JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Özet

Kahverengi ve bej yağ UCP1 (Uncoupling Protein-1) bağımlı ve bağımsız yollar tarafından termogenez için enerji dağıtmak özel yağ dokuları vardır. Yakın zamana kadar, termojenik adipositler homojen bir popülasyon olarak kabul edildi. Ancak, son çalışmalar, gelişimsel köken, substrat kullanımı ve transkripsiyon olarak farklı birden fazla alt tip veya alt popülasyon olduğunu göstermiştir. Tek hücreli genomik gelişmelere rağmen, yağ dokularının hücre alt tiplerine tarafsız ayrışması lipid dolu adipositlerin kırılgan doğası nedeniyle zor olmuştur. Sunulan protokol, rna dizilimi de dahil olmak üzere, aşağı akım uygulamaları için yağ dokusundan tek çekirdeklerin etkili bir şekilde izole edilerek bu engelleri aşmak için geliştirilmiştir. Hücresel heterojenlik daha sonra RNA dizilimi ve biyoinformatik analizler ile analiz edilebilir.

Giriş

Çalışmalar kahverengi yağ dokusu (BAT) enerji dağıtmak için dikkate değer bir kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir. Farklı gelişimsel özelliklere sahip iki tip termojenik adiposit ler hem kemirgenlerde hem de insanlarda bulunur: bej adipositler ve klasik kahverengi adipositler. Klasik kahverengi adipositler çoğunlukla interscapular BAT depolarında bulunurken, bej adipositler kronik soğuk maruziyet, "esmerleme" veya "beiging" olarak adlandırılan bazı fizyolojik ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda (WAT) düzensiz olarak ortaya çıkarlar. Gelişmiş görüntüleme kullanımı sayesinde, yetişkin insanların ucp1 önemli depolar olduğu açıktır+ BAT, özellikle supraclavicular bölgede1,2,3,4. Yetişkin insan BAT miktarı ters yağ oranı ile ilişkilidir ve kronik soğuk maruziyet5,,6 veya β3-adrenerjik reseptör agonist7gibi dış ipuçları ile artabilir. BAT aracılı enerji harcamaları obezite ile mücadele için uygun bir yaklaşım sunabilir.

Yakın zamana kadar, termojenik adipositler homojen bir popülasyon olarak kabul edilmiştir. Ancak, çalışmalar gelişimsel kökenli farklı birden fazla alt tip veya alt popülasyonların varlığını ortaya koymuştur, substrat kullanımı, ve transkripsiyon8,9,10. Örneğin, tercihen termogenez için glikoz kullanan bej adiposit bir tür, g-bej adiposit, son zamanlarda tarif edildi10. Kahverengi ve bej yağ dokusundaki hücre tiplerinin eksik anlaşılması ve spesifik belirteçlerin olmaması biyolojik işlevlerinin incelenmesi için kritik bir engel oluşturmaktadır.

Hücrelerin alt popülasyonlarını yalıtma amaçlı geleneksel yöntemler, bilinen sadece birkaç marker geninin ekspresyonuna dayanır. Tek hücreli genomikteki son gelişmeler, tek hücreli küresel gen ekspresyonu verilerinin kullanılmasını sağlayarak bir dokudaki alt popülasyon sayısının tarafsız bir tahminini sağlar. Bu protokolün nihai amacı, tek hücreli çözünürlükte çeşitli termojenik uyaranlar altında tüm yağ dokusu alt tiplerini belirlemektir. Diğer doku ve hücre tiplerinin aksine, yağ dokusunun hücresel alt tiplerini belirlemek lipid dolu adipositlerin kırılganlığı nedeniyle zordur. Bu kağıt, tek çekirdekleri yağ dokusundan aşağı akım uygulamasına ve snRNA dizilimine izole etmek için sağlam bir protokol sunar. Daha da önemlisi, iyi eşleşen tek çekirdekli RNA sıralama (snRNA-seq) ve tek hücreli RNA sıralama (scRNA-seq) veri setleri karşılaştıran son literatür snRNA-seq hücre tipi algılama scRNA-seq karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koymuştur, ve beyin gibi karmaşık bir doku için hücresel kapsama üstün11. Bu protokol, Rosen ve ark.12 tarafından yağ dokuları için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüj yöntemini Bir MoFlo XDP Yüksek Hızlı Sorter ile bir çekirdek "temizleme" adımı ile birleştirir. Temsili sonuçlarda görüldüğü gibi, fare interscapular kahverengi yağ dokusundan 7.500 tek çekirdek analizi görünüşte homojen kahverengi adipositler içinde birden fazla hücre tipi tespit. Genel olarak, bu basit ve sağlam protokol, adipositlerin ve yağ-yerleşik hücrelerin doku düzeyinde organizasyonu, alt tipe özgü marker genlerinin tanımlanması ve yağ seçici nakavt/transgenik farelerin gelişim fenomeniinin incelenmesi için uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre hayvan bakımı ve deneyleri gerçekleştirildi.

1. Doku sindirim ve lysis tamponlarının hazırlanması

  1. Doku sindirim tamponu hazırlayın.
    1. Yağ dokusunun her gramı için ~1 mL sindirim tamponu hazırlayın.
    2. Tartmak 1.5 U / mL kollajenaz D ve 2.4 U / mL dispase II ve fosfat tamponlu salin ekleyin (PBS).
  2. Çekirdek hazırlama tamponu (NPB) hazırlayın.
    1. 10 mM HEPES, 1,5 mM magnezyum klorür, 10 mM potasyum klorür, 250 mM sakaroz ve %0,1 NP-40 çekirdeksiz suda hazırlayın. İyi bir şekilde karıştırın. Sakarozun çözülmesi diğer bileşenlerden daha fazla zaman alabilir.
  3. %0.5 büyükbaş serum albumin (BSA) çözeltisi hazırlayın.
    1. EDTA içeren PBS'de %0,5 BSA hazırlayın. Steril filtrelenmiş hücre kültürü sınıfı PBS kullanılması önerilir (bkz. Malzeme Tablosu).

2. Yağ dokusunun enzimatik sindirimi

  1. Aune ve ark.13'egöre yağ dokusu çıkarmak için fareleri inceleyin. PBS içeren bir çanak izole doku toplamak. Kuruması için dokuyu kağıt havluya aktarın. Sonra temiz bir tabak içinde doku yerleştirin.
  2. 10 mM'lik son konsantrasyona sindirim tamponuna kalsiyum klorür ekleyin. Çanak sindirim tampon küçük bir hacim ekleyin ve iyice yağ dokusu kıyma. Gerekli sindirim tampon hacmi izole doku miktarına göre olacaktır. Genellikle ~1 mL veya daha az kullanılır.
  3. Kıymalı dokuya hazırlanan sindirim tamponu miktarının yaklaşık yarısını (örneğin, beş fare için ~10 mL) ekleyin. Serolojik pipet kullanarak, numuneyi 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Yemeği yıkamak için kalan tampon miktarını ekleyin ve numuneyi içeren 50 mL'lik tüpe aktarın. Pipet birkaç kez yukarı ve aşağı. Daha sonra 12-15 dakika boyunca 37 °C'de 200-210 rpm sallayarak inkübte.

3. Adiposit izolasyonu

  1. Kuluçkadan sonra numuneye 1:1 oranında %0,5 BSA ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Stromal vasküler fraksiyonu (SVF) aşağı spin oda sıcaklığında (RT) 5 dakika için 300 x g örnek santrifüj. Adiposit fraksiyonu örneğin üst katmanında kalır.
  2. 50 mL'lik konik santrifüj tüpünün üzerine 40 m'lik bir hücre filtresi yerleştirin ve üst katmanı toplayarak ve tüpün altındaki SVF'yi geride bırakarak numuneyi filtreleyin. Filtreyi tüpün üzerine ters çevirerek ve filtreyi ters yıkamak ve numuneyi tüpte toplamak için %0,5 BSA kullanarak üst katmanı (adiposit fraksiyonu) yeni bir tüpe aktarın.
  3. Numune boyutuna ve pipete göre %0,5 BSA'lık toplam hacmi serolojik pipetle yukarı ve aşağı doğru 10-15 mL'ye getirin veya numuneyi karıştırmak için kısa bir süre çalkalayın. Numuneyi rt'de 5 dk için 300 x g'da tekrar santrifüj edin.

4. Çekirdek izolasyonu

  1. Geniş delikli bir pipet ucu kullanın ve numunenin üst tabakasını buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş tüpün üzerine yerleştirilen 100 μm hücreli filtreye dikkatlice aktarın ve geriye kalan SVF'yi geride bırak.
  2. Filtreyi yeterli miktarda NPB ile durula/yıkayın ve filtreyi atın. Bu adımdan itibaren mümkün olduğunca sık buz üzerinde örnek var ve sızıntılı ve / veya sağlıksız çekirdekleri önlemek için hızlı bir şekilde çalışır. Bu buz üzerinde gelecekteki adımlarda kullanılmak üzere prechill mikrosantrifüj tüpler için yararlıdır.
  3. Karıştırmak için tüp aralıklı nazik ters ile en fazla 2 dakika buz üzerinde örnek yerleştirin. Buzdaki kuluçka süresi örnek boyutu ve adiposit tipi için optimize edilmelidir. 10 dk için 4 °C'de 1.000 x g santrifüj.
  4. Supernatant çıkarın ve NPB 1 mL pelet resuspend. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarırken, enkaz ve lipid içeren tüp, duvarlara dokunmaktan kaçının. Numuneye 0,6 U/μL RNase inhibitörü ekleyin ve karıştırın. 10 dk için 4 °C'de 1.000 x g tekrar santrifüj.
    NOT: Daha küçük numuneler için bu adımda santrifüj hızı ve zamanı azaltılmalıdır.
  5. 1 mL'lik Nüklei Yıkama Tamponu'nda süpernatantı çıkarın ve yeniden askıya alın (%2 BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibitörü).
  6. Istiflenebilir 30 μm filtreleri ile temiz bir tüp içine çift filtre. Küçük hacimli (~300 μL) Çekirdek yıkama Tamponu ile filtreyi yıkayın. Alternatif olarak, daha küçük numuneler için mikrosantrifüj tüpüne sığan 30 μm'lik bir filtre kullanın ve doğrudan filtre uygulayın.
  7. Sağlıklı çekirdeklerin başarılı bir şekilde izole edilebiyi onaylayın.
    1. Deneyin küçük bir aliquot trypan ile leke ve ortalama ölü boyutu ve yüzde ölü hücreleri değerlendirmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Çoğunlukla çekirdek içeren bir numunenin ortalama ölü boyutu 7-10 μm arasında olmalıdır.
    2. Dapi ile numunenin küçük bir aliquot leke ve 20x hedefi veya daha yüksek bir mikroskop altında inceleyin. Nükleer zar sağlam olmalı ve çekirdekler yuvarlak olmalıdır.

5. FACS temizleme ve çekirdek konsantrasyonu adımı

  1. Çekirdekleri temizlemek ve herhangi bir fazla enkaz kaldırmak için FACS adım hemen devam edin. Toplama tamponu Nuclei Wash Tampon içermelidir. FACS sırasında arabellek seyreltilir. Sıralama sırasında seyreltme için daha yüksek bir BSA ve RNase inhibitörü konsantrasyonu hazırlanması yararlıdır. FACS toplama bloğu soğutma modunda olmalıdır.
  2. Çekirdekleri sıraladıktan sonra, numuneyi yoğunatmak için 5 00x g'de 5 dk 4 °C'de santrifüj. 500-1.500 çekirdek/μL konsantrasyonu elde etmek için uygun bir hacimde Çekirdek Yıkama Tamponu yeniden oluşturun. Tüm supernatant kaldırmaya çalışmayın. Bunu yapmak çekirdek kaybına neden olur.
  3. Son sayım için hemositometre ve DAPI lekeli aliquot kullanın ve çekirdekleri görselleştirin. Daha sonra üreticinin protokolüne göre hemen snRNA-seq ile devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sıralanmamış adiposit çekirdekleri, tek hücreli RNA sıralamasında gürültü ve yüksek arka plan oluşturan enkaz ve doublets içerir. Temsili FACS kapı stratejisi Şekil 1'degösterilmiştir. Çekirdekler ilk olarak ileri dağılım (FSC) ve yan dağılıma(SSC) (A)göre seçilmiştir, daha sonra, ssc(B)genişliği ve yüksekliklerinin birleşimine göre sadece singlet'ler seçilmiştir. Son olarak, yalnızca DAPI p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Tek çekirdekleri izole etmek ve yağ dokusu heterojenliğini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sunulmuştur. Tüm doku RNA dizile karşılaştırıldığında, bu iş akışı hücresel heterojenite ve popülasyona özgü belirteçlerin tarafsız bir görünümünü sunar. Bu önemli ve adiposit biyoloji, moleküler metabolizma ve obezite araştırma gelişimi için yenilikçi.

Bu protokol özellikle snRNA-seq downstream uygulaması için optimize edin. MoFlo XDP Yüksek Hızlı So...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

Albert Einstein Genomik çekirdeğinden David Reynolds'a ve Flow Sitometri Çekirdeği'nden Jinghang Zhang'a teknik destek için teşekkür ederiz. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (DK110426) ve Einstein-Mount Sinai Diyabet Araştırma Merkezi (DK020541) ve New York Obezite Araştırma Merkezi'nden (DK026687) (hepsi K.S.'e) pilot ve fizibilite hibelerinden destek kabul ediyoruz. Biz de albert Einstein Kanser Merkezi (CA013330) çekirdek desteği için teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222PBS with EDTA; sterile-filtered
BSASigmaA1595
CaCl2Sigma21115
Cell filter 100 μmCorning431752
Cell filter 40μmCorning431750
CellTrics (30 μm)Sysmex04-004-2326
Collagenase DRoche11088866001
Countess II FL Automated Cell CounterInvitrogenAMQAF1000
DAPISigmaD9542
Dispase IIRoche4942078001
HEPESSigmaH4034
KClFisherP217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458Stackable filters
MgCl2SigmaM1028
MoFloXDP Cell SorterBeckman CoulterML99030
NP-40Sigma74385
Protector RNase InhibitorRoche3335402001
SucroseFisherS5-3

Referanslar

  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  3. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  4. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
  5. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  6. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  7. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  8. Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
  9. Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
  10. Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
  11. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648(2018).
  12. Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  13. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  15. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
  16. Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619(2018).
  17. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
  18. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  19. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 160adiposittermogenezdiyabetgenomikbiyokimyametabolizma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır