나노 물질 및 기타 어려운 물질의 조류 독성 테스트를위한 소규모 설정

요약

우리는 LED로 수직으로 조명 된 설정을 사용하여 어려운 물질 (예 : 착색 물질 또는 나노 물질)에 대한 조류 독성 테스트를 시연합니다.

초록

생태 독성 데이터는 유럽 및 국제 규정(예: REACH)에 의한 화학물질의 사전 및 사후 시장 등록을 위한 요구 사항입니다. 조류 독성 검사는 화학 물질의 규제 위험 평가에 자주 사용됩니다. 높은 신뢰성과 재현성을 달성하기 위해서는 표준화된 가이드라인의 개발이 필수적입니다. 조류 독성 검사의 경우, 지침은 pH, 온도, 이산화탄소 수준 및 광 강도와 같은 매개 변수의 안정적이고 균일한 조건을 요구합니다. 나노 물질 및 기타 소위 어려운 물질은 그들의 규제 수용을 방해 하는 결과 큰 변화를 일으키는 빛을 방해할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 LEVITATT (조류 독성 검사를위한 LED 수직 조명 표)를 개발했습니다. 이 설정은 아래에서 LED 조명을 사용하여 균일한 광 분포 및 온도 제어를 허용하고 시료 내 의 그늘을 최소화합니다. 이 설정은 바이오매스 정량화를 위한 샘플 부피를 최적화하고 동시에 조류의 기하급수적인 성장을 지원하기 위해 CO_2의 충분한 유입을 보장합니다. 또한, 테스트 컨테이너의 재료는 흡착 및 휘발화를 최소화하기 위해 맞춤화될 수 있습니다. 유색 물질 이나 입자 현탁액을 테스트 할 때, LED 조명의 사용은 또한 추가 열 발생없이 빛 강도를 증가 할 수 있습니다. 컴팩트한 설계와 최소한의 장비 요구 사항은 광범위한 실험실에서 LEVITATT구현 가능성을 높입니다. ALgal 독성 검사에 대한 표준화된 ISO 및 OECD 지침을 준수하는 반면, LEVITATT는 에렌마이어 플라스크 및 마이크로티터 플레이트에 비해 두 개의 기준 물질(3,5-디콜로로페놀 및 K₂Cr₂O_7)과3개의 나노 물질(ZnO, CeO₂및 BaSO_4)에대한 낮은 샘플 간 가변성을 보였습니다.

서문

조류 독성 검사는 유럽 및 국제 규정에 의해 화학 물질의 사전 및 후 시장 등록에 필요한 생태 독성 데이터를 생성하는 데 사용되는 세 가지 필수 테스트 중 하나입니다 (예 : REACH¹ 및 TSCA (미국). 이를 위해 표준화된 조류 시험 지침은 국제기구(예: ISO 및 OECD)에 의해 개발되었습니다. 이러한 테스트 표준 및 지침은 pH, 온도, 이산화탄소 수준 및 광 강도 측면에서 이상적인 테스트 조건을 규정합니다. 그러나, 조류 시험 동안 안정적인 시험 상태를 유지하는 것은 실제로 어렵고 그 결과는 다양한 화학 물질 및 나노 물질(종종 "어려운 물질"이라고도 함)에 대한 재현성 및 신뢰성 문제로 고통받고^있다. 기존의 조류 독성 테스트 설정의 대부분은 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 위치한 상대적으로 큰 볼륨 (100-250 mL)으로 작동합니다. 이러한 설정은 시험 농도의 수를 제한하고 조류 배양 및 테스트 재료의 달성 가능하고 높은 볼륨을 복제합니다. 또한, 이러한 설정은 거의 균일 한 광장을 가지고 있으며 신뢰할 수있는 조명 조건은 또한 큰 플라스크에서 얻기 가 어렵고, 부분적으로 빛의 강도가 기하급수적으로 감소함에 따라 빛이 더 멀리 이동하고 부분적으로 플라스크 형상으로 인해. 대체 설정은 pH, 추가 바이오매스 측정, 안료 추출 또는 파괴적인 샘플링을 요구하는 기타 분석을 측정하기에 적절한 샘플링 볼륨을 허용하지 않는 작은 샘플 볼륨을 포함하는 플라스틱 마이크로티터³ 플레이트로 구성됩니다. 유색현탁액을 형성하는 나노물질 및 물질의 조류 독성 검사를 위한 기존 설정을 사용하는 한 가지 특별한 과제는 종종 "차광"4,^4,5라고도하는 조류 세포에 사용할 수 있는 빛의 간섭 또는 차단이다. 차광은 시험 물질과 조류 세포 사이의 시험 재료 및/또는 상호 작용에 의해 바이알 내에서 발생할 수 있으며, 또는 서로에 대한 위치와 광원에 대한 위치 때문에 바이알 사이에 차광이 발생할 수 있습니다.

이 방법은 OECD 201^7,ISO 8692⁸과 같은 표준에 따라 테스트를 허용하는 Arensberg 등^6에 의해 도입된 소규모 조류 독성 테스트 설정을 기반으로 한다. 이 방법은 위에 명시된 한계를 해결하기 위해 더욱 최적화되어 있다: 1) 최소한의 열발생으로 균일한 조명 조건을 보장하기 위해 LED 조명 기술을 활용하고, 2) 일정한 pH, CO₂ 수준 및 3)를 유지하면서 화학/생물학적 분석을 위한 적절한 샘플 볼륨을 제공하여 휘발성 물질 또는 물질에 대한 테스트를 위한 다목적 테스트 컨테이너 재료를 사용할 수 있게 한다.

프로토콜

1. LEVITATT 설정에 대한 설명

1. 20mL 신경 유리 바이알(도1,인서칭 1)을 사용하여 빛을 침투할 수 있습니다. 또는 가벼운 침투성 플라스틱 바이알을 사용할 수 있습니다. 광미터를 사용하여 빛의 강도를 정량화합니다.
2. 생체매스의 정량화를 허용하고 인큐베이션 전후의 나노 물질의 특성화/정량화를 위해 시험 시작 시 적어도 4mL 시험 서스펜션을 사용한다(도1,삽입 2).
3. 작은 구멍이 뚫린캡(도 1,인서드 3)과 함께 20mL 신경바이알을 장착하여 대기와_CO2 교환을 허용한다. 이 교환은 테스트 중에 안정적인 pH 및 CO₂ 수준을 보장하는 데 매우 중요합니다.
4. 휘발성 물질의 경우, 농축 나트륨 중탄산염(NaHCO₃₎완충계통(10)에¹⁰의해_CO2가 용액으로 유지되는 가스 상이 없는 주사기⁹ 또는 완전히 닫힌 플라스크를 사용하여 헤드스페이스의_CO2 농축을 허용하도록 밀착테플론 코팅 캡을 사용한다.
5. 외부 케이스에 클램프가 장착된 바이알을 고정합니다(그림1,삽입 4).
6. 시험 바이알 아래에 위치한 LED 광원을 사용하(도1,인서트 5)은 "쿨 화이트" 또는 "일광" 타입의 균일한 형광 조명과 60-120 μEE/m-2∙s-1의 광합성 유효 파장 범위에서 측정된 400nm ~ 700nm의 광합성 유효 파장 범위에서 측정된다.^-2-1 이 설정은 소스에 라이트 조광기를 장착하여 5-160 μE∙m^-2∙s-1 범위에서 조정 가능한 광 강도를 사용합니다. 이를 통해 더 높고 낮은 광 강도에서 테스트할 수 있습니다.
7. 시험 기간 내내 샘플을 양도하기 위해 궤도 셰이커에 셋업을 탑재합니다. 이렇게 하면 세포가 자유 현탁액을 유지하고_CO2 질량 전달을 공기에서 물로 용이하게합니다(그림 1,삽입 6).
8. 온도 조절실 또는 온도 조절 캐비닛에 설치를 배치하여 테스트 전반에 걸쳐 안정적인 온도를 유지합니다(그림1,삽입 7).

그림 1: 조류 독성 검사(LEVITATT)용 LED 수직 조명 표 그림. 1) 20mL 유리 신경화 바이알 인큐베이션용, 2) 4mL 샘플 분석용, 3) CO₂ 교환용 드릴구멍, 4) 정의된 광 조건에 대한 케이싱, 5) LED 광원은 케이싱의 중심에 위치하고, 6) 실험 중 동요를 위한 궤도 셰이커, 7) 열성 캐비닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 조류 성장 매체의 준비

1. ISO 8692 조류 성장 매체는 4개의 서로 다른 주식 솔루션으로 구성됩니다. 표 1에따라 적절한 양의 소금을 계량하고 초순수수에서 희석한다.

스톡 솔루션	영양소	재고 용액 의 집중	시험 용액의 농도
1: 다량 영양소	NH4Cl	1.5 g/L	15 mg/L (N: 3.9 mg/L)
	MgCl2∙6H2O	1.2 g/L	12 mg/L (Mg: 2.9 mg/L)
	CaCl2∙2H2O	1.8 g/L	18 mg/L (Ca: 4.9 mg/L)
	MgSO4∙7H2O	1.5 g/L	15 mg/L (S: 1.95 mg/L)
	KH2PO4	0.16 g/L	1.6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: 페-EDTA	FeCl3∙6H2O	64 mg/L	64 μg/L (Fe: 13 μg/L)
	나2EDTA∙2H2O	100 mg/L	100 μg/L
3: 미량 요소	H3BO3a	185 mg/L	185 μg/L (B: 32 μg/L)
	MnCl2∙4H2O	415 mg/L	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ZnCl2	3 mg/L	3 μg/L (Zn: 1.4 μg/L)
	CoCl2∙6H2O	1.5 mg/L	1.5 μg/L (공동: 0.37 μg/L)
	CuCl2∙2H2O	0.01 mg/L	0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L)
	나2MoO4∙2H2O	7 mg/L	7 μg/L(모: 2.8 μg/L)
4: 나코3	나에코3	50 g/L	50 mg/L (C: 7.14 mg/L)

표 1: 조류 성장 매체용 재고 솔루션의 영양소 농도

참고: H₃BO_3는 0.1 M NaOH를 추가하여 용해될 수 있습니다. 금속 이온으로 복합화를 피하기 위해 금속을 테스트할 때 EDTA를 제거해야 합니다. 멤브레인 여과(평균 모공 직경 0.2 μm) 또는 오토클레이빙(120°C, 15분)으로 스톡 용액을 살균한다. 오토클레이브 스톡 솔루션 2 및 4를 수행하지 말고 멤브레인 여과로 소독하십시오. 4°C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다.

2. 1L의 조류 성장 매체를 생산하기 위해 500mL 의 멸균 초순수를 1L 살균 된 체피 플라스크로 옮기고 10 mL의 재고 용액 1을 추가하십시오 : 다량 영양소, 1 mL 의 재고 용액 2 : Fe-EDTA, 1 mL 의 재고 용액 3 : 미량 원소 및 1 mL 스톡 솔루션 4 : NaHCO₃.
3. 멸균 된 초순수물로 최대 1 L을 채우고 플라스크를 멈추고 조류 성장 매체를 균질화하기 위해 철저히 흔들어줍니다.
4. 사용 전에 용액을 평형화하여 공기와 접촉하거나 멸균, 여과 된 공기로 30 분 동안 버블링하여 밤새 방치하여 솔루션을 평형화하십시오. 평형 후, pH를 조정, 필요한 경우, pH8.1 ± 0.2, 1 M HCl 또는 1 M NaOH.

3. 조류 시험 설정

참고: 조류 시험 절차의 흐름 다이어그램은 도 2에표시됩니다.

그림 2: 조류 테스트 설정의 흐름 다이어그램입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 2단계에 따라 준비된 조류 성장 배지에서 원하는 최고 시험 농도로 시험 화합물의 스톡 용액을 준비한다. 주식 솔루션/현탁액의 준비를 위해 OECD 201(수용성 화합물용) 또는 OECD 318(나노물질용)을 따릅니다.
2. 주식 용액에서 pH를 측정합니다. 조류 성장 배지에서 하나 이상의 유닛을 이탈하는 경우, pH를 1M HCl 또는 1M NaOH로 8로 조정한다.
3. 25mL 테스트 용액에서 1 x 10⁴ 셀/mL의 최종 세포 농도에 도달하는 데 필요한 접종 부피를 계산합니다.
   참고: 접종은 LEVITATT 설정을 사용하여 재배된 오염되지 않은 라피도셀리스 아참타의 문화에서 비롯되어야 합니다.
4. 원하는 시험 농도를 얻기 위해 각 25mL 체피 플라스크에 추가하는 스톡 솔루션의 양을 계산합니다. 각 농도 사이의 요인은 3.2를 초과해서는 안됩니다.
5. 선택한 각 농도에 대해 25mL 체피 플라스크 1개, 추가 25mL 체피 플라스크 표시 컨트롤을 표시합니다.
6. 원하는 농도에 도달하는 데 필요한 테스트 화합물의 스톡 용액의 양을 25 mL 체피 플라스크에 추가합니다. 제어에 스톡 솔루션을 추가하지 마십시오.
7. 매 25mL 체피 플라스크에 배지를 추가하여 약 20mL의 부피에 도달합니다.
8. 각 25mL 볼륨 플라스크에 3.3 단계에서 계산된 접종의 볼륨을 추가합니다. 매 25mL 체피 플라스크에 매질을 추가하여 최종 총 부피 25mL에 추가합니다.
9. 플라스크를 멈추고 플라스크를 두 번 수직으로 돌려 완전히 섞습니다.
10. 각 플라스크에서 0.4mL를 개별 나사 캡 바이알로 옮기고 1.6mL의 아세톤(MgCO_3으로포화됨) 각 시험 농도 및 컨트롤에 대한 샘플 1개를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 형광 측정(섹션 4)이 될 때까지 실온에서 어둠 속에서 보관하십시오.
11. 각 테스트 용액의 파이프 4 mL을 20 mL 신경화 바이알로 (3 농도당 복제 및 대조군을 위해 5 복제). 반짝이는 바이알에 나사 뚜껑. 뚜껑에는 CO₂ 교환을 허용하려면 드릴구멍(직경 약 1mm)이 있어야 합니다.
12. 24시간, 48h, 72h 후 각 유리병으로부터 0.4mL를 나사 캡 바이알로 파이프하고 1.6mL의 아세톤(MgCO_3로포화)을 추가한다. 뚜껑을 단단히 닫고 형광 측정(섹션 4)이 될 때까지 실온에서 어둠 속에서 보관하십시오.
13. 마지막 샘플을 72h에서 채취한 후, 한 유리병에 주어진 농도에 대해 3개의 복제를 부드럽게 풀고 pH를 측정합니다. 모든 농도 및 컨트롤을 반복합니다. pH는 측정된 샘플 중 임의의 초기 pH로부터 1.5단위 이상을 이탈해서는 안 된다.
14. 나머지 액체를 제도적 규칙 및 규정에 따라 폐기물 용기에 배출합니다.

4. 조류 테스트 샘플 분석

1. 형광 분광광계를 사용하여 조류 바이오매스를 측정하십시오 (여기 엽록소 A로 표현). 엽록소 A의 피크 방출은 내분 파장의 경우 420nm, 방출 파장의 경우 671nm이다.
2. 각 개별 샘플의 형광을 세 번 측정하고 각 샘플의 평균 값을 계산합니다.
3. 방정식 1을 사용하여 성장률을 계산합니다. 측정된 형광(상대 단위)은 수학식 1에서 바이오매스 파라미터로서 직접 사용될 수 있다.
   방정식 1 : μ = (ln N_t – ln N₀₎/ t
   μ^{성장률(d-1),}_N0은 초기 바이오매스이고,_Nt는 시일 때 바이오매스이고, t는 시험 기간(d)의 길이이다. 참고, N₀ 및 N_t는 동일한 단위로 표현되어야 합니다.
4. 통계 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 곡선(예를 들어, 로그 로지스틱 또는 바이불 기능)을 성장속도 데이터에 맞추어 효과적인 농도 값을 10%, 20%, 및 50% 억제한다. 보충 정보에서 DRC^{패키지(11)를} 이용한 통계 소프트웨어 R에 피팅하기 위한 코드의 예가 주어진다.

결과

기준 물질을 가진 초기 시험은 조류 균주의 감도를 결정하기 위하여 수행됩니다. R. 서브 쿼타에 정기적으로 사용되는 기준 물질은 칼륨 디크로메이트 및 3,5-디클로르페놀^7,,8이다. 도 3 및 표 2는 R의 DRC 패키지가 성장률에 적용될 때 곡선 피팅 및 통계 출력을 포함하는 조류 테스트의 대표적인 결과를 보여 준다....

토론

Phytoplankton은 태양 에너지와 이산화탄소를 유기 물질로 변환하여 수중 생태계에서 중추적 인 역할을합니다. 이러한 이유로, 조류 성장 속도 억제 테스트는 화학 물질의 규제 위험 평가에 필요한 세 가지 필수 수생 독성 테스트 중 하나로 포함됩니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 조류 독성 검사를 수행하는 능력은 이 점에서 중요합니다. Erlenmeyer 플라스크를 사용한 테스트 설정은 도입에 설명된 바?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086