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Method Article
本文提出了一种使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 表达的方案。该方案强调缺血性肾损伤小鼠模型和 microRNA 样品的仔细提取。
MicroRNA (miRNA) 参与各种疾病状态,是小鼠疾病早期诊断和治疗的有效生物标志物。然而,纯化 miRNA 和检测其在急性肾损伤 (AKI) 小鼠肾脏中的表达的标准方案尚未完全建立。本研究开发了一种有效且简单的方案,使用定量实时逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 纯化和定量肾缺血再灌注诱导的 AKI 小鼠模型肾脏中的 miRNA。该方案包括五个步骤:1) 通过肾缺血再灌注诱导 AKI,2) 收获肾脏,3) 从肾脏中纯化总 RNA,包括 miRNA,4) 通过 miRNA 逆转录合成 cDNA,以及 5) qRT-PCR 检测 miRNA 表达。使用该方案,可以使用轻度至重度 AKI 生成肾缺血再灌注损伤模型。此外,如果正确遵循该程序,则可以获得个体差异最小的一致 AKI 模型。该 qRT-PCR 检测试剂盒具有非常宽的动态范围,能够区分成熟 miRNA,从而以高特异性准确定量。该方案可用于研究 AKI 肾脏中的 miRNA 表达谱。
肾脏缺血再灌注损伤 (IRI) 是急性肾损伤 (AKI) 发展的主要危险因素之一1。AKI 在患者预后中起着重要作用,但特异性疗法和早期诊断生物标志物尚未确定。
MicroRNA (miRNA) 是短的非编码 RNA,具有大约 18-25 个碱基。miRNA 在体液中稳定,其序列在动物中高度保守2。MiRNA 通过数千个靶标调节多种蛋白的表达,从而影响不同的信号转导通路 2,3,4,5,6,7,8。近年来,据报道 miRNA 参与各种疾病状态,是多种疾病早期诊断的有效生物标志物。
该方案的总体目标是成功纯化和检测 IRI 诱导的 AKI 小鼠模型肾脏中的 miRNA。该 IRI 模型是 AKI 和肾纤维化的广泛使用模型。IRI 模型的优点包括能够直观地确认是否已实现缺血再灌注并确定 AKI 发作的确切时间。然而,足够长的夹持持续时间会导致广泛的管状损伤与高死亡率相关,而较短的夹持持续时间不会引起管状损伤,这会导致该实验模型中管状损伤进展的巨大变化。与双侧钳夹模型相比,在单侧肾 IRI 模型中收获的右侧肾切除术组织作为对照并确保肾功能衰竭。
使用玻璃匀浆器将肾脏样品捣碎,其中分离蛋白质和核酸,分离 DNA 和 RNA9。使用基于硅胶膜的离心柱9 从肾脏样品中纯化总 RNA,包括 miRNA。随后,使用 poly(A) 聚合酶和 oligo-dT 引物从总 RNA 进行 cDNA 合成(逆转录)10。最后,使用嵌入染料10 通过 qRT-PCR 测定 miRNA 表达。与终点扩增体积的 PCR 相比,qRT-PCR 可以更准确地定量基因表达。qRT-PCR 可测量高浓度,具有较宽的动态范围,可根据循环次数进行准确定量。以前的研究报道了简单的过程可用于有效纯化和检测组织中的 miRNA 8,9,10。据报道,该方案中描述的用于 cDNA 合成(逆转录)和使用嵌入染料通过 qRT-PCR 检测 miRNA 表达的方法显示出高准确性和灵敏度10。
此外,该方案很简单,并且在实验室之间获得了一致的结果。因此,该方案在需要在小鼠 AKI 肾脏中进行高度准确和灵敏的 miRNA 检测的研究中很有用。
所有动物实验方案均经济济医科大学动物伦理委员会批准,并按照济济医科大学实验动物指南中的实验动物使用和护理指南进行。
1. IRI 模型
注意:在整个手术过程中仔细监测体温过低、肠道保湿和麻醉深度。
2. 肾脏样本采集
注意:该视频的夹紧时间为 45 分钟,24 小时后收集肾脏。
3. 从肾脏样本中纯化 miRNA
注:在这里,使用玻璃匀浆器和微量离心柱中的生物聚合物粉碎系统对重 30 mg 的肾脏样品进行均质化。随后,使用基于硅胶膜的离心柱分离来自肾脏样品的 miRNA。
4. miRNA 的逆转录
注:此处使用逆转录酶、poly(A) 聚合酶和 oligo-dT 引物对 1.0 μg 分离的 RNA 进行逆转录。
5. miRNA 的 qRT-PCR
注:miRNA 的 qRT-PCR 使用嵌入染料进行。在这里,使用了 U6 小核 2 (RNA-2)、miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-3p、miRNA-212-3p、miRNA-223-3p 和 miRNA-574-5p 的引物。
在这里,研究了 AKI 小鼠中的 miRNA 表达谱。已在小鼠的各种器官和组织中研究了 miRNA 表达谱。MiRNA 是重要的转录后调节因子,现在正在广泛研究包括 AKI 在内的各种疾病的表征。MiRNA 有可能帮助阐明病理状况并应用于 AKI12 的治疗。AKI 的主要原因是 IRI、肾毒性损伤和脓毒症。肾脏的 IRI 是 AKI 发展的主要危险因素之一。据报道,许多 miRNA 与 AKI
使用本手稿中提出的方案,使用 qRT-PCR 成功纯化和检测来自 IRI 小鼠肾脏的 miRNA。该方案中 IRI 诱导程序的关键点包括仔细监测体温和麻醉浓度,已知这些会影响 AKI20。该方案的优势在于它允许目视确认是否已实现缺血再灌注。但是,此 IRI 模型存在一些限制。延长钳夹时间以诱导严重缺血会增加死亡率。此外,当使用左肾动脉钳夹无法实现肾缺血时,这...
作者声明他们没有利益冲突。
我们感谢 Nam Nguyen 博士编辑了本手稿的草稿。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook | Natsume Seisakusho | MA-47 | |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
C57B6 mice | SLC | not assign | |
forcep with Teeth | Natsume Seisakusho | MA-49 | |
forcep without Teeth | Natsume Seisakusho | MA-48-1 | |
Hemostatic clips | Natsume Seisakusho | KN−353 | |
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-132-3p primer | Qiagen | MS00003458 | 5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG |
miRNA-17-5p primer | Qiagen | MS00029274 | 5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG |
miRNA-18a-5p primer | Qiagen | MS00031514 | 5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG |
miRNA-212-3p primer | Qiagen | MS00003815 | 5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC |
miRNA-21a-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA |
miRNA-574-5p primer | Qiagen | MS00043617 | 5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
surgical scissors | Natsume Seisakusho | B-2 | |
Vascular clip applier | VITALITEC | 1621420 |
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