Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Resumo

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Resumo

A gordura marrom e bege são tecidos adiposos especializados que dissipam energia para termogênese pela UCP1 (Uncoupling Protein-1) -dependent and independent pathways. Até recentemente, os adipócitos termogênicos eram considerados uma população homogênea. No entanto, estudos recentes indicaram que existem múltiplos subtipos ou subpopulações que são distintos na origem do desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome. Apesar dos avanços na genômica unicelular, a decomposição imparcial dos tecidos adiposos em subtipos celulares tem sido desafiadora devido à natureza frágil dos adipócitos preenchidos com lipídios. O protocolo apresentado foi desenvolvido para contornar esses obstáculos pelo isolamento efetivo de núcleos únicos do tecido adiposo para aplicações a jusante, incluindo sequenciamento de RNA. A heterogeneidade celular pode então ser analisada por sequenciamento de RNA e análises bioinformáticas.

Introdução

Estudos mostraram que o tecido adiposo marrom (BAT) tem uma capacidade notável de dissipar energia. Dois tipos de adipócitos termogênicos com características distintas do desenvolvimento existem tanto em roedores quanto em humanos: adipócitos bege e adipócitos marrons clássicos. Enquanto os adipócitos marrons clássicos estão localizados principalmente em depósitos de BAT interscapulares, adipócitos beges emergem esporadicamente em tecido adiposo branco (WAT) em resposta a certos sinais fisiológicos, como exposição ao frio crônico, um processo chamado de "browning" ou "beiging". Através do uso de imagens avançadas, agora está claro que os seres humanos adultos possuem depósitos substanciais de UCP1⁺ BAT, especialmente na região supraclavicular^1,,2,,3,4. A quantidade de BAT humano adulto se correlaciona inversamente com adiposidade e pode ser aumentada por pistas externas, como exposição ao frio crônico^5,,6 ou β3-adrenergic receptor agonista⁷. O gasto energético mediado pelo BAT pode oferecer uma abordagem viável para combater a obesidade.

Até recentemente, os adipócitos termogênicos têm sido considerados uma população homogênea. No entanto, estudos revelaram a existência de múltiplos subtipos ou subpopulações distintas em origem desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome^8,,9,,10. Por exemplo, um tipo de adipócito bege que usa preferencialmente glicose para termogênese, o adipócito g-bege, foi recentemente descrito¹⁰. A compreensão incompleta dos tipos celulares no tecido adiposo marrom e bege e a falta de marcadores específicos constituem uma barreira crítica para estudar suas funções biológicas.

Os métodos tradicionais para isolar subpopulações de células são baseados na expressão de apenas alguns genes marcadores conhecidos. Os recentes avanços na genômica unicelular permite o uso de dados globais de expressão genética de células únicas para fornecer uma estimativa imparcial do número de subpopulações em um tecido. O objetivo final deste protocolo é determinar todos os subtipos de tecido adiposo sob vários estímulos termogênicos em uma resolução unicelular. Em contraste com outros tecidos e tipos celulares, determinar subtipos celulares de tecido adiposo é desafiador devido à fragilidade dos adipócitos preenchidos com lipídios. Este artigo introduz um protocolo robusto para isolar núcleos únicos do tecido adiposo para aplicação a jusante ao sequenciamento snRNA. É importante ressaltar que a literatura recente comparando o sequenciamento de RNA uninuclei bem combinado (snRNA-seq) e os conjuntos de dados de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) revelaram que o snRNA-seq é comparável ao scRNA-seq na detecção do tipo celular e superior na cobertura celular para um tecido complexo como o cérebro¹¹. Este protocolo combina um método de centrifugação de gradiente de densidade otimizado para tecidos adiposos por Rosen et al.¹² com um passo de "limpeza" de núcleos com um Sorter de Alta Velocidade MoFlo XDP. Como visto nos resultados representativos, uma análise de 7.500 núcleos únicos do tecido adiposo marrom interscapular do rato identificou vários tipos de células dentro de adipócitos marrons aparentemente homogêneos. No geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização de nível tecidual de adipócitos e células residentes de adiposos, identificação de genes marcadores específicos do subtipo e fenotipagem de desenvolvimento de camundongos eliminatórios/transgênicos adiposos.

Protocolo

O cuidado e a experimentação em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.

1. Preparação de tampões de digestão tecidual e lise

1. Prepare o tampão de digestão do tecido.
   1. Prepare ~1 mL de tampão de digestão para cada grama de tecido adiposo.
   2. Pesar 1,5 U/mL colagenase D e 2,4 U/mL dispase II e adicionar soro fisiológico tamponado fosfato (PBS).
2. Prepare o tampão de preparação dos núcleos (NPB).
   1. Prepare 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, cloreto de potássio de 10 mM, 250 mM de sacarose e 0,1% NP-40 em água sem nuclease. Misture bem. A sacarose pode levar mais tempo para se dissolver do que os outros componentes.
3. Prepare 0,5% solução de gérico bovino (BSA).
   1. Prepare 0,5% BSA em PBS contendo EDTA. Recomenda-se o uso de PBS de cultura celular filtrada estéril (ver Tabela de Materiais).

2. Digestão enzimática do tecido adiposo

1. Dissecar camundongos para extrair tecido adiposo de acordo com Aune et al.¹³. Coletar tecido isolado em um prato contendo PBS. Transfira o tecido para uma toalha de papel para secar. Em seguida, coloque o tecido em um prato limpo.
2. Adicione cloreto de cálcio ao tampão de digestão a uma concentração final de 10 mM. Adicione um pequeno volume de tampão de digestão ao prato e pique completamente o tecido adiposo. O volume do tampão de digestão necessário será baseado na quantidade de tecido isolado. Normalmente ~ 1 mL ou menos é usado.
3. Adicione cerca de metade da quantidade de tampão de digestão preparado (por exemplo, ~10 mL para cinco camundongos) ao tecido picado. Usando uma pipeta sorológica, transfira a amostra para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Adicione qualquer quantidade restante de tampão para lavar o prato e transfira para o tubo de 50 mL contendo a amostra. Pipeta para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, incubar com agitação a 200-210 rpm a 37 °C para 12-15 min.

3. Isolamento adipócito

1. Após a incubação, adicione 0,5% de BSA a uma proporção de 1:1 para a amostra. Misture bem por pipetting para cima e para baixo várias vezes. Centrifugar a amostra a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) para girar a fração vascular estromada (SVF). A fração de adipócito permanecerá na camada superior da amostra.
2. Coloque um filtro de célula de 40 μm em cima de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e filtre a amostra, coletando a camada superior e deixando para trás o SVF na parte inferior do tubo. Transfira a camada superior (fração de adipócito) para um novo tubo, virando o filtro de cabeça para baixo sobre o tubo e usando 0,5% de BSA para lavar o filtro e coletar a amostra no tubo.
3. Leve o volume total de 0,5% BSA a 10-15 mL com base no tamanho da amostra e pipeta para cima e para baixo com uma pipeta sorológica ou agite brevemente para cima e para baixo para misturar a amostra. Centrifugar a amostra novamente a 300 x g por 5 min no RT.

4. Isolamento dos núcleos

1. Use uma ponta de pipeta de furo largo e transfira cuidadosamente a camada superior da amostra para um filtro de célula de 100 μm colocado em cima de um novo tubo pré-filhinho no gelo, deixando para trás qualquer SVF residual.
2. Enxágüe/lave o filtro com uma quantidade suficiente de NPB e descarte o filtro. A partir deste passo em frente tem a amostra no gelo o mais frequentemente possível e trabalhar rapidamente para evitar núcleos vazando e/ou insalubres. É útil para pré-gelo microcentrifugar tubos para serem usados em passos futuros no gelo.
3. Coloque a amostra no gelo por não mais do que 2 minutos com a inversão suave intermitente do tubo para misturar. O tempo de incubação no gelo deve ser otimizado para o tamanho da amostra e o tipo de adipócitos. Centrifugar a 1.000 x g a 4 °C por 10 min.
4. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de NPB. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuagem limpo. Durante a transferência, evite tocar nas paredes do tubo, que contêm detritos e lipídios. Adicione 0,6 U/μL Inibidor de RNase à amostra e misture. Centrifugar novamente a 1.000 x g a 4 °C por 10 min.
   NOTA: A velocidade e o tempo de centrifugação devem ser diminuídos nesta etapa para amostras menores.
5. Remova o supernasciente e resuspend em 1 mL de Tampão de Lavagem Nuclei (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL RNase inibidor).
6. Filtro duplo em um tubo limpo com filtros empilháveis de 30 μm. Lave o filtro com um pequeno volume (~300 μL) de Nuclei Wash Buffer. Alternativamente, para amostras menores, use um filtro de 30 μm que se encaixe em um tubo de microcentrifuuagem e filtre diretamente nele.
7. Confirme o isolamento bem sucedido de núcleos saudáveis.
   1. Manche uma pequena alíquota da amostra com tripano e use um contador de células automatizado para avaliar o tamanho médio dos mortos e por cento das células mortas. O tamanho médio morto para uma amostra contendo principalmente núcleos deve variar entre 7-10 μm. O tamanho dos núcleos é geralmente em torno de 8 μm.
   2. Colorique uma pequena alíquota da amostra com DAPI e examine sob um microscópio com um objetivo de 20x ou superior. A membrana nuclear deve estar intacta e os núcleos devem estar redondos.

5. ETAPA DE limpeza e concentração de núcleos FACS

1. Proceda imediatamente ao passo FACS para limpar núcleos e remover quaisquer detritos em excesso. O buffer de coleta deve conter o tampão de lavagem dos núcleos. Durante o FACS, o buffer é diluído. Preparar uma maior concentração de inibidor de BSA e RNase para explicar a diluição durante a triagem é útil. O bloco de coleta FACS deve estar no modo de resfriamento.
2. Após a triagem dos núcleos, centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C para concentrar a amostra. Reconstituir em um volume apropriado de Buffer de Lavagem de Núcleos para alcançar uma concentração de 500-1.500 núcleos/μL. Não tente remover todo o supernatante. Isso resultará na perda de núcleos.
3. Use um hemócito e uma alíquota manchada de DAPI para uma contagem final e para visualizar os núcleos. Em seguida, proceda imediatamente com snRNA-seq de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

Núcleos adipócitos não variados contêm detritos e doublets que criam ruído e fundo alto no sequenciamento de RNA de célula única a jusante. A estratégia representativa do portão FACS é mostrada na Figura 1. Os núcleos foram selecionados primeiro com base na dispersão dianteira (FSC) e dispersão lateral (SSC) (A),depois, apenas singlets foram selecionados com base na combinação de largura e alturas de SSC (B). F...

Discussão

Um método simples e robusto para isolar núcleos únicos e estudar a heterogeneidade do tecido adiposo é apresentado. Comparado ao sequenciamento de RNA de tecido inteiro, este fluxo de trabalho oferece uma visão imparcial da heterogeneidade celular e marcadores específicos da população. Isso é significativo e inovador para o avanço da biologia adipócito, metabolismo molecular e pesquisa sobre obesidade.

Este protocolo é particularmente otimizado para a aplicação a jusante de snRNA...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA	Sigma	A1595
CaCl2	Sigma	21115
Cell filter 100 μm	Corning	431752
Cell filter 40μm	Corning	431750
CellTrics (30 μm)	Sysmex	04-004-2326
Collagenase D	Roche	11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
DAPI	Sigma	D9542
Dispase II	Roche	4942078001
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Fisher	P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458	Stackable filters
MgCl2	Sigma	M1028
MoFloXDP Cell Sorter	Beckman Coulter	ML99030
NP-40	Sigma	74385
Protector RNase Inhibitor	Roche	3335402001
Sucrose	Fisher	S5-3