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Method Article
Este artigo apresenta um protocolo para detectar a expressão de microRNAs nos rins de um modelo de camundongo com lesão renal aguda usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real. Este protocolo enfatiza um modelo de camundongo com lesão renal isquêmica e a extração cuidadosa de amostras de microRNA.
Os microRNAs (miRNAs) estão envolvidos em vários estados de doença e são biomarcadores eficazes para o diagnóstico precoce de doenças e tratamento em camundongos. No entanto, protocolos padrão para a purificação de miRNAs e detecção de sua expressão nos rins de camundongos com lesão renal aguda (LRA) não foram bem estabelecidos. Este estudo desenvolveu um protocolo eficaz e simples para purificar e quantificar miRNAs nos rins de um modelo de camundongo com LRA induzido por isquemia-reperfusão renal usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo compreende cinco etapas: 1) indução de LRA por isquemia-reperfusão renal, 2) coleta de rins, 3) purificação de RNA total, incluindo miRNAs, dos rins, 4) síntese de cDNA por transcrição reversa de miRNA e 5) qRT-PCR para detectar a expressão de miRNA. Usando este protocolo, o modelo de lesão de isquemia-reperfusão renal pode ser gerado com formas leves a graves de LRA. Além disso, se o procedimento for seguido corretamente, um modelo consistente de LRA com diferenças individuais mínimas pode ser obtido. Este ensaio qRT-PCR mostra uma faixa dinâmica muito ampla e permite a discriminação de miRNAs maduros, que podem ser quantificados com precisão e alta especificidade. Este protocolo pode ser usado para estudar o perfil de expressão de miRNAs em rins com LRA.
A lesão de isquemia-reperfusão (IRI) do rim representa um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de lesão renal aguda (LRA)1. A LRA desempenha um papel significativo no prognóstico do paciente, mas terapias específicas e biomarcadores diagnósticos precoces não foram estabelecidos.
MicroRNAs (miRNAs) são RNAs curtos e não codificantes com aproximadamente 18–25 bases. Os miRNAs são estáveis em fluidos corporais e suas sequências são altamente conservadas entre os animais2. Os miRNAs regulam a expressão de múltiplas proteínas por meio de milhares de alvos, influenciando assim diversas vias de sinalização 2,3,4,5,6,7,8. Nos últimos anos, tem sido relatado que os miRNAs estão envolvidos em vários estados de doença e são biomarcadores eficazes para o diagnóstico precoce de várias doenças.
O objetivo geral deste protocolo é purificar e detectar com sucesso miRNAs nos rins de um modelo de camundongo com LRA induzido por IRI. Este modelo IRI é um modelo amplamente utilizado de LRA e fibrose renal. As vantagens do modelo IRI incluem a capacidade de confirmar visualmente se a isquemia-reperfusão foi alcançada e determinar o momento exato do início da LRA. No entanto, uma duração de pinça longa o suficiente para causar dano tubular amplo está associada a uma alta taxa de mortalidade, enquanto uma curta duração de pinça não causa dano tubular, o que resulta em uma grande variação na progressão do dano tubular neste modelo experimental. Em comparação com o modelo de pinçamento bilateral, o tecido de nefrectomia direita colhido no modelo de IRI renal unilateral atua como controle e garante a insuficiência renal.
A amostra de rim é triturada usando um homogeneizador de vidro, no qual proteínas e ácidos nucléicos são separados e DNA e RNA são separados9. O RNA total, incluindo o miRNA, é purificado da amostra de rim usando uma coluna de spin à base de membrana de sílica9. Posteriormente, a síntese de cDNA (transcrição reversa) é realizada a partir do RNA total usando primers poli(A) polimerase e oligo-dT10. Finalmente, a expressão do miRNA é determinada por qRT-PCR usando um corante intercalante10. qRT-PCR pode quantificar com mais precisão a expressão gênica em comparação com a PCR de volumes de amplificação nos pontos finais. O qRT-PCR mede altas concentrações e é caracterizado por uma ampla faixa dinâmica, que permite uma quantificação precisa que depende do número de ciclos. Estudos anteriores relataram que processos simples poderiam ser usados para purificar e detectar efetivamente miRNAs em tecidos 8,9,10. Os métodos descritos neste protocolo para a síntese de cDNA (transcrição reversa) e a detecção da expressão de miRNAs por qRT-PCR usando um corante intercalante foram relatados como mostrando alta precisão e sensibilidade10.
Além disso, este protocolo é simples e alcança resultados consistentes entre laboratórios. Portanto, este protocolo é útil em estudos que requerem detecção de miRNA altamente precisa e sensível em rins de LRA de camundongos.
Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Jichi Medical University e realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Guia da Jichi Medical University para Animais de Laboratório.
1. Modelo IRI
NOTA: Monitore cuidadosamente a hipotermia, a hidratação intestinal e a profundidade da anestesia durante todo o procedimento.
2. Coleta de amostras renais
NOTA: Este vídeo tem um tempo de clampeamento de 45 min, coletando os rins 24 h depois.
3. Purificação de miRNAs de amostras renais
NOTA: Aqui, amostras de rim pesando 30 mg são homogeneizadas usando um homogeneizador de vidro e um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de rotação de microcentrífuga. Posteriormente, o miRNA da amostra de rim é isolado usando uma coluna de spin à base de membrana de sílica.
4. Transcrição reversa de miRNA
NOTA: Aqui, 1,0 μg de RNA isolado é transcrito reversamente usando transcriptase reversa, poli(A) polimerase e oligo-dT primers.
5. qRT-PCR de miRNA
NOTA: qRT-PCR de miRNA é realizado usando um corante intercalante. Aqui, foram utilizados primers para U6 pequeno nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p e miRNA-574-5p.
Aqui, o perfil de expressão de miRNA em camundongos com LRA foi investigado. O perfil de expressão de miRNAs tem sido investigado em vários órgãos e tecidos em camundongos. Os miRNAs são importantes reguladores pós-transcricionais e agora estão sendo extensivamente estudados na caracterização de uma variedade de doenças, incluindo LRA. Os miRNAs têm o potencial de ajudar a elucidar condições patológicas e ser aplicados no tratamento da LRA12. As pri...
Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, miRNAs do rim de camundongos IRI foram purificados e detectados com sucesso usando qRT-PCR. Os pontos críticos do procedimento indutor de IRI no protocolo incluem o monitoramento cuidadoso da temperatura corporal e das concentrações anestésicas, que são conhecidas por afetar a LRA20. A força deste protocolo é que ele permite a confirmação visual de se a isquemia-reperfusão foi alcançada. No entanto, exist...
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Agradecemos a Nam Nguyen, PhD, por editar um rascunho deste manuscrito.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook | Natsume Seisakusho | MA-47 | |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
C57B6 mice | SLC | not assign | |
forcep with Teeth | Natsume Seisakusho | MA-49 | |
forcep without Teeth | Natsume Seisakusho | MA-48-1 | |
Hemostatic clips | Natsume Seisakusho | KN−353 | |
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-132-3p primer | Qiagen | MS00003458 | 5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG |
miRNA-17-5p primer | Qiagen | MS00029274 | 5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG |
miRNA-18a-5p primer | Qiagen | MS00031514 | 5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG |
miRNA-212-3p primer | Qiagen | MS00003815 | 5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC |
miRNA-21a-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA |
miRNA-574-5p primer | Qiagen | MS00043617 | 5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
surgical scissors | Natsume Seisakusho | B-2 | |
Vascular clip applier | VITALITEC | 1621420 |
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