Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
В данной статье представлен протокол детектирования экспрессии микроРНК в почках мышиной модели с острым повреждением почек с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. В этом протоколе особое внимание уделяется мышиной модели ишемического повреждения почек и тщательному извлечению образцов микроРНК.
МикроРНК (микроРНК) участвуют в различных болезненных состояниях и являются эффективными биомаркерами для ранней диагностики заболеваний и лечения у мышей. Тем не менее, стандартные протоколы очистки микроРНК и обнаружения их экспрессии в почках мышей с острым повреждением почек (ОПП) не были хорошо установлены. В этом исследовании был разработан эффективный и простой протокол очистки и количественного определения микроРНК в почках мышиной модели ОПП, индуцированной ишемией-реперфузией почек, с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол включает в себя пять этапов: 1) индукция ОПП путем ишемии-реперфузии почек, 2) забор почек, 3) очистка общей РНК, включая микроРНК, из почек, 4) синтез кДНК путем обратной транскрипции микроРНК и 5) кОТ-ПЦР для определения экспрессии микроРНК. Используя этот протокол, можно создать модель ишемии-реперфузионного повреждения почек при легких и тяжелых формах ОПП. Кроме того, при правильном соблюдении процедуры можно получить согласованную модель ОПП с минимальными индивидуальными различиями. Этот анализ qRT-PCR показывает очень широкий динамический диапазон и позволяет различать зрелые микроРНК, которые могут быть точно количественно определены с высокой специфичностью. Этот протокол может быть использован для изучения профиля экспрессии микроРНК в почках ОПП.
Ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ) почек представляет собой один из основных факторов риска развития острого повреждения почек (ОПП)1. ОПП играет значительную роль в прогнозе для пациентов, но специфические методы лечения и ранние диагностические биомаркеры не были установлены.
МикроРНК (микроРНК) — это короткие, некодирующие РНК, содержащие примерно 18–25 оснований. МикроРНК стабильны в жидкостях организма, и их последовательности высоко консервативны среди животных2. МикроРНК регулируют экспрессию нескольких белков через тысячи мишеней, тем самым влияя на различные сигнальные пути 2,3,4,5,6,7,8. В последние годы сообщалось, что микроРНК участвуют в различных заболеваниях и являются эффективными биомаркерами для ранней диагностики ряда заболеваний.
Общая цель этого протокола заключается в успешной очистке и обнаружении микроРНК в почках мышиной модели ОПП, индуцированной IRI. Данная модель ИРИ является широко используемой моделью ОПП и фиброза почек. К преимуществам модели IRI можно отнести возможность визуального подтверждения того, была ли достигнута ишемия-реперфузия, и определения точного времени начала ОПП. Тем не менее, длительность зажима, достаточная для того, чтобы вызвать широкое повреждение канальцев, связана с высокой смертностью, в то время как короткая продолжительность зажима не вызывает повреждения канальцев, что приводит к большому разбросу прогрессирования повреждения канальцев в этой экспериментальной модели. По сравнению с моделью двустороннего зажима, правая ткань нефрэктомии, собранная в односторонней модели IRI почки, действует как контроль и обеспечивает почечную недостаточность.
Образец почки разминают с помощью стеклянного гомогенизатора, в котором разделяют белки и нуклеиновые кислоты, а также разделяют ДНК и РНК9. Общую РНК, включая микроРНК, выделяют из образца почки с помощью спиновой колонки9 на основе кремнеземной мембраны. В дальнейшем проводят синтез кДНК (обратную транскрипцию) из общей РНК с использованием поли(А)полимеразы и олиго-dT праймеров10. Наконец, экспрессию микроРНК определяют методом qRT-PCR с использованием интеркаляционного красителя10. qRT-PCR позволяет более точно количественно оценить экспрессию генов по сравнению с ПЦР объемов амплификации в конечных точках. qRT-PCR измеряет высокие концентрации и характеризуется широким динамическим диапазоном, что позволяет проводить точную количественную оценку, зависящую от количества циклов. В предыдущих исследованиях сообщалось, что для эффективной очистки и обнаружения микроРНК в тканях можно использовать простые процессы 8,9,10. Описанные в данном протоколе методы синтеза кДНК (обратная транскрипция) и детектирования экспрессии микроРНК с помощью количественной ОТ-ПЦР с использованием интеркаляционного красителя, как сообщается, демонстрируют высокую точность и чувствительность10.
Кроме того, этот протокол прост и позволяет получать стабильные результаты между лабораториями. Поэтому этот протокол полезен в исследованиях, требующих высокоточного и чувствительного обнаружения микроРНК в почках ОПП мышей.
Все протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнены в соответствии с рекомендациями по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства по лабораторным животным Медицинского университета Джичи.
1. Модель IRI
ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за гипотермией, увлажнением кишечника и глубиной анестезии на протяжении всей процедуры.
2. Забор образцов почек
ПРИМЕЧАНИЕ: Это видео имеет время зажима 45 минут, сбор почек через 24 часа.
3. Очистка микроРНК из образцов почек
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь образцы почек весом 30 мг гомогенизируются с помощью стеклянного гомогенизатора и системы измельчения биополимеров в микроцентрифужной спиновой колонне. Затем микроРНК из образца почки выделяют с помощью спиновой колонки на основе кремнеземной мембраны.
4. Обратная транскрипция микроРНК
Примечание: Здесь 1,0 мкг выделенной РНК реверсивно транскрибируется с использованием обратной транскриптазы, поли(А)полимеразы и олиго-dT-праймеров.
5. qRT-ПЦР микроРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: qRT-ПЦР микроРНК проводится с использованием интеркаляционного красителя. Здесь были использованы праймеры для U6 small nuclear 2 (РНК-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p и miRNA-574-5p.
В данной работе был исследован профиль экспрессии микроРНК у мышей с ОПП. Профиль экспрессии микроРНК был исследован в различных органах и тканях мышей. МикроРНК являются важными посттранскрипционными регуляторами и в настоящее время широко изучаются для характери?...
С использованием протокола, представленного в данной рукописи, микроРНК из почек мышей IRI были успешно очищены и обнаружены с помощью qRT-PCR. Критические моменты процедуры, индуцирующей ИРИ в протоколе, включают тщательный мониторинг температуры тела и концентраций ан?...
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Мы благодарим Нама Нгуена, доктора философии, за редактирование черновика этой рукописи.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook | Natsume Seisakusho | MA-47 | |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
C57B6 mice | SLC | not assign | |
forcep with Teeth | Natsume Seisakusho | MA-49 | |
forcep without Teeth | Natsume Seisakusho | MA-48-1 | |
Hemostatic clips | Natsume Seisakusho | KN−353 | |
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-132-3p primer | Qiagen | MS00003458 | 5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG |
miRNA-17-5p primer | Qiagen | MS00029274 | 5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG |
miRNA-18a-5p primer | Qiagen | MS00031514 | 5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG |
miRNA-212-3p primer | Qiagen | MS00003815 | 5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC |
miRNA-21a-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA |
miRNA-574-5p primer | Qiagen | MS00043617 | 5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
surgical scissors | Natsume Seisakusho | B-2 | |
Vascular clip applier | VITALITEC | 1621420 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены