Une configuration à petite échelle pour l’essai de toxicité des algues des nanomatériaux et autres substances difficiles

Résumé

Nous démontrons des tests de toxicité des algues pour des substances difficiles (p. ex., substances colorées ou nanomatériaux) à l’aide d’une configuration éclairée verticalement par une LED.

Résumé

Les données sur l’écotoxicité sont une exigence pour l’enregistrement avant et après la mise sur le marché des produits chimiques par les réglementations européennes et internationales (p. ex., REACH). Le test de toxicité des algues est fréquemment utilisé dans l’évaluation des risques réglementaires des produits chimiques. Afin d’atteindre une fiabilité et une reproductibilité élevées, l’élaboration de lignes directrices normalisées est essentielle. Pour les essais de toxicité des algues, les lignes directrices exigent des conditions stables et uniformes de paramètres tels que le pH, la température, les niveaux de dioxyde de carbone et l’intensité lumineuse. Les nanomatériaux et autres substances dites difficiles peuvent interférer avec la lumière, ce qui entraîne une grande variation des résultats obtenus qui entravent leur acceptation réglementaire. Pour relever ces défis, nous avons développé LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuration utilise l’éclairage LED d’en bas permettant une distribution homogène de la lumière et le contrôle de la température tout en minimisant l’ombrage intra-échantillon. La configuration optimise le volume de l’échantillon pour la quantification de la biomasse et assure en même temps un afflux suffisant de CO₂ pour soutenir la croissance exponentielle des algues. En outre, le matériel des conteneurs d’essai peut être adapté pour minimiser l’adsorption et la volatilisation. Lors de l’essai de substances colorées ou de suspensions de particules, l’utilisation de lumières LED permet également d’augmenter l’intensité lumineuse sans production de chaleur supplémentaire. La conception compacte et les exigences minimales en matière d’équipement augmentent les possibilités de mise en œuvre du LEVITATT dans un large éventail de laboratoires. Bien qu’il soit conforme aux lignes directrices normalisées de l’ISO et de l’OCDE pour les tests de toxicité des algues, LEVITATT a également montré une variabilité interinstompale plus faible pour deux substances de référence (3,5-Dicholorophénol et K₂Cr₂O₇) et trois nanomatériaux (ZnO, CeO₂et BaSO₄₎par rapport aux flacons et plaques de microtiter Erlenmeyer.

Introduction

Le test de toxicité des algues est l’un des trois seuls tests obligatoires utilisés pour générer les données d’écotoxicité requises pour l’enregistrement des produits chimiques avant et après la mise sur le marché par les réglementations européennes et internationales (p. ex., REACH¹ et TSCA (États-Unis)). À cette fin, des organisations internationales ont élaboré des lignes directrices normalisées sur les tests d’algues (p. ex., l’ISO et l’OCDE). Ces normes et lignes directrices prescrivent des conditions d’essai idéales en termes de pH, de température, de dioxyde de carbone et d’intensité lumineuse. Toutefois, le maintien de conditions d’essai stables pendant les essais d’algues est en pratique difficile et les résultats souffrent de problèmes de reproductibilité et de fiabilité pour une gamme de substances chimiques et de nanomatériaux (souvent appelés « ubstances difficile »)². La plupart des installations existantes d’essais de toxicité des algues fonctionnent avec des volumes relativement importants (100–250 mL) situés sur un shaker orbital à l’intérieur d’un incubateur. Une telle configuration limite le nombre de concentrations d’essai et reproduit des volumes réalisables et élevés de culture d’algues et de matériel d’essai. En outre, ces configurations ont rarement un champ de lumière uniforme et des conditions d’éclairage fiables sont en outre difficiles à obtenir dans les grandes fioles, en partie parce que l’intensité lumineuse diminue exponentiellement plus la lumière se déplace et en partie en raison de la géométrie de la fiole. Les configurations alternatives comprennent des plaques de microtiter en plastique³ contenant de petits volumes d’échantillons qui ne permettent pas des volumes d’échantillonnage adéquats pour mesurer le pH, des mesures supplémentaires de la biomasse, l’extraction de pigments ou d’autres analyses nécessitant un échantillonnage destructeur. Un défi particulier utilisant les configurations existantes pour l’essai de toxicité des algues des nanomatériaux et des substances formant des suspensions colorées est l’interférence ou le blocage de la lumière disponible pour les cellules d’algues, souvent appelée « ombrage »^4,5. L’ombrage peut se produire dans les flacons par le matériel d’essai et/ou les interactions entre le matériau d’essai et les cellules algales, ou l’ombrage peut se produire entre les flacons, en raison de leur positionnement les uns par rapport aux autres et de la source lumineuse.

La méthode est basée sur la configuration des essais de toxicité des algues à petite échelle introduit par Arensberg et al.⁶ qui permet de tester en conformité avec des normes telles que l’OCDE 201⁷, et ISO 8692⁸. La méthode est en outre optimisée pour répondre aux limites indiquées ci-dessus par : 1) en utilisant la technologie de lumière DEL pour assurer des conditions lumineuses uniformes avec une production minimale de chaleur, 2) fournissant un volume d’échantillon adéquat pour l’analyse chimique/biologique tout en maintenant le pH constant, les niveaux de CO_2, et 3) permettant l’utilisation de matériel polyvalent de récipient d’essai pour l’essai des substances volatiles ou des substances avec un potentiel de sorption élevé.

Protocole

1. Description de la configuration de LEVITATT

1. Utiliser des flacons en verre de scintillation de 20 mL(figure 1, insert 1) permettant la pénétration de la lumière. Alternativement, des flacons en plastique à pénétration légère peuvent être utilisés. Quantifier l’intensité lumineuse à l’aide d’un photomètre.
2. Utiliser au moins une suspension d’essai de 4 mL au début de l’essai pour permettre la quantification de la biomasse et pour la caractérisation/quantification des nanomatériaux pendant et après l’incubation (figure 1, insertion 2).
3. Adapter les flacons de scintillation de 20 mL à l’aided’un bouchon (figure 1, insert 3) où un petit trou est foré (environ 1 mm de diamètre) pour permettre l’échange de CO₂ avec l’atmosphère. Cet échange est crucial pour assurer des niveaux stables de pH et de CO₂ pendant les essais.
4. Pour les substances volatiles, utilisez un bouchon recouvert de téflon étanche à l’air pour permettre l’enrichissement du CO₂ de l’espace de tête à l’aide d’une seringue⁹ ou de flacons complètement fermés sans phase de gaz dans lequel le CO₂ est maintenu en solution par un système tampon de bicarbonate de sodium enrichi (NaHCO₃)¹⁰.
5. Attachez les flacons avec des pinces montées sur le boîtier extérieur (figure 1, insert 4).
6. Utiliser une source lumineuse LED située sous les flacons d’essai(figure 1, insert 5) fournissant un éclairage fluorescent uniforme de type « blanc froid » ou « lumière du jour » et une intensité lumineuse de la plage de 60 à 120 μE-m^-2•s^-1 mesurée dans la plage de longueur d’onde photosynthétiquement efficace de 400 nm à 700 nm. La configuration utilise une intensité lumineuse réglable dans la gamme 5–160 μE•m^-2•s^-1 en ajustant un gradateur de lumière à la source. Cela permet de tester à des intensités de lumière de plus en plus faibles.
7. Montez la configuration sur un shaker orbital pour agiter des échantillons pendant toute la durée de l’essai. Cela maintient les cellules en suspension libre et facilite le transfert de masse de CO₂ de l’air à l’eau (Figure 1, insert 6).
8. Placez l’installation dans une pièce à température contrôlée ou une armoire thermostatique pour maintenir des températures stables tout au long des essais (figure 1, insérer 7).

Figure 1 : Image de la table d’éclairage vertical LED pour les essais de toxicité des algues (LEVITATT). 1) 20 flacons de scintillation de verre de mL pour l’incubation, 2) échantillon de 4 mL pour l’analyse, 3) couvercle avec trou percé pour l’échange de CO_2, 4) boîtier pour des conditions de lumière définies, 5) source lumineuse DEL située au centre du boîtier, 6) shaker orbitale pour l’agitation pendant l’expérience, et 7) une armoire thermostatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Préparation du milieu de croissance des algues

1. Le milieu de croissance des algues ISO 8692 se compose de quatre solutions de stock différentes. Peser la quantité appropriée de sels et diluer dans l’eau ultrapure selon le tableau 1.

Solutions stock	Nutriments	Concentration dans la solution de stock	Concentration dans la solution d’essai
1: Macronutriments	NH4Cl	1,5 g/L	15 mg/L (N: 3,9 mg/L)
	MgCl2•6H2O	1,2 g/L	12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)
	CaCl2•2H2O	1,8 g/L	18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)
	MgSO4•7H2O	1,5 g/L	15 mg/L (S: 1,95 mg/L)
	KH2PO4	0,16 g/L	1,6 mg/L (P : 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA	FeCl3•6H2O	64 mg/L	64 μg/L (Fe: 13 μg/L)
	Na2EDTA-2H2O	100 mg/L	100 μg/L
3: Oligo-éléments	H3BO3a	185 mg/L	185 μg/L (B: 32 μg/L)
	MnCl2•4H2O	415 mg/L	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ZnCl2	3 mg/l	3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L)
	CoCl2•6H2O	1,5 mg/l	1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L)
	CuCl2•2H2O	0,01 mg/L	0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L)
	Na2MoO4•2H2O	7 mg/L	7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L)
4: NaHCO3	NaHCO3	50 g/L	50 mg/L (C: 7,14 mg/L)

Tableau 1 : Concentrations de nutriments dans les solutions de stock pour le milieu de croissance des algues

REMARQUE : H₃BO₃ peut être dissous en ajoutant 0,1 M NaOH. EdTA doit être enlevé lors de l’essai des métaux, afin d’éviter la complexation avec des ions métalliques. Stériliser les solutions de stock par filtration membranaire (diamètre moyen des pores 0,2 μm) ou par autoclavage (120 °C, 15 min). Ne faites pas de solutions de stock autoclave 2 et 4, mais stérilisez-les par filtration membranaire. Rangez les solutions dans l’obscurité à 4 °C.

2. Pour produire 1 L de milieu de croissance d’algues, transférer 500 ml d’eau ultrapure stérilisée dans une fiole volumétrique stérilisée de 1 L et ajouter 10 ml de solution de stock 1: Macronutriments, 1 ml de solution de stock 2: Fe-EDTA, 1 mL de solution stock 3: Oligo-éléments, et 1 mL de solution stock 4: NaHCO₃.
3. Remplissez jusqu’à 1 L d’eau ultrapure stérilisée, arrêtez la fiole et secouez soigneusement pour homogénéiser le milieu de croissance des algues.
4. Équilibrez la solution avant l’utilisation en la laissant toute la nuit en contact avec l’air ou en bouillonnant d’air stérile et filtré pendant 30 min. Après l’équilibre, ajuster le pH, si nécessaire, au pH 8,1 ± 0,2, avec 1 M HCl ou 1 M NaOH.

3. Mise en place du test d’algues

REMARQUE : Un diagramme d’écoulement de la procédure d’essai des algues est indiqué à la figure 2.

Figure 2 : Diagramme d’écoulement de la configuration du test d’algues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Préparer une solution de stock du composé d’essai à la concentration d’essai la plus élevée souhaitée dans le milieu de croissance des algues préparé selon l’étape 2. Pour la préparation de solutions/suspensions de stock, suivez l’OCDE 201 (pour les composés solubles) ou l’OCDE 318 (pour les nanomatériaux).
2. Mesurer le pH dans la solution stock. S’il dévie plus d’une unité du milieu de croissance des algues, ajuster le pH à 8 avec 1 M HCl ou 1 M NaOH.
3. Calculer le volume d’inoculum nécessaire pour atteindre une concentration cellulaire finale de 1 x 10⁴ cellules/mL dans une solution d’essai de 25 mL.
   NOTE: L’inoculum devrait provenir d’une culture de Raphidocelis sous-capitata à croissance exponentielle non contaminée cultivée à l’aide de la configuration LEVITATT.
4. Calculez la quantité de solution de stock à ajouter à chaque flacon volumétrique de 25 mL pour obtenir les concentrations d’essai souhaitées. Le facteur entre chaque concentration ne doit pas dépasser 3,2.
5. Marquez un flacon volumétrique de 25 mL pour chaque concentration choisie et un contrôle marqué de 25 mL de la fiole volumétrique supplémentaire.
6. Ajoutez la quantité de solution de stock du composé d’essai nécessaire pour atteindre les concentrations désirées à la fiole volumétrique de 25 mL. N’ajoutez pas de solution de stock au contrôle.
7. Ajouter le milieu à chaque flacon volumétrique de 25 mL pour atteindre un volume d’environ 20 ml.
8. Ajoutez le volume d’inoculum calculé à l’étape 3.3 à chaque flacon volumétrique de 25 mL. Ajouter le milieu à chaque flacon volumétrique de 25 mL à un volume total final de 25 ml.
9. Arrêter les flacons et bien mélanger en tournant les flacons deux fois verticalement.
10. Transférer 0,4 ml de chaque flacon dans des flacons à vis individuels et ajouter 1,6 ml d’acétone (saturé de MgCO₃₎: un échantillon pour chaque concentration d’essai et la commande. Fermer les couvercles hermétiquement et les conserver dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que la fluorescence mesure (section 4).
11. Pipet 4 mL de chaque solution d’essai en flacons de scintillation de 20 mL (3 répliques par concentration et 5 répliques pour le contrôle). Couvercles à vis sur les flacons de scintillation. N’oubliez pas que les couvercles doivent avoir un trou percé (environ 1 mm de diamètre) pour permettre l’échange de CO_2.
12. Après 24 h, 48 h et 72 h, pipet 0,4 mL de chaque flacon en flacons à capuchon à vis et ajouter 1,6 mL d’acétone (saturé de MgCO_3). Fermer les couvercles hermétiquement et les conserver dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce que la fluorescence mesure (section 4).
13. Après que le dernier échantillon est prélevé à 72 h, mettre en commun délicatement les trois répliques pour une concentration donnée dans un flacon et mesurer le pH. Répétez pour toutes les concentrations et le contrôle. Le pH ne doit pas dévier plus de 1,5 unité du pH initial pour l’un des échantillons mesurés.
14. Déchargez les liquides restants dans un conteneur à déchets conformément à vos règles et règlements institutionnels.

4. Analyse des échantillons d’essais d’algues

1. Utiliser un spectrophotomètre de fluorescence pour mesurer la biomasse d’algues (ici exprimée sous forme de chlorophylle A). L’émission maximale de chlorophylle A est de 420 nm pour la longueur d’onde d’excitation et de 671 nm pour la longueur d’onde d’émission.
2. Mesurer la fluorescence de chaque échantillon trois fois et calculer la valeur moyenne de chaque échantillon.
3. Utilisez l’équation 1 pour calculer le taux de croissance. La fluorescence mesurée (unités relatives) peut être utilisée directement comme paramètre de biomasse dans l’équation 1.
   Équation 1 : μ = (ln N_t – ln N₀) / t
   où μ est le taux de croissance (d^-1),N₀ est la biomasse initiale, N_t est la biomasse au moment t, et t est la longueur de la période d’essai (d). Notez que N₀ et N_t doivent être exprimés dans la même unité.
4. Utilisez un logiciel statistique pour adapter une courbe de régression non linéaire (p. ex., une fonction log-logistique ou Weibull) aux données du taux de croissance pour obtenir des valeurs de concentration efficaces à 10 %, 20 % et 50 % d’inhibition. Dans les informations complémentaires, un exemple de code pour s’adapter au logiciel statistique R utilisant le paquet¹¹ de la RDC est donné.

Résultats

Un premier test avec une substance de référence est effectué pour déterminer la sensibilité de la souche d’algues. Les substances de référence régulièrement utilisées pour R. subcapitata sont le dichromate de potassium et le dichlorphénol^7,8. Les figures 3 et 2 montrent un résultat représentatif d’un test d’algues, y compris l’ajustement des courbes et les extrants statistiques lorsque l...

Discussion

Le phytoplancton convertit l’énergie solaire et le dioxyde de carbone en matière organique et joue ainsi un rôle central dans l’écosystème aquatique. Pour cette raison, les tests d’inhibition du taux de croissance des algues sont inclus comme l’un des trois tests de toxicité aquatique obligatoires requis pour l’évaluation réglementaire des risques des produits chimiques. La capacité d’effectuer un test fiable et reproductible de toxicité des algues est essentielle à cet égard. Les configurations d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086