∙4H2O	415 mg/L	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ZnCl2	3 mg/L	3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L)
	CoCl2∙6H2O	1,5 mg/L	1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L)
	CuCl2∙2H2O	0,01 mg/L	0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L)
	Na2MoO4∙2H2O	7 mg/L	7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L)
4: NaHCO3	NaHCO3	50 g/L	50 mg/L (C: 7,14 mg/L)

Tabela 1: Concentrações de nutrientes em soluções de estoque para meio de crescimento de algas

NOTA: H₃BO₃ pode ser dissolvido adicionando 0,1 M NaOH. O EDTA deve ser removido ao testar metais, para evitar a complexação com íons metálicos. Esterilizar as soluções de estoque por filtração de membrana (diâmetro médio de poros 0,2 μm) ou por autoclaving (120 °C, 15 min). Não faça soluções de estoque autoclave 2 e 4, mas esterilize-as por filtragem de membrana. Armazene as soluções no escuro a 4 °C.

2. Para produzir 1 L de meio de crescimento algal, transfira 500 mL de água ultrapura esterilizada em um frasco volutrico esterilizado de 1 L e adicione 10 mL de solução de estoque 1: Macronutrientes, 1 mL de solução de estoque 2: Fe-EDTA, 1 mL de solução de estoque 3: Elementos de rastreamento, e 1 mL de solução de estoque 4: NaHCO₃.
3. Encha até 1 L com água ultrauso esterilizada, roa o frasco e agite bem para homogeneizar o meio de crescimento de algas.
4. Equilibre a solução antes de usá-la deixando-a durante a noite em contato com o ar ou borbulhando com ar estéril e filtrado por 30 minutos. Após o equilíbrio, ajuste o pH, se necessário, para pH 8,1 ± 0,2, com 1 M HCl ou 1 M NaOH.

3. Configuração do teste de algas

NOTA: Um diagrama de fluxo do procedimento de teste de algas é mostrado na Figura 2.

Figura 2: Diagrama de fluxo da configuração do teste de algas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Prepare uma solução de estoque do composto de ensaio na maior concentração de teste desejada no meio de crescimento de algas preparada de acordo com a etapa 2. Para a preparação de soluções/suspensões de estoque, siga a OCDE 201 (para compostos solúveis) ou a OCDE 318 (para nanomateriais).
2. Meça o pH na solução de estoque. Se ele desviar mais de uma unidade do meio de crescimento de algas, ajuste o pH para 8 com 1 M HCl ou 1 M NaOH.
3. Calcule o volume de inóculo necessário para atingir uma concentração celular final de 1 x 10⁴ células/mL em uma solução de teste de 25 mL.
   NOTA: O inóculo deve vir de uma cultura de subcapitata Raphidocelis de crescimento exponencial não contaminado cultivada usando a configuração LEVITATT.
4. Calcule a quantidade de solução de estoque para adicionar a cada frasco volumoso de 25 mL para obter as concentrações desejadas do teste. O fator entre cada concentração não deve exceder 3,2.
5. Marque um frasco volumoso de 25 mL para cada concentração escolhida e um controle de frasco volumoso adicional de 25 mL.
6. Adicione a quantidade de solução de estoque do composto de teste necessária para alcançar as concentrações desejadas ao frasco volumoso de 25 mL. Não adicione a solução de estoque ao controle.
7. Adicione o frasco volumoso médio de 25 mL para atingir um volume de aproximadamente 20 mL.
8. Adicione o volume de inóculo calculado na etapa 3.3 a cada frasco volumoso de 25 mL. Adicione o frasco volumoso médio a cada 25 mL de volumer para um volume total final de 25 mL.
9. Roa os frascos e misture bem girando os frascos duas vezes verticalmente.
10. Transfira 0,4 mL de cada frasco em frascos individuais de tampa de parafuso e adicione 1,6 mL de acetona (saturado com MgCO₃): uma amostra para cada concentração de teste e o controle. Feche bem as tampas e armazene no escuro à temperatura ambiente até medições de fluorescência (seção 4).
11. Pipet 4 mL de cada solução de teste em frascos de cintilação de 20 mL (3 réplicas por concentração e 5 réplicas para o controle). Enrosque as tampas dos frascos de cintilação. Lembre-se que as tampas devem ter um orifício perfurado (aproximadamente 1 mm de diâmetro) para permitir a troca de CO_2.
12. Após 24h, 48h e 72h, pipet 0,4 mL de cada frasco em frascos de tampa de parafuso e adicionar 1,6 mL de acetona (saturado com MgCO₃). Feche bem as tampas e armazene no escuro à temperatura ambiente até medições de fluorescência (seção 4).
13. Após a última amostra ser colhida a 72 h, acumule suavemente as três réplicas para uma dada concentração em um frasco e meça o pH. Repita para todas as concentrações e o controle. O pH não deve desviar mais de 1,5 unidades do pH inicial para qualquer uma das amostras medidas.
14. Descarrete os líquidos restantes em um recipiente de resíduos seguindo suas regras e regulamentos institucionais.

4. Analisando amostras de teste de algas

1. Use um espectrofotômetro de fluorescência para medir a biomassa alga (aqui expressa como clorofila A). O pico de emissão de clorofila A é de 420 nm para o comprimento de onda de excitação e 671 nm para o comprimento de onda de emissão.
2. Meça a fluorescência de cada amostra individual três vezes e calcule o valor médio de cada amostra.
3. Use a equação 1 para calcular a taxa de crescimento. A fluorescência medida (unidades relativas) pode ser usada diretamente como parâmetro de biomassa na equação 1.
   Equação 1: μ = (ln N_t – ln N₀) / t
   onde μ é a taxa de crescimento (d^-1), N₀ é a biomassa inicial, N_t é a biomassa no momento t, e t é a duração do período de teste (d). Nota, N₀ e N_t devem ser expressos na mesma unidade.
4. Use um software estatístico para encaixar uma curva de regressão não linear (por exemplo, uma função log-logistic ou Weibull) aos dados da taxa de crescimento para obter valores efetivos de concentração em 10%, 20% e 50% de inibição. Nas informações complementares é dado um exemplo de código para a montagem no software estatístico R utilizando o pacote RDC^11.

Resultados

Um teste inicial com uma substância de referência é realizado para determinar a sensibilidade da cepa de algas. As substâncias de referência regularmente utilizadas para R. subcapitata são dicromato de potássio e 3,5-Diclorfenol^7,8. A Figura 3 e a Tabela 2 mostram um resultado representativo de um teste de algas, incluindo encaixe de curva e saídas estatísticas quando o pacote RDC em R é aplicado ?...

Discussão

O fitoplâncton converte energia solar e dióxido de carbono em matéria orgânica e, portanto, tem um papel fundamental no ecossistema aquático. Por essa razão, os testes de inibição da taxa de crescimento de algas são incluídos como um dos três testes de toxicidade aquática obrigatórios necessários para a avaliação de risco regulatório de produtos químicos. A capacidade de realizar um teste de toxicidade algas confiável e reprodutível é fundamental nesse sentido. As configurações de teste usando fras...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086