Метод количественного определения микроРНК в почке мышиной модели с ишемическим повреждением почек

Резюме

В данной статье представлен протокол детектирования экспрессии микроРНК в почках мышиной модели с острым повреждением почек с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. В этом протоколе особое внимание уделяется мышиной модели ишемического повреждения почек и тщательному извлечению образцов микроРНК.

Аннотация

МикроРНК (микроРНК) участвуют в различных болезненных состояниях и являются эффективными биомаркерами для ранней диагностики заболеваний и лечения у мышей. Тем не менее, стандартные протоколы очистки микроРНК и обнаружения их экспрессии в почках мышей с острым повреждением почек (ОПП) не были хорошо установлены. В этом исследовании был разработан эффективный и простой протокол очистки и количественного определения микроРНК в почках мышиной модели ОПП, индуцированной ишемией-реперфузией почек, с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол включает в себя пять этапов: 1) индукция ОПП путем ишемии-реперфузии почек, 2) забор почек, 3) очистка общей РНК, включая микроРНК, из почек, 4) синтез кДНК путем обратной транскрипции микроРНК и 5) кОТ-ПЦР для определения экспрессии микроРНК. Используя этот протокол, можно создать модель ишемии-реперфузионного повреждения почек при легких и тяжелых формах ОПП. Кроме того, при правильном соблюдении процедуры можно получить согласованную модель ОПП с минимальными индивидуальными различиями. Этот анализ qRT-PCR показывает очень широкий динамический диапазон и позволяет различать зрелые микроРНК, которые могут быть точно количественно определены с высокой специфичностью. Этот протокол может быть использован для изучения профиля экспрессии микроРНК в почках ОПП.

Введение

Ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ) почек представляет собой один из основных факторов риска развития острого повреждения почек (ОПП)¹. ОПП играет значительную роль в прогнозе для пациентов, но специфические методы лечения и ранние диагностические биомаркеры не были установлены.

МикроРНК (микроРНК) — это короткие, некодирующие РНК, содержащие примерно 18–25 оснований. МикроРНК стабильны в жидкостях организма, и их последовательности высоко консервативны среди животных². МикроРНК регулируют экспрессию нескольких белков через тысячи мишеней, тем самым влияя на различные сигнальные пути 2,3,4,5,6,7,8. В последние годы сообщалось, что микроРНК участвуют в различных заболеваниях и являются эффективными биомаркерами для ранней диагностики ряда заболеваний.

Общая цель этого протокола заключается в успешной очистке и обнаружении микроРНК в почках мышиной модели ОПП, индуцированной IRI. Данная модель ИРИ является широко используемой моделью ОПП и фиброза почек. К преимуществам модели IRI можно отнести возможность визуального подтверждения того, была ли достигнута ишемия-реперфузия, и определения точного времени начала ОПП. Тем не менее, длительность зажима, достаточная для того, чтобы вызвать широкое повреждение канальцев, связана с высокой смертностью, в то время как короткая продолжительность зажима не вызывает повреждения канальцев, что приводит к большому разбросу прогрессирования повреждения канальцев в этой экспериментальной модели. По сравнению с моделью двустороннего зажима, правая ткань нефрэктомии, собранная в односторонней модели IRI почки, действует как контроль и обеспечивает почечную недостаточность.

Образец почки разминают с помощью стеклянного гомогенизатора, в котором разделяют белки и нуклеиновые кислоты, а также разделяют ДНК и РНК⁹. Общую РНК, включая микроРНК, выделяют из образца почки с помощью спиновой колонки⁹ на основе кремнеземной мембраны. В дальнейшем проводят синтез кДНК (обратную транскрипцию) из общей РНК с использованием поли(А)полимеразы и олиго-dT праймеров¹⁰. Наконец, экспрессию микроРНК определяют методом qRT-PCR с использованием интеркаляционного красителя¹⁰. qRT-PCR позволяет более точно количественно оценить экспрессию генов по сравнению с ПЦР объемов амплификации в конечных точках. qRT-PCR измеряет высокие концентрации и характеризуется широким динамическим диапазоном, что позволяет проводить точную количественную оценку, зависящую от количества циклов. В предыдущих исследованиях сообщалось, что для эффективной очистки и обнаружения микроРНК в тканях можно использовать простые процессы ^8,9,10. Описанные в данном протоколе методы синтеза кДНК (обратная транскрипция) и детектирования экспрессии микроРНК с помощью количественной ОТ-ПЦР с использованием интеркаляционного красителя, как сообщается, демонстрируют высокую точность и чувствительность¹⁰.

Кроме того, этот протокол прост и позволяет получать стабильные результаты между лабораториями. Поэтому этот протокол полезен в исследованиях, требующих высокоточного и чувствительного обнаружения микроРНК в почках ОПП мышей.

протокол

Все протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнены в соответствии с рекомендациями по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства по лабораторным животным Медицинского университета Джичи.

1. Модель IRI

ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за гипотермией, увлажнением кишечника и глубиной анестезии на протяжении всей процедуры.

1. Подготовьте следующие предметы: центрифужную пробирку объемом 50 мл с ватой, пропитанной изофлураном, нагретую хирургическую прокладку, чашку Петри с фосфатно-соевым буфером (PBS), хирургические ножницы и щипцы. Поддерживайте PBS на уровне 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель IRI была создана с использованием самцов мышей C57BL/6 (9 недель; 20–25 г), содержащихся в помещении с контролируемой температурой, влажностью и 12-часовым циклом света и темноты.
2. Обезболивайте животное изофлураном: индукционная концентрация 3–5%, поддерживающая концентрация 2–3%, концентрация при пережатии 1–1,5%. Подтвердите глубину обезболивания потерей рефлексов. Преимущество ингаляционной анестезии заключается в том, что время можно регулировать. Процедура может занять значительное количество времени из-за отшелушивания тканей, окружающих почку. Однако недостатком ингаляционной анестезии является то, что температура тела имеет тенденцию к снижению. На протяжении всей процедуры избегайте излишней анестезии.
3. Закрепите мышь под наркозом на нагретой хирургической прокладке на спине, удалите волосы вокруг области разреза и опрыскайте кожу живота мыши 70% этанолом.
4. Сделайте разрез по средней линии на коже живота, мышцах и перитонеальной оболочке с помощью ножниц и щипцов.
5. С помощью ватного тампона, смоченного в PBS, аккуратно надавите на кишечник в сторону левой стороны экстрабрюшной полости, обнажая правую почку и мочеточник. Длительное время процедуры может привести к послеоперационному повреждению кишечника. Таким образом, лучше оперировать без удаления кишечника из брюшной полости, когда можно получить поле зрения. Избегайте пересыхания кишечника. Сухие тампоны или марля могут вызвать повреждение кишечника.
6. Подтяните правый мочеточник с помощью угловых щипцов. Дважды перевязать правый мочеточник с помощью шелковых швов 4/0. Разрежьте между швами, оставив шов, который находится ближе к почке, дольше.
7. Аккуратно придерживайте оставшийся шов, не вытягивая слишком сильно, и тупо рассеките соединительную ткань и жир вдоль почки. Проведение операции сзади снижает риск повреждения печени.
   1. Определите кровеносный сосуд, отличный от почечных артерий и вен, который снабжает кровью правую почку, а затем перевязайте или клипируйте его. Когда правая почка достаточно отделена, перевяжите правую почечную артерию и вену с помощью шелкового шва 4/0. Вместо наложения швов используйте кровоостанавливающий зажим.
   2. С помощью ватного тампона, смоченного в PBS, аккуратно протолкните кишечник в сторону правой стороны экстрабрюшной полости, чтобы обнажить левую почку, а затем накройте кишечник увлажненной простыней, чтобы предотвратить ее пересыхание. Рассеките соединительную ткань и жир вокруг левой почки.
8. Определите кровеносный сосуд, отличный от почечных артерий и вен, который снабжает кровью левую почку, а затем перевязайте или обрежьте его. Зажмите почечную артерию и почечную вену, чтобы вызвать ишемию левой почки. Расположите кровоостанавливающий зажим примерно в 1 см от почки, чтобы избежать повреждения почечной паренхимы. Успешная ишемия может быть визуально подтверждена постепенным равномерным потемнением почки.
9. Вернуть кишечник в брюшную полость, стараясь не допускать кишечного закручивания; Временно закройте кожу живота и наложите простыню для поддержания влажной среды. Максимально уменьшите концентрацию ингаляционного наркоза и старайтесь держать животное в тепле. Время зажима составляет 25–45 минут. Более длительное время пережатия приводит к более серьезному повреждению почек, но также увеличивает долгосрочную смертность. Скорректируйте, проанализировав результаты патологоанатомического исследования.
10. Снимите зажим после того, как период ишемии завершится. Следите за тем, чтобы кровоток, реперфузия и цвет почек улучшились. Убедитесь, что кишечник не перекручен, прежде чем закрывать кожу живота. Закапывайте PBS внутрибрюшинно в качестве объемной добавки до того, как живот будет закрыт в два слоя. Закройте кожу живота с помощью нейлоновых швов 4-0. При более длительных периодах удаления почек возможность кишечных спаек может быть снижена путем раздельного закрытия брюшной стенки и брюшины.
11. Чтобы свести к минимуму риск послеоперационной инфекции, нанесите антисептик (например, раствор йода/спирта) на операционную область.

2. Забор образцов почек

ПРИМЕЧАНИЕ: Это видео имеет время зажима 45 минут, сбор почек через 24 часа.

1. Обезболить животное 5% изофлураном и подтвердить глубину обезболивания потерей рефлексов.
2. Сделайте разрез по средней линии на коже живота, мышцах и перитонеальной оболочке с помощью ножниц и щипцов. Соберите кровь из нижней полой вены, проколотой иглой 27 G.
3. Сделайте разрез по средней линии в грудной стенке и введите иглу 23 G в левый желудочек. Подтвердите обратный поток. Сделайте разрез в печени и введите 20 мл PBS. По мере того, как кровь оттекает, печень меняет цвет с красного на розовый, подтверждая, что было слито достаточное количество крови.
4. Удалите левую почку с помощью щипцов и ножниц и промойте ее PBS в чашке Петри. Удалите почечную фасцию с помощью щипцов, стараясь не пересушить почку.
5. Разрежьте почку пополам и используйте одну половину для гистопатологии, а другую половину для следующего этапа. Избегайте почечной лоханки и заготавливайте 30 мг почки. Перед использованием храните при температуре −80 °C.

3. Очистка микроРНК из образцов почек

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь образцы почек весом 30 мг гомогенизируются с помощью стеклянного гомогенизатора и системы измельчения биополимеров в микроцентрифужной спиновой колонне. Затем микроРНК из образца почки выделяют с помощью спиновой колонки на основе кремнеземной мембраны.

1. Подготовьте следующие изделия: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл, 100% этанол, хлороформ, стеклянный гомогенизатор, лед, систему измельчения биополимеров в микроцентрифужной спиновой колонне⁹, спиновые колонки⁹ на основе кремнеземных мембран, лизисный реагент на основе фенола/гуанидина, промывочный буфер, содержащий гуанидин и этанол (промывочный буфер 1), и промывочный буфер, содержащий этанол (промывочный буфер 2).
2. Поместите образец почки в дозе 30 мг в стеклянный гомогенизатор и добавьте 700 мкл реагента для лизиса на основе фенола/гуанидина. Выполняйте этот этап на льду, потому что ткань денатурируется под воздействием тепла.
3. Гомогенизируйте образец почки, медленно надавливая пестиком на образец, поворачивая его. Повторите этот процесс несколько десятков раз на льду до тех пор, пока образец почки полностью не растворится в реагенте для лизиса на основе фенола/гуанидина. Когда при последующих измерениях микроРНК не получаются, это, вероятно, происходит из-за недостаточного растворения.
4. Для дальнейшей гомогенизации гомогенизированный лизат необходимо перенести в систему измельчения биополимеров в микроцентрифужной спин-колонне, помещенной в сборную пробирку объемом 2,0 мл. Центрифугируйте при 14 000 × г в течение 3 минут при комнатной температуре.
5. Перенесите гомогенизированный лизат в новую микроцентрифужную пробирку.
6. Добавьте 140 μл хлороформа в гомогенизированный лизат и надежно закройте пробирку. Перемешиваем пробирку методом инверсии в течение 15 с.
7. Инкубируйте образцы в течение 2–3 минут при комнатной температуре. Затем центрифугируйте их при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
8. Перенесите надосадочную жидкость (обычно 300 μл) в новую микроцентрифужную пробирку, не нарушая осадок, и добавьте 1,5 объема (обычно 450 μл) 100% этанола. Перемешиваем образец путем вортексирования в течение 5 с.
9. Дозируйте до 700 мкл образца в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны, помещенную в пробирку для сбора объемом 2,0 мл. Закройте крышку колонны и центрифугируйте при давлении 15 000 × g в течение 15 с. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
10. Добавьте 700 мкл промывочного буфера 1 в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны для тщательной промывки образца. Закройте крышку колонки и центрифугируйте ее при давлении 15 000 × г в течение 15 с. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
11. Добавьте 500 μL промывочного буфера 2 в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны, чтобы удалить любые следы соли. Закройте крышку колонны и центрифугируйте при давлении 15 000 × g в течение 15 с. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
    1. Повторите шаг 3.11.
12. Снова центрифугируйте спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны при давлении 15 000 × g в течение 1 мин. После центрифугирования выбросьте проточный поток в сборную трубку.
13. Поместите спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны в новую пробирку для сбора объемом 1,5 мл. Перелейте в колонку 25 μЛ воды, не содержащей РНКазы, и закройте крышку колонки. Оставьте образец при комнатной температуре на 5 минут, а затем центрифугируйте его при 15 000 × г в течение 1 минуты.
14. Перенесите 25 мкл элюата, содержащего микроРНК, в новую микроцентрифужную пробирку. Поскольку микроРНК разрушается при повторном растворении, рекомендуется дозировать образец в 2 или 3 пробирки. Храните их при температуре −80 °C перед использованием.

4. Обратная транскрипция микроРНК

Примечание: Здесь 1,0 мкг выделенной РНК реверсивно транскрибируется с использованием обратной транскриптазы, поли(А)полимеразы и олиго-dT-праймеров.

1. Подготовьте следующие предметы: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл; 8-луночные стрип-трубки; Вода без РНКазы; лёд; смесь нуклеиновых кислот из 10 раз, содержащая дезоксинуклеотиды, рибонуклеотидтрифосфаты и олиго-dT-праймеры; смесь поли(А)полимеразы и обратной транскриптазы; и активирующий буфер, включающий Mg²⁺, дезоксирибонуклеотиды, олиго-dT-праймеры и случайные праймеры¹⁰.
2. Приготовьте исходный раствор смеси, содержащий 2,0 мкл 10x смеси нуклеиновых кислот, 2,0 мкл смеси поли(А)полимеразы и обратной транскриптазы и 4,0 мкл 5x активирующего буфера, включая Mg²⁺, дезоксирибонуклеотиды, олиго-dT-праймеры и случайные праймеры, всего 8,0 мкл на пробирку.
3. Раздайте по 8,0 мкл раствора мастер-смеси в каждую пробирку.
4. Добавьте в каждую пробирку по 1,0 мкг выделенных микроРНК, выделенных из образца почки.
5. Добавьте воду, не содержащую РНКазы, в каждую пробирку в общей сложности 20 μл. Тщательно перемешайте с помощью пипетирования и центрифугируйте при 1500 x g в течение 15 с.
6. Образцы инкубируют в течение 60 мин при 37 °С, после чего немедленно проводят инкубацию в течение 5 мин при 95 °С. Этот этап можно выполнить в термоамплификаторе.
7. Перенесите кДНК в новую микроцентрифужную пробирку и разбавьте в 10 раз (1:10) водой, не содержащей РНКазы.
8. Перед применением разведенную кДНК храните в краткосрочном состоянии на льду и в течение длительного времени при температуре -80 °C.

5. qRT-ПЦР микроРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: qRT-ПЦР микроРНК проводится с использованием интеркаляционного красителя. Здесь были использованы праймеры для U6 small nuclear 2 (РНК-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p и miRNA-574-5p.

1. Подготовьте следующие предметы: микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, 96-луночные реакционные планшеты для qRT-PCR, адгезивную пленку для 96-луночного реакционного планшета, микроРНК-специфичные праймеры, мастер-смесь для ПЦР, состоящую из Taq-ДНК-полимеразы, ПЦР-буфера, дезоксинуклеотидов и универсальных праймеров¹⁰, а также прибор для ПЦР в реальном времени.
2. Приготовьте мастер-смесь, содержащую 12,5 мкл 2x PCR Master Mix, 2,5 мкл каждого праймера микроРНК (5 мкМ), растворенного в воде, не содержащей нуклеаз, и 1,25 мкл 10x универсальных праймеров для каждой лунки.
3. Дозируйте 22,5 мкл мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.
4. Добавьте по 2,5 мкл матричной кДНК в каждую лунку.
5. Заклейте планшет клейкой пленкой для 96-луночного реакционного планшета. Затем центрифугируйте планшет при давлении 1 000 × г в течение 30 с.
6. Используя прибор и программное обеспечение для ПЦР в режиме реального времени, запустите циклическую программу ПЦР следующим образом.
   1. Поместите планшет в прибор для ПЦР в реальном времени. Присвойте имя образцу и целевой микроРНК в каждой лунке с помощью программного обеспечения для ПЦР в реальном времени.
   2. Введите следующие условия цикличности ПЦР в программное обеспечение для ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкциями: предварительная инкубация при 95 °C в течение 15 минут, затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и продление при 70 °C в течение 30 с.
7. Анализируйте данные qRT-PCR с помощью программного обеспечения прибора для ПЦР в реальном времени. Проверьте наличие неспецифических реакций. Проанализируйте кривую диссоциации или кривую плавления, чтобы убедиться, что усиления, отличного от запланированного, не произошло.
   1. Нормализовать уровень экспрессии мишенных микроРНК к РНУ-6 в качестве эндогенного контроля. Рассчитали относительный уровень экспрессии мишенных микроРНК с помощью метода 2^{−ΔΔCT 11}.

Результаты

В данной работе был исследован профиль экспрессии микроРНК у мышей с ОПП. Профиль экспрессии микроРНК был исследован в различных органах и тканях мышей. МикроРНК являются важными посттранскрипционными регуляторами и в настоящее время широко изучаются для характери?...

Обсуждение

С использованием протокола, представленного в данной рукописи, микроРНК из почек мышей IRI были успешно очищены и обнаружены с помощью qRT-PCR. Критические моменты процедуры, индуцирующей ИРИ в протоколе, включают тщательный мониторинг температуры тела и концентраций ан?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primer	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420