单细胞基因组应用的脂肪组织核分离

摘要

本出版物描述了从成熟的副细胞分离核、通过荧光激活排序和单细胞级转录学进行纯化的协议。

摘要

棕色和米色脂肪是专门脂肪组织，通过UCP1（非耦合蛋白-1）依赖和独立途径来散热生成的能量。直到最近，热源性副成物一直被认为是同质种群。然而，最近的研究表明，在发育起源、基质使用和转录中，存在多种亚型或亚种。尽管单细胞基因组学有所进步，但由于脂质填充的脂肪细胞的脆弱特性，脂肪组织的无偏分解到细胞亚型一直具有挑战性。提出的协议是通过有效分离脂肪组织中的单核来规避这些障碍的，用于下游应用，包括RNA测序。然后，通过RNA测序和生物信息分析，可以分析细胞异质性。

引言

研究表明，棕色脂肪组织（BAT）具有显著的能量消散能力。两种具有明显发育特征的热源类细胞存在于啮齿动物和人类中:米色副成细胞和经典的棕色副成。虽然传统的棕色副细胞大多位于闭塞性 BAT 仓库，而米色副细胞偶尔会出现在白色脂肪组织（ WAT ）中，以回应某些生理线索，如慢性冷暴露，这个过程被称为棕色或。通过先进的成像技术，现在很明显，成年人类有大量的^UCP1+BAT库，特别是在超视镜区域^{1，2，3，4。2,3,41}成人BAT的量与脂肪发生反向关联，可以通过外部线索增加，如慢性冷暴露^55、66或β3-肾上腺素受体激动剂^7。BAT介导的能源支出可能为对抗肥胖提供可行的方法。

直到最近，热源性副成物一直被认为是同质种群。然而⁸，研究表明存在多种亚型或亚群，它们在发育起源、基质使用和转录^{8、9、109,10}方面是不同的。例如，^{最近描述的是}一种优先使用葡萄糖进行热能生成的米色阿迪波细胞，即g-beigeadipocyte。对棕色和米色脂肪组织中细胞类型的不完全了解以及缺乏特定标记是研究其生物功能的关键障碍。

分离细胞亚群的传统方法仅以少数已知标记基因的表达为基础。单细胞基因组学的最新进展使单细胞的全球基因表达数据得以对组织中的亚种群数量进行公正的估计。该协议的最终目标是以单细胞分辨率确定各种热源刺激下的所有脂肪组织亚型。与其他组织和细胞类型相比，由于脂质填充的脂肪细胞的脆弱性，确定脂肪组织的细胞亚型具有挑战性。本文介绍了一种从脂肪组织中分离单核的可靠协议，用于下游snRNA测序的下游应用。重要的是，最近比较匹配良好的单核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集的文献显示，snRNA-seq在细胞类型检测中与scRNA-seq相当，在细胞类型检测中具有卓越的细胞覆盖率，如大脑¹¹等复杂组织的细胞覆盖率。该协议将罗森等人为脂肪组织优化的密度梯度离心^方法与MoFlo XDP高速分拣机核"清理"步骤相结合。正如代表结果所示，对小鼠间棕色脂肪组织7，500个单核的分析，确定了看似同质的棕色副细胞中的多种细胞类型。总体而言，这种简单而健壮的协议可用于研究副细胞和脂肪驻留细胞的组织级组织、亚型特异性标记基因的鉴定以及脂肪选择性敲除/转基因小鼠的发展平量。

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研究方案

动物护理和实验是按照阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行的。

1. 组织消化和解功能缓冲液的制备

1. 准备组织消化缓冲液。
   1. 准备每克脂肪组织的消化缓冲液±1 mL。
   2. 称重 1.5 U/mL 胶原酶 D 和 2.4 U/mL 脱毛二酯 II，并加入磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
2. 制备核制备缓冲液（NPB）。
   1. 制备 10 mM HEPES、1.5 mM 氯化镁、10 mM 氯化钾、250 mM 蔗糖和无核酸水中的 0.1% NP-40。混合好。与其他组件相比，蔗糖的溶解时间可能更多。
3. 准备0.5%牛血清白蛋白（BSA）溶液。
   1. 在含有EDTA的PBS中制备0.5%BSA。建议使用无菌过滤细胞培养等级PBS（参见材料表）。

2. 脂肪组织的酶消化

1. 根据Aune等人¹³日，对小鼠进行解剖，以提取脂肪组织。收集含有PBS的盘子中的分离组织。将纸巾转移到纸巾上，以拍干。然后把纸巾放在干净的盘子里。
2. 将氯化钙添加到消化缓冲液中，最终浓度为10 mM。在盘中加入少量消化缓冲液，彻底切碎脂肪组织。所需的消化缓冲液量将基于分离的组织量。通常使用 ±1 mL 或更少。
3. 将准备消化缓冲液（例如，五只小鼠的10mL）约一半添加到切碎的组织中。使用血清学移液器，将样品转移到50mL锥形离心管。加入任何剩余的缓冲液以洗碗，并转移到包含样品的50 mL管。上下移液几次。然后在37°C下以200-210 rpm的颤抖孵育12-15分钟。

3. 阿迪波细胞隔离

1. 孵育后，以1:1的比例与样品加0.5%BSA。通过上下移液几次来混合好。在室温 （RT） 下，将样品在 300 x g下离心 5 分钟，以向下旋转基质血管分数 （SVF）。邻细胞分数将保留在样品的顶层。
2. 将 40 μm 电池过滤器放在 50 mL 锥形离心管顶部，并过滤样品，收集顶层，并将 SVF 留在管的底部。通过将过滤器倒置在管上，并使用 0.5% BSA 反向清洗过滤器并在管中收集样品，将顶层（副细胞分数）转移到新管中。
3. 根据样品尺寸将 0.5% BSA 的总体积提高到 10-15 mL，使用血清移液器上下移液器，或短暂上下摇动以混合样品。在 RT 时，在 300 x g下再次将样品离心 5 分钟。

4. 核隔离

1. 使用宽孔移液器尖端，小心地将样品的顶层转移到放置在冰上新预冷管顶部的 100 μm 细胞过滤器上，留下任何残留的 SVF。
2. 用足够量的 NPB 冲洗/冲洗滤清器并丢弃滤清器。从这一步开始，尽可能经常地将样品放在冰上，并快速工作，以避免核泄漏和/或不健康。预冷微离心管可用于将来的冰上步骤中是有帮助的。
3. 将样品放在冰上不超过 2 分钟，间歇性地轻轻反转管子以混合。冰上的孵育时间应针对样本大小和邻细胞类型进行优化。在 4 °C 下在 1，000 x g下离心 10 分钟。
4. 取出上清液，在 NPB 的 1 mL 中重新悬浮颗粒。将样品转移到干净的微离心管中。转移时，避免接触管壁，管壁包含碎屑和脂质。将 0.6 U/μL RNase 抑制剂添加到样品中并混合。在 4 °C 下再次以 1，000 x g的离心机 10 分钟。
   注:对于较小的样品，此步骤应降低离心速度和时间。
5. 去除上清液，重新悬浮在1 mL的核洗涤缓冲液（2%BSA/PBS = 0.6 U/μL RNase抑制剂）。
6. 使用可堆叠的 30 μm 过滤器将双滤芯双滤成清洁管。用小体积（±300 μL）的核洗涤缓冲液清洗过滤器。或者，对于较小的样品，使用适合微离心管的 30 μm 过滤器，然后直接过滤到其中。
7. 确认健康核分离成功。
   1. 用锥色来染色样本的小等位，并使用自动细胞计数器来评估平均死大小和死细胞百分比。含有大部分核的样品的平均死大小应在7-10μm之间。核大小通常在8μm左右。
   2. 使用 DAPI 染色样品的小等位，并在显微镜下以 20 倍或更高的目标进行检查。核膜应完好无损，核应圆。

5. FACS 清理和核浓缩步骤

1. 立即进入 FACS 步骤，以清理核并清除任何多余的碎屑。集合缓冲区应包含核洗涤缓冲区。在 FACS 期间，缓冲液被稀释。制备更高浓度的BSA和RNase抑制剂，以考虑分拣过程中的稀释是有帮助的。FACS 收集块应处于冷却模式。
2. 分拣核后，在500 x g下离心5分钟，在4°C下浓缩样品。在适当体积的核洗涤缓冲液中重组，达到500-1，500核/μL的浓度。不要尝试删除所有上清液。这样做将导致核损失。
3. 使用血细胞计和DAPI染色等位物进行最终计数，并可视化核。然后根据制造商的协议立即使用 snRNA-seq。

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结果

未分类的邻细胞核含有碎片和双细胞，在下游单细胞RNA测序中产生噪声和高背景。代表 FACS 门策略如图1所示。首先根据正向散射 （FSC） 和侧散点 （SSC）（A） 选择原子核，然后，仅根据 SSC（B） 的宽度和高度组合选择单点。最后，只选择 DAPI 阳性事件并将其分类到集合缓冲区（C） 中。此工作流提供高度纯化?...

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讨论

提出了一种分离单核和研究脂肪组织异质性的方法。与整个组织RNA测序相比，该工作流程提供了细胞异质性和种群特异性标记的无偏见视图。这对推进脂肪细胞生物学、分子代谢和肥胖研究具有重要意义和创新。

该协议特别针对 snRNA-seq 的下游应用进行了优化。"清理"步骤，以实现与MoFlo XDP高速分拣机分离健康核，完全去除碎片和骨料从粗悬浮液，同时保持核膜的完整性。因?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA	Sigma	A1595
CaCl2	Sigma	21115
Cell filter 100 μm	Corning	431752
Cell filter 40μm	Corning	431750
CellTrics (30 μm)	Sysmex	04-004-2326
Collagenase D	Roche	11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
DAPI	Sigma	D9542
Dispase II	Roche	4942078001
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Fisher	P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458	Stackable filters
MgCl2	Sigma	M1028
MoFloXDP Cell Sorter	Beckman Coulter	ML99030
NP-40	Sigma	74385
Protector RNase Inhibitor	Roche	3335402001
Sucrose	Fisher	S5-3