Um método de detecção quantitativa para microRNAs no rim de um modelo de camundongo com lesão renal isquêmica

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo para detectar a expressão de microRNAs nos rins de um modelo de camundongo com lesão renal aguda usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real. Este protocolo enfatiza um modelo de camundongo com lesão renal isquêmica e a extração cuidadosa de amostras de microRNA.

Resumo

Os microRNAs (miRNAs) estão envolvidos em vários estados de doença e são biomarcadores eficazes para o diagnóstico precoce de doenças e tratamento em camundongos. No entanto, protocolos padrão para a purificação de miRNAs e detecção de sua expressão nos rins de camundongos com lesão renal aguda (LRA) não foram bem estabelecidos. Este estudo desenvolveu um protocolo eficaz e simples para purificar e quantificar miRNAs nos rins de um modelo de camundongo com LRA induzido por isquemia-reperfusão renal usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo compreende cinco etapas: 1) indução de LRA por isquemia-reperfusão renal, 2) coleta de rins, 3) purificação de RNA total, incluindo miRNAs, dos rins, 4) síntese de cDNA por transcrição reversa de miRNA e 5) qRT-PCR para detectar a expressão de miRNA. Usando este protocolo, o modelo de lesão de isquemia-reperfusão renal pode ser gerado com formas leves a graves de LRA. Além disso, se o procedimento for seguido corretamente, um modelo consistente de LRA com diferenças individuais mínimas pode ser obtido. Este ensaio qRT-PCR mostra uma faixa dinâmica muito ampla e permite a discriminação de miRNAs maduros, que podem ser quantificados com precisão e alta especificidade. Este protocolo pode ser usado para estudar o perfil de expressão de miRNAs em rins com LRA.

Introdução

A lesão de isquemia-reperfusão (IRI) do rim representa um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de lesão renal aguda (LRA)¹. A LRA desempenha um papel significativo no prognóstico do paciente, mas terapias específicas e biomarcadores diagnósticos precoces não foram estabelecidos.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs curtos e não codificantes com aproximadamente 18–25 bases. Os miRNAs são estáveis em fluidos corporais e suas sequências são altamente conservadas entre os animais². Os miRNAs regulam a expressão de múltiplas proteínas por meio de milhares de alvos, influenciando assim diversas vias de sinalização 2,3,4,5,6,7,8. Nos últimos anos, tem sido relatado que os miRNAs estão envolvidos em vários estados de doença e são biomarcadores eficazes para o diagnóstico precoce de várias doenças.

O objetivo geral deste protocolo é purificar e detectar com sucesso miRNAs nos rins de um modelo de camundongo com LRA induzido por IRI. Este modelo IRI é um modelo amplamente utilizado de LRA e fibrose renal. As vantagens do modelo IRI incluem a capacidade de confirmar visualmente se a isquemia-reperfusão foi alcançada e determinar o momento exato do início da LRA. No entanto, uma duração de pinça longa o suficiente para causar dano tubular amplo está associada a uma alta taxa de mortalidade, enquanto uma curta duração de pinça não causa dano tubular, o que resulta em uma grande variação na progressão do dano tubular neste modelo experimental. Em comparação com o modelo de pinçamento bilateral, o tecido de nefrectomia direita colhido no modelo de IRI renal unilateral atua como controle e garante a insuficiência renal.

A amostra de rim é triturada usando um homogeneizador de vidro, no qual proteínas e ácidos nucléicos são separados e DNA e RNA são separados⁹. O RNA total, incluindo o miRNA, é purificado da amostra de rim usando uma coluna de spin à base de membrana de sílica⁹. Posteriormente, a síntese de cDNA (transcrição reversa) é realizada a partir do RNA total usando primers poli(A) polimerase e oligo-dT¹⁰. Finalmente, a expressão do miRNA é determinada por qRT-PCR usando um corante intercalante¹⁰. qRT-PCR pode quantificar com mais precisão a expressão gênica em comparação com a PCR de volumes de amplificação nos pontos finais. O qRT-PCR mede altas concentrações e é caracterizado por uma ampla faixa dinâmica, que permite uma quantificação precisa que depende do número de ciclos. Estudos anteriores relataram que processos simples poderiam ser usados para purificar e detectar efetivamente miRNAs em tecidos ^8,9,10. Os métodos descritos neste protocolo para a síntese de cDNA (transcrição reversa) e a detecção da expressão de miRNAs por qRT-PCR usando um corante intercalante foram relatados como mostrando alta precisão e sensibilidade¹⁰.

Além disso, este protocolo é simples e alcança resultados consistentes entre laboratórios. Portanto, este protocolo é útil em estudos que requerem detecção de miRNA altamente precisa e sensível em rins de LRA de camundongos.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Jichi Medical University e realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Guia da Jichi Medical University para Animais de Laboratório.

1. Modelo IRI

NOTA: Monitore cuidadosamente a hipotermia, a hidratação intestinal e a profundidade da anestesia durante todo o procedimento.

1. Prepare os seguintes itens: um tubo de centrífuga de 50 mL contendo algodão embebido em isoflurano, uma almofada cirúrgica aquecida, uma placa de Petri com solução salina tamponada com fosfato (PBS), tesoura cirúrgica e pinça. Mantenha o PBS a 37 °C.
   NOTA: Este modelo IRI foi gerado usando camundongos C57BL / 6 machos (9 semanas; 20-25 g) alojados em uma sala com temperatura controlada, umidade e um ciclo claro-escuro de 12 horas.
2. Anestesiar o animal com isoflurano: concentração de indução de 3% a 5%, concentração de manutenção de 2% a 3% e concentração durante o clampeamento de 1% a 1,5%. Confirme a profundidade da anestesia pela perda de reflexos. A anestesia inalatória tem a vantagem de que o tempo pode ser ajustado. O procedimento pode levar um tempo significativo devido à esfoliação do tecido ao redor do rim. No entanto, a desvantagem da anestesia inalatória é que a temperatura corporal tende a cair. Durante todo o procedimento, evite anestesia desnecessária.
3. Monte o camundongo anestesiado em uma almofada cirúrgica aquecida nas costas, remova os pelos ao redor da área da incisão e borrife a pele abdominal do camundongo com etanol a 70%.
4. Faça uma incisão na linha média na pele abdominal, músculo e membrana peritoneal usando tesoura e fórceps.
5. Usando um cotonete umedecido com PBS, empurre suavemente o intestino em direção ao lado esquerdo da cavidade extra-abdominal, expondo o rim e o ureter direitos. O longo tempo de procedimento provavelmente causará lesão intestinal pós-operatória. Assim, é melhor operar sem remover os intestinos da cavidade abdominal quando um campo visual pode ser obtido. Evite secar os intestinos. Cotonetes secos ou gaze podem causar danos intestinais.
6. Levante o ureter direito com uma pinça angular. Ligue o ureter direito duas vezes usando suturas trançadas de seda 4/0. Corte entre as suturas, deixando a sutura mais próxima do rim por mais tempo.
7. Segure cuidadosamente a sutura restante sem puxar muito e disseque sem rodeios o tecido conjuntivo e a gordura ao longo do rim. Realizar a cirurgia por trás reduz o risco de danos ao fígado.
   1. Identifique um vaso sanguíneo, além das artérias e veias renais, que fornece sangue ao rim direito e, em seguida, ligue-o ou corte-o. Quando o rim direito estiver suficientemente descolado, ligue a artéria e a veia renal direita usando uma sutura trançada de seda 4/0. Em vez de suturar, use um clipe hemostático.
   2. Usando um cotonete umedecido com PBS, empurre suavemente o intestino em direção ao lado direito da cavidade extra-abdominal para expor o rim esquerdo e, em seguida, cubra o intestino com uma cortina umedecida para evitar que seque. Disseque o tecido conjuntivo e a gordura ao redor do rim esquerdo.
8. Identifique um vaso sanguíneo, além das artérias e veias renais, que fornece sangue ao rim esquerdo e, em seguida, ligue-o ou corte-o. Clampeie a artéria renal e a veia renal para induzir a isquemia do rim esquerdo. Posicione o clipe hemostático a aproximadamente 1 cm do rim para evitar danos ao parênquima renal. A isquemia bem-sucedida pode ser confirmada visualmente por um escurecimento gradual e uniforme do rim.
9. Retorne os intestinos para a cavidade abdominal, tomando cuidado para evitar torções intestinais; Feche temporariamente a pele abdominal e cubra para manter um ambiente úmido. Reduza a concentração de anestesia inalatória o máximo possível e tente manter o animal aquecido. O tempo de fixação é de 25 a 45 min. Um tempo de pinçamento mais longo induz danos renais mais graves, mas também aumenta a mortalidade a longo prazo. Ajuste analisando os resultados da patologia.
10. Remova o grampo após o término do período de isquemia. Certifique-se de que a reperfusão do fluxo sanguíneo e a cor dos rins melhorem. Confirme se o intestino não está torcido antes de fechar a pele abdominal. Instilar PBS por via intraperitoneal como um suplemento de volume antes que o abdômen seja fechado em duas camadas. Feche a pele abdominal usando suturas de náilon 4-0. Para períodos de remoção renal mais longos, a possibilidade de aderências intestinais pode ser reduzida fechando separadamente a parede abdominal e o peritônio.
11. Para minimizar o risco de infecção pós-operatória, aplique um antisséptico (por exemplo, solução de iodo/álcool) na área cirúrgica.

2. Coleta de amostras renais

NOTA: Este vídeo tem um tempo de clampeamento de 45 min, coletando os rins 24 h depois.

1. Anestesiar o animal com isoflurano a 5% e confirmar a profundidade da anestesia pela perda dos reflexos.
2. Faça uma incisão na linha média na pele abdominal, músculo e membrana peritoneal usando tesoura e fórceps. Colete o sangue da veia cava inferior perfurada por uma agulha de 27 G.
3. Faça uma incisão na linha média na parede torácica e insira uma agulha 23 G no ventrículo esquerdo. Confirme o refluxo. Faça uma incisão no fígado e injete 20 mL de PBS. À medida que o sangue é drenado, o fígado muda de cor de vermelho para rosa, confirmando que sangue suficiente foi drenado.
4. Remova o rim esquerdo usando uma pinça e tesoura e lave-o com PBS em uma placa de Petri. Remova a fáscia renal com uma pinça, tomando cuidado para não ressecar o rim.
5. Corte o rim ao meio e use uma metade para histopatologia e a outra metade para a próxima etapa. Evite a pelve renal e colha 30 mg do rim. Armazene-o a -80 °C antes de usar.

3. Purificação de miRNAs de amostras renais

NOTA: Aqui, amostras de rim pesando 30 mg são homogeneizadas usando um homogeneizador de vidro e um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de rotação de microcentrífuga. Posteriormente, o miRNA da amostra de rim é isolado usando uma coluna de spin à base de membrana de sílica.

1. Prepare os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 ou 2,0 mL, etanol 100%, clorofórmio, homogeneizador de vidro, gelo, sistema de trituração de biopolímeros em coluna de centrifugação^de microcentrífuga 9, colunas de centrifugação à base de membrana de sílica⁹, reagente de lise à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem contendo guanidina e etanol (tampão de lavagem 1) e tampão de lavagem contendo etanol (tampão de lavagem 2).
2. Coloque uma amostra de rim de 30 mg em um homogeneizador de vidro e adicione 700 μL de reagente de lise à base de fenol / guanidina. Execute esta etapa no gelo porque o tecido é desnaturado pelo calor.
3. Homogeneizar a amostra de rim pressionando lentamente o pilão sobre a amostra, torcendo-a. Repita esse processo várias dezenas de vezes no gelo até que a amostra de rim esteja completamente dissolvida no reagente de lise à base de fenol / guanidina. Quando o miRNA não é obtido em medições subsequentes, isso provavelmente se deve à dissolução insuficiente.
4. Para maior homogeneização, transfira o lisado homogeneizado para o sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga colocada em um tubo de coleta de 2,0 mL. Centrifugue a 14.000 × g por 3 min em temperatura ambiente.
5. Transferir o lisado homogeneizado para um novo tubo de microcentrífuga.
6. Adicione 140 μL de clorofórmio ao lisado homogeneizado e tampe o tubo com segurança. Misture o tubo por inversão por 15 s.
7. Incube as amostras por 2–3 min em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue-os a 12.000 × g por 15 min a 4 °C.
8. Transfira o sobrenadante (normalmente 300 μL) para um novo tubo de microcentrífuga sem perturbar o precipitado e adicione 1,5 volumes (normalmente 450 μL) de etanol a 100%. Misturar a amostra por vórtice durante 5 s.
9. Pipete até 700 μL da amostra em uma coluna giratória à base de membrana de sílica colocada em um tubo de coleta de 2,0 mL. Feche a tampa da coluna e centrifugue a 15.000 × g por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de coleta.
10. Adicione 700 μL de tampão de lavagem 1 à coluna giratória à base de membrana de sílica para lavar completamente a amostra. Feche a tampa da coluna e centrifugue-a a 15.000 × g por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de coleta.
11. Adicione 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna de centrifugação à base de membrana de sílica para remover quaisquer vestígios de sal. Feche a tampa da coluna e centrifugue a 15.000 × g por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de coleta.
    1. Repita a etapa 3.11.
12. Centrifugue novamente a coluna de centrifugação à base de membrana de sílica a 15.000 × g por 1 min. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de coleta.
13. Coloque a coluna giratória à base de membrana de sílica em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Transfira 25 μL de água livre de RNase para a coluna e feche a tampa da coluna. Deixe a amostra em temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, centrifugue-a a 15.000 × g por 1 min.
14. Transferir o eluído de 25 μL contendo miRNAs para um novo tubo de microcentrífuga. Como o miRNA é degradado por dissolução repetida, recomenda-se dispensar a amostra em 2 ou 3 tubos. Armazene-os a -80 °C antes de usar.

4. Transcrição reversa de miRNA

NOTA: Aqui, 1,0 μg de RNA isolado é transcrito reversamente usando transcriptase reversa, poli(A) polimerase e oligo-dT primers.

1. Prepare os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL; Tubos de tira de 8 poços; Água livre de RNase; gelo; uma mistura de ácido nucleico 10x contendo desoxinucleotídeos, trifosfatos de ribonucleotídeos e oligo-dT uma mistura de poli(A)polimerase e transcriptase reversa; e tampão ativador, incluindo Mg²⁺, desoxirribonucleotídeos, oligo-dT
2. Prepare uma solução master mix contendo 2,0 μL de mistura de ácido nucleico 10x, 2,0 μL de poli(A) polimerase e mistura de transcriptase reversa e 4,0 μL de tampão ativador 5x, incluindo Mg²⁺, desoxirribonucleotídeos, oligo-dT primers e primers aleatórios, para um total de 8,0 μL por tubo.
3. Dispense 8,0 μL da solução da mistura principal em cada tubo.
4. Adicione 1,0 μg de miRNAs isolados purificados da amostra de rim a cada tubo.
5. Adicione água sem RNase a cada tubo até um total de 20 μL. Misture bem por pipetagem e centrifugue a 1.500 x g por 15 s.
6. Incubar as amostras durante 60 min a 37 °C, seguido imediatamente de incubação durante 5 min a 95 °C. Esta etapa pode ser realizada em um termociclador.
7. Transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga e dilua 10 vezes (1:10) com água sem RNase.
8. Armazene o cDNA diluído a curto prazo no gelo e a longo prazo a -80 ° C antes do uso.

5. qRT-PCR de miRNA

NOTA: qRT-PCR de miRNA é realizado usando um corante intercalante. Aqui, foram utilizados primers para U6 pequeno nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p e miRNA-574-5p.

1. Prepare os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, placas de reação de 96 poços para qRT-PCR, filme adesivo para a placa de reação de 96 poços, primers específicos para miRNA, PCR Master Mix compreendendo Taq DNA polimerase, tampão de PCR, desoxinucleotídeos e primers universais¹⁰ e um instrumento de PCR em tempo real.
2. Prepare uma master mix contendo 12,5 μL de 2x PCR Master Mix, 2,5 μL de cada primer de miRNA (5 μM) dissolvido em água livre de nuclease e 1,25 μL de 10x primers universais para cada poço.
3. Dispense 22,5 μL da mistura principal em cada poço da placa de 96 poços.
4. Adicione 2,5 μL de cDNA molde a cada poço.
5. Sele a placa com o filme adesivo para a placa de reação de 96 poços. Em seguida, centrifugue a placa a 1.000 × g por 30 s.
6. Usando o instrumento e o software de PCR em tempo real, execute o programa de ciclagem de PCR da seguinte maneira.
   1. Coloque a placa no instrumento de PCR em tempo real. Atribua um nome à amostra e ao miRNA alvo em cada poço usando o software de PCR em tempo real.
   2. Insira as seguintes condições de ciclagem de PCR no software de PCR em tempo real de acordo com as instruções: pré-incubação a 95 °C por 15 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 15 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 70 °C por 30 s.
7. Analise os dados de qRT-PCR usando o software do instrumento de PCR em tempo real. Verifique se há reações inespecíficas. Analise a curva de dissociação ou a curva de fusão para confirmar que não ocorreu amplificação diferente da pretendida.
   1. Normalize o nível de expressão de miRNAs alvo para RNU-6 como um controle endógeno. Calcule o nível de expressão relativa dos miRNAs alvo usando o método 2^{−ΔΔCT 11}.

Resultados

Aqui, o perfil de expressão de miRNA em camundongos com LRA foi investigado. O perfil de expressão de miRNAs tem sido investigado em vários órgãos e tecidos em camundongos. Os miRNAs são importantes reguladores pós-transcricionais e agora estão sendo extensivamente estudados na caracterização de uma variedade de doenças, incluindo LRA. Os miRNAs têm o potencial de ajudar a elucidar condições patológicas e ser aplicados no tratamento da LRA¹². As pri...

Discussão

Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, miRNAs do rim de camundongos IRI foram purificados e detectados com sucesso usando qRT-PCR. Os pontos críticos do procedimento indutor de IRI no protocolo incluem o monitoramento cuidadoso da temperatura corporal e das concentrações anestésicas, que são conhecidas por afetar a LRA²⁰. A força deste protocolo é que ele permite a confirmação visual de se a isquemia-reperfusão foi alcançada. No entanto, exist...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
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miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420