缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 MicroRNAs 的定量检测方法

摘要

本文提出了一种使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 表达的方案。该方案强调缺血性肾损伤小鼠模型和 microRNA 样品的仔细提取。

摘要

MicroRNA （miRNA） 参与各种疾病状态，是小鼠疾病早期诊断和治疗的有效生物标志物。然而，纯化 miRNA 和检测其在急性肾损伤 （AKI） 小鼠肾脏中的表达的标准方案尚未完全建立。本研究开发了一种有效且简单的方案，使用定量实时逆转录聚合酶链反应 （qRT-PCR） 纯化和定量肾缺血再灌注诱导的 AKI 小鼠模型肾脏中的 miRNA。该方案包括五个步骤：1） 通过肾缺血再灌注诱导 AKI，2） 收获肾脏，3） 从肾脏中纯化总 RNA，包括 miRNA，4） 通过 miRNA 逆转录合成 cDNA，以及 5） qRT-PCR 检测 miRNA 表达。使用该方案，可以使用轻度至重度 AKI 生成肾缺血再灌注损伤模型。此外，如果正确遵循该程序，则可以获得个体差异最小的一致 AKI 模型。该 qRT-PCR 检测试剂盒具有非常宽的动态范围，能够区分成熟 miRNA，从而以高特异性准确定量。该方案可用于研究 AKI 肾脏中的 miRNA 表达谱。

引言

肾脏缺血再灌注损伤 （IRI） 是急性肾损伤 （AKI） 发展的主要危险因素之一¹。AKI 在患者预后中起着重要作用，但特异性疗法和早期诊断生物标志物尚未确定。

MicroRNA （miRNA） 是短的非编码 RNA，具有大约 18-25 个碱基。miRNA 在体液中稳定，其序列在动物中高度保守²。MiRNA 通过数千个靶标调节多种蛋白的表达，从而影响不同的信号转导通路 2,3,4,5,6,7,8。近年来，据报道 miRNA 参与各种疾病状态，是多种疾病早期诊断的有效生物标志物。

该方案的总体目标是成功纯化和检测 IRI 诱导的 AKI 小鼠模型肾脏中的 miRNA。该 IRI 模型是 AKI 和肾纤维化的广泛使用模型。IRI 模型的优点包括能够直观地确认是否已实现缺血再灌注并确定 AKI 发作的确切时间。然而，足够长的夹持持续时间会导致广泛的管状损伤与高死亡率相关，而较短的夹持持续时间不会引起管状损伤，这会导致该实验模型中管状损伤进展的巨大变化。与双侧钳夹模型相比，在单侧肾 IRI 模型中收获的右侧肾切除术组织作为对照并确保肾功能衰竭。

使用玻璃匀浆器将肾脏样品捣碎，其中分离蛋白质和核酸，分离 DNA 和 RNA⁹。使用基于硅胶膜的离心柱⁹ 从肾脏样品中纯化总 RNA，包括 miRNA。随后，使用 poly（A） 聚合酶和 oligo-dT 引物从总 RNA 进行 cDNA 合成（逆转录）¹⁰。最后，使用嵌入染料¹⁰ 通过 qRT-PCR 测定 miRNA 表达。与终点扩增体积的 PCR 相比，qRT-PCR 可以更准确地定量基因表达。qRT-PCR 可测量高浓度，具有较宽的动态范围，可根据循环次数进行准确定量。以前的研究报道了简单的过程可用于有效纯化和检测组织中的 miRNA ^8,9,10。据报道，该方案中描述的用于 cDNA 合成（逆转录）和使用嵌入染料通过 qRT-PCR 检测 miRNA 表达的方法显示出高准确性和灵敏度¹⁰。

此外，该方案很简单，并且在实验室之间获得了一致的结果。因此，该方案在需要在小鼠 AKI 肾脏中进行高度准确和灵敏的 miRNA 检测的研究中很有用。

研究方案

所有动物实验方案均经济济医科大学动物伦理委员会批准，并按照济济医科大学实验动物指南中的实验动物使用和护理指南进行。

1. IRI 模型

注意：在整个手术过程中仔细监测体温过低、肠道保湿和麻醉深度。

1. 准备以下物品：一个 50 mL 离心管，里面装有浸在异氟醚中的棉花、一个加热的手术垫、一个装有磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的培养皿、手术剪刀和镊子。将 PBS 保持在 37 °C。
   注意：该 IRI 模型是使用雄性 C57BL/6 小鼠（9 周;20-25 g）生成的，这些小鼠被饲养在温度、湿度和 12 小时明暗循环的房间中。
2. 使用异氟醚麻醉动物：诱导浓度 3%-5%，维持浓度 2%-3%，夹紧期间的浓度 1%-1.5%。通过反射丧失确认麻醉深度。吸入麻醉的优点是时间可以调整。由于肾脏周围的组织会剥落，因此该过程可能需要很长时间。但是，吸入麻醉的缺点是体温容易下降。在整个手术过程中，避免不必要的麻醉。
3. 将麻醉的鼠标安装在其背部加热的手术垫上，去除切口区域周围的毛发，并用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹部皮肤。
4. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做一个中线切口。
5. 使用蘸有 PBS 的棉签，轻轻地将肠道推向腹腔外腔的左侧，露出右侧肾脏和输尿管。手术时间长，容易造成术后肠道损伤。因此，当可以获得视野时，最好在不从腹腔中取出肠道的情况下进行手术。避免使肠道干燥。干棉签或纱布会导致肠道损伤。
6. 用斜镊子提起右输尿管。使用 4/0 丝编织线结扎右输尿管两次。在缝合线之间剪断，使更靠近肾脏的缝合线更长。
7. 小心握住剩余的缝合线，不要拉得太多，顺肾钝地解剖结缔组织和脂肪。从背后进行手术可降低肝损伤的风险。
   1. 确定除肾动脉和静脉外向右肾供血的血管，然后结扎或夹住它。当右肾完全脱离时，使用 4/0 丝编织线结扎右肾动脉和静脉。不要缝合，而是使用止血夹。
   2. 用蘸有 PBS 的棉签，轻轻地将肠道推向腹腔右侧，露出左肾，然后用湿润的窗帘覆盖肠道，防止肠道变干。解剖左肾周围的结缔组织和脂肪。
8. 确定为左肾供血的血管，而不是肾动脉和静脉，然后结扎或夹住它。夹夹肾动脉和肾静脉以诱导左肾缺血。将止血夹放置在距离肾脏约 1 cm 的位置，以避免损伤肾实质。成功的缺血可以通过肾脏逐渐均匀变黑来确认。
9. 将肠道返回腹腔，注意避免肠道扭曲;暂时闭合腹部皮肤并悬垂以保持湿润环境。尽可能降低吸入麻醉的浓度，并尽量保持动物温暖。夹紧时间为 25-45 分钟。较长的钳夹时间会导致更严重的肾损伤，但也会增加长期死亡率。通过分析病理结果进行调整。
10. 缺血期结束后取下夹子。确保血流再灌注和肾脏颜色改善。在闭合腹部皮肤之前，确认肠道没有扭曲。在腹部分成两层封闭之前，腹膜内滴注 PBS 作为体积补充剂。使用 4-0 尼龙缝合线闭合腹部皮肤。对于较长的肾脏切除时间，可以通过分别关闭腹壁和腹膜来减少肠粘连的可能性。
11. 为了最大限度地降低术后感染的风险，请在手术区域涂抹消毒剂（例如碘/酒精溶液）。

2. 肾脏样本采集

注意：该视频的夹紧时间为 45 分钟，24 小时后收集肾脏。

1. 用 5% 异氟醚麻醉动物，并通过反射丧失确认麻醉深度。
2. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做一个中线切口。从用 27 G 针刺穿的下腔静脉中收集血液。
3. 在胸壁上做一个中线切口，然后将 23 G 针头插入左心室。确认回流。在肝脏上切开并注射 20 mL PBS。随着血液的流出，肝脏的颜色从红色变为粉红色，确认已经排出了足够的血液。
4. 用镊子和剪刀取出左肾，并在培养皿中用 PBS 清洗。用镊子切除肾筋膜，注意不要使肾脏干燥。
5. 将肾脏切成两半，一半用于组织病理学，另一半用于下一步。避开肾盂，收获 30 毫克肾脏。使用前将其储存在 -80 °C 下。

3. 从肾脏样本中纯化 miRNA

注：在这里，使用玻璃匀浆器和微量离心柱中的生物聚合物粉碎系统对重 30 mg 的肾脏样品进行均质化。随后，使用基于硅胶膜的离心柱分离来自肾脏样品的 miRNA。

1. 准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 微量离心管、100% 乙醇、氯仿、玻璃均质器、冰、微量离心机⁹ 离心柱中的生物聚合物切碎系统、基于二氧化硅膜的离心柱⁹、苯酚/胍基裂解试剂、含有胍和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）和含有乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）。
2. 将 30 mg 肾脏样品放入玻璃匀浆器中，并加入 700 μL 基于苯酚/胍的裂解试剂。在冰上执行此步骤，因为组织会因热而变性。
3. 通过扭转杵将杵慢慢压在样品上，使肾脏样品均质化。在冰上重复此过程数十次，直到肾脏样品完全溶解到基于苯酚/胍的裂解试剂中。当在后续测量中未获得 miRNA 时，这可能是因为溶解不足。
4. 为了进一步均质化，将均质化的裂解物转移到放置在 2.0 mL 收集管中的微量离心离心柱中的生物聚合物粉碎系统中。在室温下以 14,000 × g 离心 3 分钟。
5. 将匀浆裂解物转移到新的微量离心管中。
6. 向匀浆裂解物中加入 140 μL 氯仿，并盖紧试管。通过倒置混合管 15 秒。
7. 将样品在室温下孵育 2-3 分钟。然后，将它们在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
8. 将上清液（通常为 300 μL）转移到新的微量离心管中，不要干扰沉淀物，并加入 1.5 体积（通常为 450 μL）的 100% 乙醇。涡旋 5 秒混合样品。
9. 将多达 700 μL 样品移液到放置在 2.0 mL 收集管中的硅胶膜离心柱中。盖上柱盖，以 15,000 × g 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出液。
10. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 700 μL 洗涤缓冲液 1，以彻底清洗样品。盖上色谱柱盖，以 15,000 × g 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出液。
11. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 2，以去除任何痕量盐。盖上色谱柱盖，以 15,000 × g 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出液。
    1. 重复步骤 3.11。
12. 将基于硅胶膜的离心柱再次以 15,000 × g 离心 1 分钟。离心后，丢弃收集管中的流出液。
13. 将硅胶膜离心柱放入新的 1.5 mL 收集管中。将 25 μL 不含 RNase 的水转移到色谱柱中，然后关闭色谱柱盖。将样品在室温下放置 5 分钟，然后以 15,000 × g 离心 1 分钟。
14. 将含有 miRNA 的 25 μL 洗脱液转移到新的微量离心管中。由于 miRNA 会因反复溶解而降解，因此建议将样品分配到 2 或 3 个试管中。使用前将它们储存在 -80 °C 下。

4. miRNA 的逆转录

注：此处使用逆转录酶、poly（A） 聚合酶和 oligo-dT 引物对 1.0 μg 分离的 RNA 进行逆转录。

1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管;8 孔联排管;不含 RNase 的水;冰;含有脱氧核苷酸、核糖核苷酸三磷酸和 oligo-dT 引物的 10x 核酸混合物;poly （A） 聚合酶和逆转录酶混合物;和活化缓冲液，包括 Mg²⁺、脱氧核糖核苷酸、oligo-dT 引物和随机引物¹⁰。
2. 制备含有 2.0 μL 10x 核酸混合物、2.0 μL poly（A） 聚合酶和逆转录酶混合物以及 4.0 μL 5x 激活缓冲液（包括 Mg²⁺、脱氧核糖核苷酸、oligo-dT 引物和随机引物）的预混液溶液，每管总计 8.0 μL。
3. 将 8.0 μL 预混液分配到每个试管中。
4. 向每个试管中加入 1.0 μg 从肾脏样品中纯化的分离 miRNA。
5. 向每个试管中加入不含 RNase 的水，总共 20 μL。通过移液充分混合，并以 1,500 x g 离心 15 秒。
6. 将样品在 37 °C 下孵育 60 分钟，然后立即在 95 °C 下孵育 5 分钟。 此步骤可以在热循环仪中进行。
7. 将 cDNA 转移到新的微量离心管中，用不含 RNase 的水稀释 10 倍 （1：10）。
8. 将稀释的 cDNA 短期储存在冰上，并在使用前在 -80 °C 下长期储存。

5. miRNA 的 qRT-PCR

注：miRNA 的 qRT-PCR 使用嵌入染料进行。在这里，使用了 U6 小核 2 （RNA-2）、miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-3p、miRNA-212-3p、miRNA-223-3p 和 miRNA-574-5p 的引物。

1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、用于 qRT-PCR 的 96 孔反应板、用于 96 孔反应板的胶膜、miRNA 特异性引物、包含 Taq DNA 聚合酶的 PCR 预混液、PCR 缓冲液、脱氧核苷酸和通用引物¹⁰，以及实时 PCR 仪器。
2. 制备含有 12.5 μL 2x PCR 预混液、2.5 μL 溶于无核酸酶水中的每种 miRNA 引物 （5 μM） 以及 1.25 μL 10x 通用引物的预混液。
3. 将 22.5 μL 预混液分配到 96 孔板的每个孔中。
4. 向每个孔中加入 2.5 μL 模板 cDNA。
5. 用 96 孔反应板的封板膜密封板。然后，将板以 1,000 × g 离心 30 秒。
6. 使用实时 PCR 仪器和软件，按如下方式运行 PCR 循环程序。
   1. 将板放入实时荧光定量 PCR 仪器中。使用 Real-Time PCR 软件为每个孔中的样品和靶标 miRNA 分配名称。
   2. 根据说明在实时 PCR 软件中输入以下 PCR 循环条件：在 95 °C 下预孵育 15 分钟，然后在 94 °C 下变性 15 秒，在 55 °C 下退火 30 秒，并在 70 °C 下延伸 30 秒。
7. 使用实时 PCR 仪器的软件分析 qRT-PCR 数据。检查非特异性反应。分析解离曲线或熔解曲线，以确认未发生预期以外的扩增。
   1. 将靶 miRNA 的表达水平标准化为 RNU-6 作为内源性对照。使用 ^2-ΔΔCT 方法计算靶 miRNA 的相对表达水平¹¹。

结果

在这里，研究了 AKI 小鼠中的 miRNA 表达谱。已在小鼠的各种器官和组织中研究了 miRNA 表达谱。MiRNA 是重要的转录后调节因子，现在正在广泛研究包括 AKI 在内的各种疾病的表征。MiRNA 有可能帮助阐明病理状况并应用于 AKI¹² 的治疗。AKI 的主要原因是 IRI、肾毒性损伤和脓毒症。肾脏的 IRI 是 AKI 发展的主要危险因素之一。据报道，许多 miRNA 与 AKI

讨论

使用本手稿中提出的方案，使用 qRT-PCR 成功纯化和检测来自 IRI 小鼠肾脏的 miRNA。该方案中 IRI 诱导程序的关键点包括仔细监测体温和麻醉浓度，已知这些会影响 AKI²⁰。该方案的优势在于它允许目视确认是否已实现缺血再灌注。但是，此 IRI 模型存在一些限制。延长钳夹时间以诱导严重缺血会增加死亡率。此外，当使用左肾动脉钳夹无法实现肾缺血时，这...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primer	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420