Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires

Résumé

Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.

Résumé

Les graisses brunes et beiges sont des tissus adipeux spécialisés qui dissipent l’énergie pour la thermogenèse par ucp1 (Uncoupling Protein-1) --voies indépendantes. Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études récentes ont indiqué qu’il existe plusieurs sous-types ou sous-populations qui sont distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat, et le transcriptome. Malgré les progrès de la génomique unicellulaire, la décomposition impartiale des tissus adipeux en sous-types cellulaires a été difficile en raison de la nature fragile des adipocytes remplis de lipides. Le protocole présenté a été développé pour contourner ces obstacles par l’isolement efficace des noyaux simples des tissus adipeux pour les applications en aval, y compris le séquençage de l’ARN. L’hétérogénéité cellulaire peut ensuite être analysée par séquençage de l’ARN et des analyses bioinformatiques.

Introduction

Des études ont montré que le tissu adipeux brun (BAT) a une capacité remarquable de dissiper l’énergie. Deux types d’adipocytes thermogéniques avec des caractéristiques développementales distinctes existent chez les rongeurs et les humains : les adipocytes beiges et les adipocytes bruns classiques. Alors que les adipocytes bruns classiques sont situés principalement dans les dépôts de BAT interscapulaires, les adipocytes beiges émergent sporadiquement dans le tissu adipeux blanc (WAT) en réponse à certains indices physiologiques, tels que l’exposition chronique au froid, un processus appelé « brunissement » ou « beiging ». Grâce à l’utilisation de l’imagerie avancée, il est maintenant clair que les humains adultes ont des dépôts substantiels de UCP1⁺ BAT, en particulier dans la région supraclaviciculaire^1,2,3,4. La quantité de BAT humain adulte est inversement corrélée avec l’adiposité et peut être augmentée par des signaux externes, tels que l’exposition chronique au froid^5,,6 ou β3-adrénergique récepteur agoniste⁷. Les dépenses énergétiques sous médiation du BAT peuvent offrir une approche viable pour lutter contre l’obésité.

Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études ont révélé l’existence de plusieurs sous-types ou sous-populations distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat et le transcriptome^8,9,10. Par exemple, un type d’adipocyte beige qui utilise de préférence le glucose pour la thermogenèse, l’adipocyte g-beige, a été récemment décrit¹⁰. La compréhension incomplète des types de cellules dans les tissus adipeux bruns et beiges et l’absence de marqueurs spécifiques constituent une barrière critique à l’étude de leurs fonctions biologiques.

Les méthodes traditionnelles d’isolement des sous-populations de cellules sont basées sur l’expression de quelques gènes marqueurs connus. Les progrès récents en génomique unicellulaire permettent l’utilisation de données d’expression génique globale de cellules uniques pour fournir une estimation impartiale du nombre de sous-populations dans un tissu. Le but ultime de ce protocole est de déterminer tous les sous-types de tissus adipeux sous divers stimuli thermogéniques à une résolution unicellulaire. Contrairement à d’autres tissus et types de cellules, la détermination des sous-types cellulaires du tissu adipeux est difficile en raison de la fragilité des adipocytes remplis de lipides. Cet article introduit un protocole robuste pour isoler les noyaux simples du tissu adipeux pour l’application en aval au séquençage de l’ARN. Fait important, la littérature récente comparant le séquençage de l’ARN uni-noyaux (snRNA-seq) et les ensembles de données de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont révélé que le snRNA-seq est comparable au scRNA-seq dans la détection de type cellulaire, et supérieur dans la couverture cellulaire pour un tissu complexe comme le cerveau¹¹. Ce protocole combine une méthode de centrifugation de gradient de densité optimisée pour les tissus adipeux par Rosen et al.¹² avec une étape de « nettoyage » de noyaux avec un trieur à grande vitesse MoFlo XDP. Comme on le voit dans les résultats représentatifs, une analyse de 7 500 noyaux simples provenant du tissu adipeux brun intercapulaire de souris a identifié plusieurs types de cellules dans des adipocytes bruns apparemment homogènes. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué à l’organisation au niveau tissulaire des adipocytes et des cellules adipose-résidentes, à l’identification des gènes marqueurs spécifiques au sous-type et au phénotypage de développement des souris adipeuses sélectives par KO/transgéniques.

Protocole

Les soins et l’expérimentation des animaux ont été effectués selon les procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Albert Einstein College of Medicine.

1. Préparation des tampons de digestion des tissus et de lyse

1. Préparer le tampon de digestion des tissus.
   1. Préparer ~1 mL de tampon de digestion pour chaque gramme de tissu adipeux.
   2. Peser 1,5 collagènease U/mL D et 2,4 U/mL dispase II et ajouter la solution saline tamponnée de phosphate (PBS).
2. Préparer le tampon de préparation des noyaux (CNLC).
   1. Préparer 10 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium, 10 mM de chlorure de potassium, 250 mM de saccharose et 0,1 % de NP-40 dans de l’eau sans nucléase. Bien mélanger. Le saccharose peut prendre plus de temps à se dissoudre que les autres composants.
3. Préparer une solution d’albumine de sérum bovin (BSA) à 0,5 %.
   1. Préparer 0,5 % de BSA en PBS contenant de l’EDTA. Il est recommandé d’utiliser la culture cellulaire filtrée stérile grade PBS (voir Tableau des matériaux).

2. Digestion enzymatique du tissu adipeux

1. Disséquer les souris pour extraire le tissu adipeux selon Aune et al.¹³. Recueillir des tissus isolés dans un plat contenant du PBS. Transférer le tissu dans un essuie-tout pour le sécher. Ensuite, placez le tissu dans un plat propre.
2. Ajouter du chlorure de calcium au tampon de digestion à une concentration finale de 10 mM. Ajouter un petit volume de tampon de digestion au plat et hacher soigneusement le tissu adipeux. Le volume de tampon de digestion requis sera basé sur la quantité de tissu isolé. Habituellement ~ 1 mL ou moins est utilisé.
3. Ajouter environ la moitié de la quantité de tampon de digestion préparée (p. ex., ~10 mL pour cinq souris) au tissu haché. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL. Ajouter toute quantité restante de tampon pour laver le plat et transférer dans le tube de 50 ml contenant l’échantillon. Pipette de haut en bas plusieurs fois. Incuber ensuite en secouant à 200-210 tr/min à 37 °C pendant 12-15 min.

3. Isolement des adipocytes

1. Après incubation, ajoutez 0,5 % de BSA à un ratio de 1:1 à l’échantillon. Bien mélanger en faisant monter et descendre plusieurs fois. Centrifuge l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) pour faire tourner la fraction vasculaire stromale (SVF). La fraction d’adipocyte restera dans la couche supérieure de l’échantillon.
2. Placez un filtre à cellules de 40 μm au-dessus d’un tube de centrifugeuse conique de 50 m L et filtrez l’échantillon, en recueillant la couche supérieure et en laissant derrière vous le SVF au fond du tube. Transférer la couche supérieure (fraction d’adipocyte) dans un nouveau tube en renversant le filtre à l’envers sur le tube et en utilisant 0,5% de BSA pour inverser le lavage du filtre et recueillir l’échantillon dans le tube.
3. Porter le volume total de 0,5 % de BSA à 10-15 mL en fonction de la taille de l’échantillon et de la pipette de haut en bas avec une pipette sérologique ou secouer brièvement de haut en bas pour mélanger l’échantillon. Centrifuge de l’échantillon à nouveau à 300 x g pendant 5 min à RT.

4. Isolement des noyaux

1. Utilisez une pointe de pipette à large forage et transférez soigneusement la couche supérieure de l’échantillon vers un filtre à cellules de 100 μm placé sur un nouveau tube préchilled sur la glace, laissant derrière vous tout SVF résiduel.
2. Rincer/laver le filtre avec une quantité suffisante de CNLC et jeter le filtre. De ce pas en avant, ayez l’échantillon sur la glace aussi souvent que possible et travaillez rapidement pour éviter les noyaux qui fuient et/ou malsains. Il est utile de préchill tubes microcentrifuge à utiliser dans les prochaines étapes sur la glace.
3. Placer l’échantillon sur la glace pendant pas plus de 2 min avec l’inversion douce intermittente du tube pour mélanger. Le temps d’incubation sur la glace doit être optimisé pour la taille de l’échantillon et le type d’adipocytes. Centrifugeuse à 1 000 x g à 4 °C pendant 10 min.
4. Retirer le supernatant et resuspender le granulé dans 1 mL de la CNLC. Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifuge propre. Lors du transfert, évitez de toucher les parois du tube, qui contiennent des débris et des lipides. Ajouter l’inhibiteur de 0,6 RNase U/μL à l’échantillon et mélanger. Centrifugeuse à nouveau à 1000 x g à 4 °C pendant 10 min.
   REMARQUE : La vitesse et le temps de centrifugement devraient être diminués à cette étape pour les échantillons plus petits.
5. Retirez le supernatant et resuspendez dans 1 mL de tampon de lavage de noyaux (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibiteur).
6. Double filtre dans un tube propre avec des filtres empilables de 30 μm. Lavez le filtre avec un petit volume (~300 μL) de tampon de lavage de noyaux. Alternativement, pour les échantillons plus petits, utilisez un filtre de 30 μm qui s’insère dans un tube de microcentrifuge et filtrez directement dedans.
7. Confirmez l’isolement réussi des noyaux sains.
   1. Tacher un petit aliquot de l’échantillon avec trypan et utiliser un compteur cellulaire automatisé pour évaluer la taille morte moyenne et pour cent de cellules mortes. La taille morte moyenne d’un échantillon contenant principalement des noyaux devrait varier entre 7 et 10 μm. La taille des noyaux est habituellement d’environ 8 μm.
   2. Tacher un petit aliquot de l’échantillon avec DAPI et examiner au microscope avec un objectif 20x ou plus. La membrane nucléaire doit être intacte et les noyaux doivent être ronds.

5. Étape de nettoyage et de concentration des noyaux FACS

1. Passez immédiatement à l’étape facs pour nettoyer les noyaux et enlever tout débris excédentaire. La mémoire tampon de collecte doit contenir le tampon de lavage nuclei. Pendant le FACS, la mémoire tampon est diluée. Il est utile de préparer une concentration plus élevée d’inhibiteur de la BSA et de la RNase pour tenir compte de la dilution pendant le tri. Le bloc de collecte FACS doit être en mode de refroidissement.
2. Après le tri des noyaux, la centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C pour concentrer l’échantillon. Reconstituer dans un volume approprié de tampon de lavage des noyaux pour atteindre une concentration de 500 à 1 500 noyaux/μL. N’essayez pas d’enlever tous les supernatants. Cela entraînera la perte de noyaux.
3. Utilisez un hémocytomètre et un aiquot taché DAPI pour un décompte final et pour visualiser les noyaux. Ensuite, procéder immédiatement avec snRNA-seq selon le protocole du fabricant.

Résultats

Les noyaux d’adipocytes non triés contiennent des débris et des doublets qui créent du bruit et un fond élevé dans le séquençage de l’ARN unicellulaire en aval. La stratégie représentative de porte FACS est indiquée à la figure 1. Les noyaux ont d’abord été sélectionnés en fonction de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la dispersion latérale (SSC) (A),puis, seuls les singlets ont été sélectionnés en fonction de ...

Discussion

Une méthode simple et robuste pour isoler les noyaux simples et étudier l’hétérogénéité des tissus adipeux est présentée. Comparé au séquençage de l’ARN des tissus entiers, ce flux de travail offre une vue impartiale de l’hétérogénéité cellulaire et des marqueurs spécifiques à la population. Ceci est significatif et novateur pour l’avancement de la biologie des adipocytes, du métabolisme moléculaire et de la recherche sur l’obésité.

Ce protocole est particuliè...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA	Sigma	A1595
CaCl2	Sigma	21115
Cell filter 100 μm	Corning	431752
Cell filter 40μm	Corning	431750
CellTrics (30 μm)	Sysmex	04-004-2326
Collagenase D	Roche	11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
DAPI	Sigma	D9542
Dispase II	Roche	4942078001
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Fisher	P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458	Stackable filters
MgCl2	Sigma	M1028
MoFloXDP Cell Sorter	Beckman Coulter	ML99030
NP-40	Sigma	74385
Protector RNase Inhibitor	Roche	3335402001
Sucrose	Fisher	S5-3