Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

Resumen

Demostramos pruebas de toxicidad algas para sustancias difíciles (por ejemplo, sustancias de color o nanomateriales) utilizando una configuración iluminada verticalmente con un LED.

Resumen

Los datos de ecotoxicidad son un requisito para el registro previo y posterior al mercado de productos químicos por normativa europea e internacional (por ejemplo, REACH). El ensayo de toxicidad de algas se utiliza con frecuencia en la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. Con el fin de lograr una alta fiabilidad y reproducibilidad, el desarrollo de directrices estandarizadas es vital. Para las pruebas de toxicidad de algas, las directrices requieren condiciones estables y uniformes de parámetros como el pH, la temperatura, los niveles de dióxido de carbono y la intensidad de la luz. Los nanomateriales y otras sustancias llamadas difíciles pueden interferir con la luz causando una gran variación en los resultados obtenidos que obstaculiza su aceptación regulatoria. Para hacer frente a estos desafíos, hemos desarrollado LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuración utiliza iluminación LED desde abajo, lo que permite una distribución homogénea de la luz y un control de temperatura, al mismo tiempo que minimiza el sombreado intramuestra. La configuración optimiza el volumen de la muestra para la cuantificación de la biomasa y garantiza al mismo tiempo una afluencia suficiente de_CO2 para apoyar el crecimiento exponencial de las algas. Además, el material de los contenedores de prueba se puede adaptar para minimizar la adsorción y la volatilización. Al probar sustancias de color o suspensiones de partículas, el uso de luces LED también permite aumentar la intensidad de la luz sin generación de calor adicional. El diseño compacto y los requisitos mínimos de equipamiento aumentan las posibilidades de implementación del LEVITATT en una amplia gama de laboratorios. Si bien cumplió con las directrices estandarizadas de ISO y la OCDE para las pruebas de toxicidad de algas, LEVITATT también mostró una menor variabilidad entre muestras para dos sustancias de referencia (3,5-Dicholorophenol y K₂Cr₂O₇₎y tres nanomateriales (ZnO, CeO₂y BaSO₄₎en comparación con los matraces y las placas de microtíter Erlenmeyer.

Introducción

El ensayo de toxicidad por algas es uno de los tres únicos ensayos obligatorios utilizados para generar los datos de ecotoxicidad necesarios para el registro antes y después del mercado de productos químicos por normativas europeas e internacionales (por ejemplo, REACH¹ y TSCA (EE.UU.)). Para ello, las organizaciones internacionales han elaborado directrices estandarizadas de pruebas de algas (por ejemplo, ISO y OCDE). Estas normas y directrices de prueba prescriben condiciones de prueba ideales en términos de pH, temperatura, niveles de dióxido de carbono e intensidad de la luz. Sin embargo, mantener condiciones de ensayo estables durante las pruebas de algas es en la práctica difícil y los resultados sufren problemas de reproducibilidad y fiabilidad para una serie de sustancias químicas y nanomateriales (a menudo denominados "sustancias difíciles")². La mayoría de las configuraciones de pruebas de toxicidad de algas existentes funcionan con volúmenes relativamente grandes (100-250 ml) situados en un agitador orbital dentro de una incubadora. Tal configuración limita el número de concentraciones de prueba y replica volúmenes alcanzables y altos de cultivo de algas y material de prueba. Además, estas configuraciones rara vez tienen un campo de luz uniforme y las condiciones de iluminación fiables son además difíciles de obtener en frascos grandes, en parte como la intensidad de la luz disminuye exponencialmente cuanto más viaja la luz y en parte debido a la geometría del matraz. Las configuraciones alternativas comprenden microtíteres de plástico³ placas que contienen pequeños volúmenes de muestra que no permiten volúmenes de muestreo adecuados para medir el pH, mediciones adicionales de biomasa, extracción de pigmentos u otros análisis que requieren muestreo destructivo. Un desafío particular utilizando las configuraciones existentes para las pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y sustancias que forman suspensiones de color es la interferencia o el bloqueo de la luz disponible para las células de algas, a menudo denominada "sombreado"^4,,5. El sombreado puede ocurrir dentro de los viales por el material de prueba y/o interacciones entre el material de ensayo y las células de algas, o el sombreado puede ocurrir entre viales, debido a su posicionamiento en relación entre sí y la fuente de luz.

El método se basa en la configuración de la prueba de toxicidad de algas a pequeña escala introducida por Arensberg et al.⁶ que permite realizar pruebas de conformidad con normas como la OCDE 201⁷e ISO 8692⁸. El método se optimiza aún más para abordar las limitaciones mencionadas anteriormente por: 1) utilizando la tecnología de luz LED para garantizar condiciones de luz uniformes con una generación de calor mínima, 2) proporcionando un volumen de muestra adecuado para el análisis químico/biológico manteniendo un pH constante, niveles de_CO2 y 3) lo que permite el uso de material contenedor de ensayo versátil para pruebas de sustancias volátiles o sustancias con un alto potencial de sorción.

Protocolo

1. Descripción de la configuración de LEVITATT

1. Utilice viales de vidrio de centelleo de 20 ml(Figura 1, inserto 1) permitiendo la penetración de la luz. Alternativamente, se pueden utilizar viales de plástico penetrables ligeros. Cuantifique la intensidad de la luz utilizando un fotómetro.
2. Utilice al menos una suspensión de prueba de 4 ml al comienzo de la prueba para permitir la cuantificación de la biomasa y la caracterización/cuantificación de nanomateriales durante y después de la incubación (Figura 1, inserto 2).
3. Coloque los viales de centelleo de 20 ml con una tapa(Figura 1, inserto 3) donde se perfore un pequeño orificio (aproximadamente 1 mm de diámetro) para permitir el intercambio de_CO2 con la atmósfera. Este intercambio es crucial para garantizar niveles estables de pH y CO₂ durante las pruebas.
4. Para sustancias volátiles, utilice una tapa recubierta de teflón hermética para permitir el enriquecimiento de CO₂ del espacio de la cabeza utilizando una jeringa⁹ o matraces completamente cerrados sin fase gaseosa en la que el CO₂ se mantenga en solución mediante un sistema tampón de bicarbonato de sodio enriquecido (NaHCO₃)¹⁰.
5. Fije los viales con abrazaderas montadas en la carcasa exterior(Figura 1, inserto 4).
6. Utilice una fuente de luz LED situada debajo de los viales de prueba(Figura 1, inserción 5) que proporcione una iluminación fluorescente uniforme de tipo "blanco frío" o "luz diurna" y una intensidad de luz en el rango de 60–120 á-M^{-2s -1} medido en el rango de longitud de onda fotosintéticamente eficaz de 400 nm a 700 nm. La configuración emplea una intensidad de luz ajustable en el rango de 5–160 m^-2s^-1 mediante el ajuste de un atenuador de luz a la fuente. Esto permite realizar pruebas a intensidades de luz más altas y más bajas.
7. Monte la configuración en un agitador orbital para agitar muestras durante toda la prueba. Esto mantiene las células en suspensión libre y facilita la transferencia de masa de_CO2 del aire al agua(Figura 1, inserto 6).
8. Coloque la configuración en una sala de temperatura controlada o en un gabinete termostático para mantener temperaturas estables durante las pruebas(Figura 1, inserto 7).

Figura 1: Imagen de la tabla de iluminación vertical LED para pruebas de toxicidad de algas (LEVITATT). 1) Viales de centelleo de vidrio de 20 ml para incubación, 2) 4 ml de muestra para análisis, 3) tapa con orificio perforado para intercambio de_CO2, 4) carcasa para condiciones de luz definidas, 5) fuente de luz LED situada en el centro de la carcasa, 6) agitador orbital para agitación durante el experimento, y 7) un gabinete termostático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación del medio de crecimiento de algas

1. El medio de crecimiento de algas ISO 8692 consta de cuatro soluciones de stock diferentes. Pesar la cantidad adecuada de sales y diluir en agua ultrapura según la Tabla 1.

Soluciones de stock	Nutrientes	Concentración en solución de stock	Concentración en la solución de ensayo
1: Macronutrientes	NH4Cl	1,5 g/L	15 mg/L (N: 3,9 mg/L)
	MgCl2a 6H2O	1.2 g/L	12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)
	CaCl2a 2H2O	1,8 g/L	18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)
	MgSO4a 7h2O	1,5 g/L	15 mg/L (S: 1,95 mg/L)
	KH2PO4	0,16 g/L	1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA	FeCl3a 6H2O	64 mg/L	64 g/L (Fe: 13 g/L)
	Na2EDTA-2H2O	100 mg/L	100 g/L
3: Elementos de seguimiento	H3BO3a	185 mg/L	185 g/L (B: 32 g/L)
	MnCl2a 4H2O	415 mg/L	415 g/L (Mn: 115 g/L)
	ZnCl2	3 mg/L	3 g/L (Zn: 1,4 g/L)
	CoCl2a 6H2O	1,5 mg/L	1.5 g/L (Co: 0,37 g/L)
	CuCl2a 2H2O	0,01 mg/L	0.01 g/L (Cu: 3,7 ng/L)
	Na2MoO4a 2H2O	7 mg/L	7 g/L (Mo: 2,8 g/L)
4: NaHCO3	NaHCO3	50 g/L	50 mg/L (C: 7,14 mg/L)

Tabla 1: Concentraciones de nutrientes en soluciones de stock para medio de crecimiento de algas

NOTA: H₃BO₃ se puede disolver añadiendo 0,1 M NaOH. EDTA debe retirarse al probar metales, para evitar la complejidad con iones metálicos. Esterilice las soluciones de stock por filtración por membrana (diámetro medio del poro 0,2 m) o mediante autoclavación (120 oC, 15 min). No realice las soluciones de material de autoclave 2 y 4, pero esterilícelas mediante filtración por membrana. Almacene las soluciones en la oscuridad a 4 oC.

2. Para producir 1 L de medio de crecimiento de algas, transfiera 500 ml de agua ultrapura esterilizada a un matraz volumétrico esterilizado de 1 L y añada 10 ml de solución de stock 1: Macronutrientes, 1 ml de solución de stock 2: Fe-EDTA, 1 mL de solución de stock 3: Elementos de traza y 1 ml de solución de stock 4: NaHCO₃.
3. Llene hasta 1 L con agua ultrapura esterilizada, detenga el matraz y agite bien para homogeneizar el medio de crecimiento de algas.
4. Equilibrar la solución antes de su uso dejándola durante la noche en contacto con el aire o burbujeando con aire estéril filtrado durante 30 min. Después del equilibrio, ajuste el pH, si es necesario, a pH 8,1 ± 0,2, con 1 M HCl o 1 M NaOH.

3. Configuración de la prueba de algas

NOTA: En la Figura 2se muestra un diagrama de flujo del procedimiento de prueba de algas.

Figura 2: Diagrama de flujo de la configuración de la prueba de algas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparar una solución de stock del compuesto de ensayo en la concentración de ensayo más alta deseada en el medio de crecimiento de algas preparado de acuerdo con el paso 2. Para la preparación de soluciones/suspensiones de stock, siga la OCDE 201 (para compuestos solubles) o la OCDE 318 (para nanomateriales).
2. Mida el pH en la solución en stock. Si se desvían más de una unidad del medio de crecimiento de algas, ajuste el pH a 8 con 1 M HCl o 1 M NaOH.
3. Calcular el volumen de inóculo necesario para alcanzar una concentración celular final de 1 x 10⁴ células/ml en una solución de prueba de 25 ml.
   NOTA: El inóculo debe provenir de una cultura de raphidocelis subcapitata de crecimiento exponencial no contaminado cultivada con la configuración LEVITATT.
4. Calcular la cantidad de solución de stock para añadir a cada matraz volumétrico de 25 ml para obtener las concentraciones de ensayo deseadas. El factor entre cada concentración no debe exceder de 3,2.
5. Marque un matraz volumétrico de 25 ml para cada concentración elegida y un control marcado de matraz volumétrico adicional de 25 ml.
6. Añadir la cantidad de solución de stock del compuesto de ensayo necesario para alcanzar las concentraciones deseadas al matraz volumétrico de 25 ml. No agregue una solución de stock al control.
7. Añadir el medio a cada matraz volumétrico de 25 ml para alcanzar un volumen de aproximadamente 20 ml.
8. Añadir el volumen de inóculo calculado en el paso 3.3 a cada matraz volumétrico de 25 ml. Añadir el medio a cada matraz volumétrico de 25 ml a un volumen total final de 25 ml.
9. Tape los matraces y mezcle bien girando los matraces dos veces verticalmente.
10. Transfiera 0,4 ml de cada matraz a viales de tapones de tornillo individuales y añada 1,6 ml de acetona (saturada con MgCO_3):una muestra para cada concentración de ensayo y el control. Cierre bien las tapas y guárdelas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las mediciones de fluorescencia (sección 4).
11. Pipet 4 ml de cada solución de ensayo en viales de centelleo de 20 ml (3 réplicas por concentración y 5 réplicas para el control). Tapa de tornillo en los viales de centelleo. Recuerde que las tapas deben tener un orificio perforado (aproximadamente 1 mm de diámetro) para permitir el intercambio de_CO2.
12. Después de 24 h, 48 h y 72 h, pipetear 0,4 ml de cada vial en viales de tapón de tornillo y añadir 1,6 ml de acetona (saturado con MgCO₃). Cierre bien las tapas y guárdelas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las mediciones de fluorescencia (sección 4).
13. Después de tomar la última muestra a 72 h, aduique suavemente las tres réplicas para una concentración dada en un vial y mida el pH. Repita el proceso para todas las concentraciones y el control. El pH no debe desviarse más de 1,5 unidades del pH inicial para cualquiera de las muestras medidas.
14. Descargue los líquidos restantes en un contenedor de residuos siguiendo sus normas y reglamentos institucionales.

4. Análisis de muestras de pruebas de algas

1. Utilice un espectrofotómetro de fluorescencia para medir la biomasa de algas (aquí expresada como clorofila A). La emisión máxima de clorofila A es de 420 nm para la longitud de onda de excitación y de 671 nm para la longitud de onda de emisión.
2. Mida la fluorescencia de cada muestra individual tres veces y calcule el valor medio de cada muestra.
3. Utilice la ecuación 1 para calcular la tasa de crecimiento. La fluorescencia medida (unidades relativas) se puede utilizar directamente como parámetro de biomasa en la ecuación 1.
   Ecuación 1: μ (ln N_t – ln N₀) / t
   donde μ es la tasa de crecimiento (d^-1), N₀ es la biomasa inicial, N_t es la biomasa en el momento t, y t es la duración del período de prueba (d). Nota, N₀ y N_t deben expresarse en la misma unidad.
4. Utilice un software estadístico para ajustar una curva de regresión no lineal (por ejemplo, una función log-logística o Weibull) a los datos de la tasa de crecimiento para obtener valores de concentración efectivos en una inhibición del 10%, 20% y 50%. En la información complementaria se proporciona un ejemplo de código para el ajuste en el software estadístico R utilizando el paquete^{DRC 11.}

Resultados

Se lleva a cabo un ensayo inicial con una sustancia de referencia para determinar la sensibilidad de la cepa de algas. Las sustancias de referencia utilizadas regularmente para R. subcapitata son el dicromato de potasio y 3,5-Diclorfenol^7,8. La Figura 3 y la Tabla 2 muestran un resultado representativo de una prueba de algas que incluye ajuste de curva y resultados estadísticos cuando el paquete de la RDC e...

Discusión

El fitoplancton convierte la energía solar y el dióxido de carbono en materia orgánica y, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en el ecosistema acuático. Por esta razón, las pruebas de inhibición de la tasa de crecimiento de algas se incluyen como una de las tres pruebas de toxicidad acuática obligatorias necesarias para la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. La capacidad de realizar un ensayo de toxicidad de algas fiable y reproducible es clave a este respecto. Las configurac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086