Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Zusammenfassung

Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

Zusammenfassung

Braunes und beiges Fett sind spezialisierte Fettgewebe, die Energie für die Thermogenese durch UCP1 (Uncoupling Protein-1) abhängige und unabhängige Wege ableiten. Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass es mehrere Subtypen oder Subpopulationen gibt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratverwendung und Transkriptom unterscheiden. Trotz der Fortschritte in der einzelligen Genomik war die unvoreingenommene Zersetzung von Fettgeweben in zelluläre Subtypen aufgrund der zerbrechlichen Natur von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Das vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um diese Hindernisse durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne aus Fettgewebe für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich der RNA-Sequenzierung, zu umgehen. Die zelluläre Heterogenität kann dann durch RNA-Sequenzierung und bioinformatische Analysen analysiert werden.

Einleitung

Studien haben gezeigt, dass braunes Fettgewebe (BAT) eine bemerkenswerte Fähigkeit hat, Energie abzuleiten. Zwei Arten von thermogenen Adipozyten mit unterschiedlichen Entwicklungsmerkmalen existieren sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen: Beige-Adipozyten und klassische braune Adipozyten. Während sich klassische braune Adipozyten meist in interscapularen BVT-Depots befinden, entstehen beige adipozyten sporadisch in weißem Fettgewebe (WAT) als Reaktion auf bestimmte physiologische Hinweise, wie chronische Kälteexposition, ein Prozess, der als "Browning" oder "Beiging" bezeichnet wird. Durch den Einsatz von fortgeschrittener Bildgebung ist nun klar, dass erwachsene Menschen über erhebliche Depots von UCP1⁺ BAT verfügen, insbesondere in der supktoicularen Region^1,2,3,4. Die Menge der erwachsenen menschlichen BAT korreliert umgekehrt mit Fettleibigkeit und kann durch externe Hinweise erhöht werden, wie chronische Kälteexposition^5,6 oder 3-adrenergen Rezeptoragonist^en7. DIE von BVT vermittelten Energieausgaben können einen praktikablen Ansatz zur Bekämpfung von Fettleibigkeit bieten.

Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Studien haben jedoch die Existenz mehrerer Subtypen oder Subpopulationen aufgedeckt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratnutzung und Transkriptom^8,,9,10unterscheiden. Zum Beispiel wurde kürzlich eine Art von Beige-Adipozyten beschrieben, die bevorzugt Glukose für die Thermogenese verwendet, die g-beige adipocyte, vor kurzem¹⁰beschrieben. Das unvollständige Verständnis von Zelltypen in braunem und beigeem Fettgewebe und das Fehlen spezifischer Marker stellen ein kritisches Hindernis für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen dar.

Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Subpopulationen von Zellen basieren auf der Expression nur einiger bekannter Markergene. Jüngste Fortschritte in der einzelzelligen Genomik ermöglichen die Verwendung globaler Genexpressionsdaten einzelner Zellen, um eine unvoreingenommene Schätzung der Anzahl der Subpopulationen in einem Gewebe zu liefern. Das Endziel dieses Protokolls ist es, alle Fettgewebe-Subtypen unter verschiedenen thermogenen Reizen in einer einzelzelligen Auflösung zu bestimmen. Im Gegensatz zu anderen Geweben und Zelltypen ist die Bestimmung zellulärer Subtypen von Fettgewebe aufgrund der Fragilität von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Papier führt ein robustes Protokoll ein, um einzelne Kerne aus Fettgewebe für die nachgeschaltete Anwendung zur SnRNA-Sequenzierung zu isolieren. Wichtig ist, dass aktuelle Literatur, die gut aufeinander abgestimmte Single-Nuklei-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) vergleicht, zeigte, dass snRNA-seq mit scRNA-seq in der Zelltyp-Detektion vergleichbar ist und in der zellulären Abdeckung für ein komplexes Gewebe wie das Gehirn^{überlegen ist 11}. Dieses Protokoll kombiniert eine Dichtegradientenzentrifugationsmethode, die von Rosen et al.¹² für Fettgewebe optimiert wurde, mit einem "Cleanup"-Schritt der Kerne mit einem MoFlo XDP High Speed Sorter. Wie in den repräsentativen Ergebnissen zu sehen ist, identifizierte eine Analyse von 7.500 einzelnen Kernen aus dem interskapulären braunen Fettgewebe der Maus mehrere Zelltypen in scheinbar homogenen braunen Adipozyten. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten und adipose-residenten Zellen auf Gewebeebene, die Identifizierung subtypspezifischer Markergene und die Entwicklung von Phänotypisierung von adipose-selektiven Knockout/transgenen Mäusen zu untersuchen.

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Protokoll

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Albert Einstein College of Medicine genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Gewebeverdauungs- und Lysepuffern

1. Bereiten Sie den Gewebeverdauungspuffer vor.
   1. Bereiten Sie für jedes Gramm Fettgewebe einen Verdauungspuffer von 1 ml vor.
   2. 1,5 U/ml Kollagennase D und 2,4 U/ml Dispase II abwägen und Phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen.
2. Vorbereiten des Kernvorbereitungspuffers (NPB).
   1. Bereiten Sie 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 250 mM Saccharose und 0,1% NP-40 in nukleasefreiem Wasser vor. Gut mischen. Saccharose kann mehr Zeit in Anspruch nehmen, um sich aufzulösen als die anderen Komponenten.
3. Bereiten Sie 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung vor.
   1. 0,5% BSA in PBS mit EDTA-haltigem Ziel vorbereiten. Es wird empfohlen, sterilgefilterte Zellkultur-PBS zu verwenden (siehe Materialtabelle).

2. Enzymatische Verdauung von Fettgewebe

1. Sezieren Sie Mäuse, um Fettgewebe nach Aune et al.¹³zu extrahieren. Sammeln Sie isoliertes Gewebe in einer Schüssel, die PBS enthält. Übertragen Sie das Gewebe auf ein Papiertuch, um trocken zu klopfen. Dann legen Sie das Gewebe in eine saubere Schale.
2. Calciumchlorid in den Verdauungspuffer zu einer Endkonzentration von 10 mM geben. Fügen Sie ein kleines Volumen des Verdauungspuffers in die Schale und gründlich Hackfleisch das Fettgewebe. Das benötigte Volumen des Verdauungspuffers basiert auf der Menge des isolierten Gewebes. In der Regel werden 1 ml oder weniger verwendet.
3. Fügen Sie etwa die Hälfte des vorbereiteten Verdauungspuffers (z. B. 10 ml für fünf Mäuse) in das gehackte Gewebe ein. Mit einer serologischen Pipette die Probe in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie eine beliebige verbleibende Menge an Puffer hinzu, um die Schale zu waschen und in das 50 ml-Rohr mit der Probe zu übertragen. Pipette mehrmals rauf und runter. Dann mit Schütteln bei 200-210 Rpm bei 37 °C für 12-15 min bebrüten.

3. Adipozyten-Isolierung

1. Fügen Sie nach der Inkubation 0,5% BSA im Verhältnis 1:1 zur Probe hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten. Zentrifuge die Probe bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um die stromale Gefäßfraktion (SVF) zu drehen. Der Adipozytenanteil verbleibt in der obersten Schicht der Probe.
2. Legen Sie einen 40-m-Zellfilter auf ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und filtern Sie die Probe, sammeln Sie die obere Schicht und lassen Sie den SVF an der Unterseite des Rohres zurück. Übertragen Sie die obere Schicht (Adipozytenfraktion) in ein neues Rohr, indem Sie den Filter auf den Kopf über das Rohr kippen und 0,5% BSA verwenden, um den Filter umzukehren und die Probe im Rohr zu sammeln.
3. Bringen Sie das Gesamtvolumen von 0,5 % BSA auf 10-15 ml basierend auf Probengröße und Pipette nach oben und unten mit einer serologischen Pipette oder schütteln Sie kurz nach oben und unten, um die Probe zu mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 x g für 5 min bei RT wieder.

4. Kernisolierung

1. Verwenden Sie eine Breitbohrpipettenspitze und übertragen Sie vorsichtig die obere Schicht der Probe auf einen 100-m-Zellfilter, der auf einem neuen vorgekühlten Rohr auf Eis platziert wird, wodurch Rest-SVF zurückbleibt.
2. Spülen/waschen Sie den Filter mit einer ausreichenden Menge NPB und entsorgen Sie den Filter. Von diesem Schritt vorwärts haben die Probe auf Eis so oft wie möglich und arbeiten schnell, um undichte und/oder ungesunde Kerne zu vermeiden. Es ist hilfreich, Mikrozentrifugenrohre vorzukühlen, die in zukünftigen Schritten auf Eis verwendet werden.
3. Legen Sie die Probe auf Eis für nicht mehr als 2 min mit intermittierenden sanften Inverting der Röhre zu mischen. Die Inkubationszeit auf Eis sollte für die Probengröße und die Art der Adipozyten optimiert werden. Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 °C für 10 min.
4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml NPB wieder auf. Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr. Vermeiden Sie beim Übertragen das Berühren der Wände des Rohres, die Schmutz und Lipid enthalten. Fügen Sie der Probe 0,6 U/L-RNase-Inhibitor hinzu und mischen Sie sie. Zentrifugieren Sie wieder bei 1.000 x g bei 4 °C für 10 min.
   HINWEIS: Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit sollten bei kleineren Proben in diesem Schritt verringert werden.
5. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie sich in 1 ml Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0,6 U/L RNase-Inhibitor) wieder auf.
6. Doppelfilter in ein Randrohr mit stapelbaren 30-mm-Filtern. Waschfilter mit einem kleinen Volumen (ca. 300 l) Nuclei Wash Buffer. Alternativ können Sie für kleinere Proben einen 30-mm-Filter verwenden, der in ein Mikrozentrifugenrohr passt und direkt hineinfiltert.
7. Bestätigen Sie die erfolgreiche Isolierung gesunder Kerne.
   1. Färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit Trypan und verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die durchschnittliche totabgestorbene Größe und prozentuale abgestorbene Zellen zu bewerten. Die durchschnittliche Totgröße für eine Probe, die hauptsächlich Kerne enthält, sollte zwischen 7-10 m liegen. Die Größe der Kerne liegt in der Regel bei etwa 8 m.
   2. Färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit DAPI und untersuchen Sie unter dem Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv oder höher. Die Kernmembran sollte intakt sein und die Kerne sollten rund sein.

5. FACS Reinigungs- und Kernkonzentrationsschritt

1. Gehen Sie sofort zum FACS-Schritt, um Die Kerne zu säubern und überschüssigen Schmutz zu entfernen. Der Auflistungspuffer sollte Nuclei Wash Buffer enthalten. Während FACS wird der Puffer verdünnt. Die Vorbereitung einer höheren Konzentration von BSA- und RNase-Inhibitoren zur Berücksichtigung der Verdünnung während der Sortierung ist hilfreich. Der FACS-Sammelblock sollte sich im Kühlmodus befinden.
2. Nach dem Sortieren der Kerne zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, um die Probe zu konzentrieren. Rekonstituieren Sie sich in einem geeigneten Volumen von Nuclei Wash Buffer, um eine Konzentration von 500-1.500 Kernen/L zu erreichen. Versuchen Sie nicht, alle Überstandzuerkennen zu entfernen. Dies führt zum Verlust von Kernen.
3. Verwenden Sie ein Hämozytometer und ein DAPI-gefärbtes Aliquot für eine endgültige Zählung und um die Kerne zu visualisieren. Fahren Sie dann sofort mit snRNA-seq gemäß dem Herstellerprotokoll fort.

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Ergebnisse

Unsortierte Adipozytenkerne enthalten Trümmer und Doublets, die bei der nachgeschalteten einzelzelligen RNA-Sequenzierung Rauschen und hohen Hintergrund erzeugen. Die repräsentative FACS-Gate-Strategie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Kerne wurden zuerst auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) (A) ausgewählt, dann wurden nur Singlets auf der Grundlage der Kombination von Breite und Höhen von SSC (B...

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Diskussion

Es wird eine einfache und robuste Methode zur Isolierung einzelner Kerne und zur Untersuchung der Heterogenität des Fettgewebes vorgestellt. Im Vergleich zur Sequenzierung der gesamten Gewebe-RNA bietet dieser Workflow einen unvoreingenommenen Blick auf die zelluläre Heterogenität und populationsspezifische Marker. Dies ist signifikant und innovativ für die Weiterentwicklung der Adipozytenbiologie, des molekularen Stoffwechsels und der Adipositasforschung.

Dieses Protokoll ist speziell fü...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA	Sigma	A1595
CaCl2	Sigma	21115
Cell filter 100 μm	Corning	431752
Cell filter 40μm	Corning	431750
CellTrics (30 μm)	Sysmex	04-004-2326
Collagenase D	Roche	11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
DAPI	Sigma	D9542
Dispase II	Roche	4942078001
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Fisher	P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458	Stackable filters
MgCl2	Sigma	M1028
MoFloXDP Cell Sorter	Beckman Coulter	ML99030
NP-40	Sigma	74385
Protector RNase Inhibitor	Roche	3335402001
Sucrose	Fisher	S5-3