Un método cuantitativo de detección de microARN en el riñón de un modelo de ratón con lesión renal isquémica

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para detectar la expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con lesión renal aguda utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real. Este protocolo hace hincapié en un modelo de ratón con lesión renal isquémica y en la extracción cuidadosa de muestras de microARN.

Resumen

Los microARN (miARN) están implicados en diversos estados patológicos y son biomarcadores eficaces para el diagnóstico precoz de enfermedades y el tratamiento en ratones. Sin embargo, los protocolos estándar para la purificación de miRNAs y la detección de su expresión en los riñones de ratones con lesión renal aguda (IRA) no han sido bien establecidos. Este estudio desarrolló un protocolo eficaz y sencillo para purificar y cuantificar miRNAs en los riñones de un modelo de ratón con LRA inducida por isquemia-reperfusión renal utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo consta de cinco pasos: 1) inducción de LRA por isquemia-reperfusión renal, 2) recolección de riñones, 3) purificación del ARN total, incluidos los miARN, de los riñones, 4) síntesis de ADNc por transcripción inversa de miARN y 5) qRT-PCR para detectar la expresión de miARN. Con este protocolo, se puede generar el modelo de lesión por isquemia-reperfusión renal con formas leves a graves de LRA. Además, si se sigue correctamente el procedimiento, se puede obtener un modelo de LRA coherente con diferencias individuales mínimas. Este ensayo qRT-PCR muestra un rango dinámico muy amplio y permite la discriminación de miRNAs maduros, que pueden cuantificarse con precisión y con alta especificidad. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el perfil de expresión de miRNA en riñones con LRA.

Introducción

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) del riñón representa uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de lesión renal aguda (IRA)¹. La LRA desempeña un papel importante en el pronóstico de los pacientes, pero no se han establecido terapias específicas ni biomarcadores de diagnóstico temprano.

Los microARN (miARN) son ARN cortos, no codificantes, con aproximadamente 18-25 bases. Los miRNAs son estables en los fluidos corporales y sus secuencias están altamente conservadas entre los animales². Los miRNAs regulan la expresión de múltiples proteínas a través de miles de dianas, influyendo así en diversas vías de señalización 2,3,4,5,6,7,8. En los últimos años, se ha informado de que los miRNAs están implicados en diversos estados patológicos y son biomarcadores eficaces para el diagnóstico precoz de varias enfermedades.

El objetivo general de este protocolo es purificar y detectar con éxito miRNAs en los riñones de un modelo de ratón con LRA inducida por IRI. Este modelo IRI es un modelo ampliamente utilizado de LRA y fibrosis renal. Las ventajas del modelo IRI incluyen la posibilidad de confirmar visualmente si se ha logrado la isquemia-reperfusión y determinar el momento exacto de inicio de la LRA. Sin embargo, una duración del pinzamiento que es lo suficientemente larga como para causar un daño tubular amplio se asocia con una alta tasa de mortalidad, mientras que una duración corta del pinzamiento no causa daño tubular, lo que resulta en una gran variación en la progresión del daño tubular en este modelo experimental. En comparación con el modelo de pinzamiento bilateral, el tejido de nefrectomía derecha extraído en el modelo IRI renal unilateral actúa como control y garantiza la insuficiencia renal.

La muestra de riñón se tritura utilizando un homogeneizador de vidrio, en el que se separan las proteínas y los ácidos nucleicos, y se separan el ADN y el ARN⁹. El ARN total, incluido el miARN, se purifica a partir de la muestra de riñón utilizando una columna de espín basada en membrana de sílice⁹. Posteriormente, se realiza la síntesis de ADNc (transcripción inversa) a partir de ARN total utilizando poli(A) polimerasa y cebadores oligo-dT¹⁰. Por último, la expresión de miRNA se determina mediante qRT-PCR utilizando un colorante intercalante¹⁰. La qRT-PCR puede cuantificar con mayor precisión la expresión génica en comparación con la PCR de los volúmenes de amplificación en los puntos finales. La qRT-PCR mide altas concentraciones y se caracteriza por un amplio rango dinámico, que permite una cuantificación precisa que depende del número de ciclos. Estudios previos informaron que se podrían utilizar procesos simples para purificar y detectar eficazmente miRNAs en tejidos ^8,9,10. Se ha informado que los métodos descritos en este protocolo para la síntesis de ADNc (transcripción inversa) y la detección de la expresión de miRNA mediante qRT-PCR utilizando un colorante intercalante muestran una alta precisión y sensibilidad¹⁰.

Además, este protocolo es sencillo y consigue resultados consistentes entre laboratorios. Por lo tanto, este protocolo es útil en estudios que requieren una detección de miRNA altamente precisa y sensible en riñones de LRA de ratón.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los protocolos de experimentación con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las pautas de Uso y Cuidado de Animales de Experimentación de la Guía para Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Jichi.

1. Modelo IRI

NOTA: Controle cuidadosamente la hipotermia, la hidratación intestinal y la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento.

1. Prepare los siguientes artículos: un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga algodón empapado en isoflurano, una almohadilla quirúrgica caliente, una placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS), tijeras quirúrgicas y fórceps. Mantenga el PBS a 37 °C.
   NOTA: Este modelo IRI se generó utilizando ratones machos C57BL/6 (9 semanas; 20-25 g) alojados en una habitación con temperatura y humedad controladas y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h.
2. Anestesiar al animal con isoflurano: concentración de inducción 3%-5%, concentración de mantenimiento 2%-3% y concentración durante el pinzamiento 1%-1,5%. Confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de reflejos. La anestesia inhalatoria tiene la ventaja de que el tiempo se puede ajustar. El procedimiento puede llevar una cantidad significativa de tiempo debido a la exfoliación del tejido que rodea el riñón. Sin embargo, la desventaja de la anestesia inhalatoria es que la temperatura corporal tiende a bajar. Durante todo el procedimiento, evite la anestesia innecesaria.
3. Monte el ratón anestesiado en una almohadilla quirúrgica caliente en su espalda, retire el vello que rodea el área de la incisión y rocíe la piel abdominal del ratón con etanol al 70%.
4. Haga una incisión en la línea media de la piel abdominal, el músculo y la membrana peritoneal con tijeras y fórceps.
5. Con un hisopo de algodón humedecido con PBS, empuje suavemente el intestino hacia el lado izquierdo de la cavidad extraabdominal, exponiendo el riñón derecho y el uréter. Es probable que el largo tiempo del procedimiento cause lesiones intestinales postoperatorias. Por lo tanto, es mejor operar sin extraer los intestinos de la cavidad abdominal cuando se puede obtener un campo visual. Evite resecar los intestinos. Los hisopos secos o las gasas pueden causar daño intestinal.
6. Levante el uréter derecho con pinzas en ángulo. Limine el uréter derecho dos veces con suturas trenzadas de seda 4/0. Corte entre las suturas, dejando la sutura que está más cerca del riñón por más tiempo.
7. Sostenga con cuidado la sutura restante sin tirar demasiado y diseccione sin rodeos el tejido conectivo y la grasa a lo largo del riñón. Realizar la cirugía desde atrás reduce el riesgo de daño hepático.
   1. Identificar un vaso sanguíneo, que no sean las arterias y venas renales, que suministra sangre al riñón derecho, y luego ligarlo o cortarlo. Cuando el riñón derecho esté suficientemente desprendido, ligar la arteria y la vena renal derecha con una sutura trenzada de seda 4/0. En lugar de suturar, use una pinza hemostática.
   2. Con un hisopo de algodón humedecido con PBS, empuje suavemente el intestino hacia el lado derecho de la cavidad extraabdominal para exponer el riñón izquierdo y luego cubra el intestino con un paño humedecido para evitar que se seque. Disecciona el tejido conectivo y la grasa alrededor del riñón izquierdo.
8. Identificar un vaso sanguíneo, que no sean las arterias y venas renales, que suministra sangre al riñón izquierdo, y luego ligarlo o cortarlo. Pinzar la arteria renal y la vena renal para inducir la isquemia renal izquierda. Coloque la pinza hemostática aproximadamente a 1 cm del riñón para evitar daños en el parénquima renal. El éxito de la isquemia puede confirmarse visualmente mediante un oscurecimiento gradual y uniforme del riñón.
9. Regrese los intestinos a la cavidad abdominal, teniendo cuidado de evitar la torsión intestinal; Cierre temporalmente la piel abdominal y cúbrala para mantener un ambiente húmedo. Reduzca la concentración de anestesia inhalatoria tanto como sea posible y trate de mantener al animal caliente. El tiempo de fijación es de 25 a 45 min. Un tiempo de pinzamiento más largo induce un daño renal más grave, pero también aumenta la mortalidad a largo plazo. Ajustar analizando los resultados de la patología.
10. Retire la pinza una vez concluido el período de isquemia. Asegurar que el flujo sanguíneo, la reperfusión y el color del riñón mejoren. Confirme que el intestino no esté retorcido antes de cerrar la piel abdominal. Instilar PBS por vía intraperitoneal como un suplemento de volumen antes de que el abdomen se cierre en dos capas. Cierre la piel abdominal con suturas de nylon 4-0. Para períodos de extirpación renal más largos, la posibilidad de adherencias intestinales puede reducirse cerrando por separado la pared abdominal y el peritoneo.
11. Para minimizar el riesgo de infección postoperatoria, aplique un antiséptico (por ejemplo, una solución de yodo/alcohol) en el área quirúrgica.

2. Recogida de muestras de riñón

NOTA: Este video tiene un tiempo de pinzamiento de 45 min, recogiendo los riñones 24 h después.

1. Anestesiar al animal con isoflurano al 5% y confirmar la profundidad de la anestesia mediante la pérdida de reflejos.
2. Haga una incisión en la línea media de la piel abdominal, el músculo y la membrana peritoneal con tijeras y fórceps. Recoger la sangre de la vena cava inferior perforada por una aguja de 27 G.
3. Haga una incisión en la línea media de la pared torácica e inserte una aguja de 23 G en el ventrículo izquierdo. Confirme el reflujo. Haga una incisión en el hígado e inyecte 20 mL de PBS. A medida que la sangre se drena, el hígado cambia de color de rojo a rosa, lo que confirma que se ha drenado suficiente sangre.
4. Retire el riñón izquierdo con pinzas y tijeras y lávelo con PBS en una placa de Petri. Retire la fascia renal con fórceps, teniendo cuidado de no secar el riñón.
5. Corta el riñón por la mitad y usa una mitad para la histopatología y la otra mitad para el siguiente paso. Evite la pelvis renal y extraiga 30 mg del riñón. Guárdelo a -80 °C antes de usarlo.

3. Purificación de miRNAs a partir de muestras de riñón

NOTA: Aquí, las muestras de riñón que pesan 30 mg se homogeneizan utilizando un homogeneizador de vidrio y un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga. Posteriormente, el miARN de la muestra de riñón se aísla utilizando una columna de espín basada en membrana de sílice.

1. Prepare los siguientes artículos: tubos de microcentrífuga de 1,5 o 2,0 mL, etanol al 100%, cloroformo, un homogeneizador de vidrio, hielo, un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga⁹, columnas de centrifugación a base de membrana de sílice⁹, reactivo de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado que contiene guanidina y etanol (tampón de lavado 1) y tampón de lavado que contiene etanol (tampón de lavado 2).
2. Coloque una muestra de riñón de 30 mg en un homogeneizador de vidrio y agregue 700 μL de reactivo de lisis a base de fenol/guanidina. Realice este paso sobre hielo porque el tejido se desnaturaliza con el calor.
3. Homogeneice la muestra de riñón presionando lentamente el mortero sobre la muestra girándolo. Repita este proceso varias docenas de veces en hielo hasta que la muestra de riñón se haya disuelto completamente en el reactivo de lisis a base de fenol/guanidina. Cuando no se obtiene miARN en mediciones posteriores, es probable que se deba a una disolución insuficiente.
4. Para una mayor homogeneización, transfiera el lisado homogeneizado al sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga colocada en un tubo de recolección de 2,0 mL. Centrifugar a 14.000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
5. Transfiera el lisado homogeneizado a un nuevo tubo de microcentrífuga.
6. Añada 140 μl de cloroformo al lisado homogeneizado y tape el tubo de forma segura. Mezclar el tubo por inversión durante 15 s.
7. Incube las muestras durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugarlos a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
8. Transfiera el sobrenadante (normalmente 300 μL) a un nuevo tubo de microcentrífuga sin alterar el precipitado y agregue 1,5 volúmenes (normalmente 450 μL) de etanol al 100%. Mezcle la muestra mediante vórtice durante 5 s.
9. Pipetear hasta 700 μL de la muestra en una columna de centrifugación a base de membrana de sílice colocada en un tubo de recolección de 2,0 mL. Cierre la tapa de la columna y centrifugue a 15.000 × g durante 15 s. Después de la centrifugación, deseche el flujo en el tubo de recolección.
10. Añada 700 μL de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugación a base de membrana de sílice para lavar a fondo la muestra. Cierre la tapa de la columna y centrifuérrela a 15.000 × g durante 15 s. Después de la centrifugación, deseche el flujo en el tubo de recolección.
11. Añada 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugación a base de membrana de sílice para eliminar cualquier rastro de sal. Cierre la tapa de la columna y centrifugue a 15.000 × g durante 15 s. Después de la centrifugación, deseche el flujo en el tubo de recolección.
    1. Repita el paso 3.11.
12. Centrifugar la columna de centrifugación a base de membrana de sílice de nuevo a 15.000 × g durante 1 min. Después de la centrifugación, deseche el flujo en el tubo de recolección.
13. Coloque la columna de centrifugación a base de membrana de sílice en un nuevo tubo de recolección de 1,5 mL. Transfiera 25 μL de agua libre de RNasa a la columna y cierre la tapa de la columna. Deje la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos y, a continuación, centrifugue a 15.000 × g durante 1 minuto.
14. Transfiera el eluido de 25 μL que contiene miRNAs a un nuevo tubo de microcentrífuga. Debido a que el miARN se degrada por disolución repetida, se recomienda dispensar la muestra en 2 o 3 tubos. Guárdelos a -80 °C antes de usarlos.

4. Transcripción inversa de miRNA

NOTA: Aquí, 1,0 μg de ARN aislado se transcriben de forma inversa utilizando transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y cebadores oligo-dT.

1. Prepare los siguientes artículos: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL; tubos de tiras de 8 pocillos; Agua libre de RNasa; hielo; una mezcla de ácidos nucleicos 10x que contiene desoxinucleótidos, trifosfatos de ribonucleótidos y cebadores oligo-dT; una mezcla de poli(A) polimerasa y transcriptasa inversa; y tampón activador, incluyendo Mg²⁺, desoxirribonucleótidos, cebadores oligo-dT y cebadores aleatorios¹⁰.
2. Prepare una solución de mezcla maestra que contenga 2,0 μL de mezcla de ácido nucleico 10x, 2,0 μL de poli(A) polimerasa y mezcla de transcriptasa inversa, y 4,0 μL de tampón activador 5x, incluyendo Mg²⁺, desoxirribonucleótidos, cebadores oligo-dT y cebadores aleatorios, para un total de 8,0 μL por tubo.
3. Dispense 8,0 μL de la solución de mezcla maestra en cada tubo.
4. Añada 1,0 μg de miRNAs aislados purificados de la muestra de riñón a cada tubo.
5. Añadir agua sin RNasa a cada tubo hasta un total de 20 μL. Mezclar bien mediante pipeteo y centrifugar a 1.500 x g durante 15 s.
6. Incubar las muestras durante 60 min a 37 °C, seguido inmediatamente de una incubación de 5 min a 95 °C. Este paso se puede realizar en un termociclador.
7. Transfiera el ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga y diluya 10 veces (1:10) con agua libre de ARNasa.
8. Almacene el ADNc diluido a corto plazo en hielo y a largo plazo a -80 °C antes de su uso.

5. qRT-PCR de miRNA

NOTA: La qRT-PCR de miRNA se realiza utilizando un colorante intercalante. En este caso, se utilizaron cebadores para U6 nuclear pequeño 2 (ARN-2), miARN-17-5p, miARN-18a-5p, miARN-21a-5p, miARN-132-3p, miARN-212-3p, miARN-223-3p y miARN-574-5p.

1. Prepare los siguientes elementos: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, placas de reacción de 96 pocillos para qRT-PCR, película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos, cebadores específicos de miARN, mezcla maestra de PCR que comprende ADN polimerasa Taq, tampón de PCR, desoxinucleótidos y cebadores universales¹⁰, y un instrumento de PCR en tiempo real.
2. Prepare una mezcla maestra que contenga 12,5 μL de 2x PCR Master Mix, 2,5 μL de cada cebador de miARN (5 μM) disuelto en agua sin nucleasas y 1,25 μL de 10x cebadores universales para cada pocillo.
3. Dispense 22,5 μL de la mezcla maestra en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
4. Añada 2,5 μL de ADNc molde a cada pocillo.
5. Selle la placa con la película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos. A continuación, centrifugar la placa a 1.000 × g durante 30 s.
6. Utilizando el instrumento y el software de PCR en tiempo real, ejecute el programa de ciclo de PCR de la siguiente manera.
   1. Coloque la placa en el instrumento de PCR en tiempo real. Asigne un nombre a la muestra y al miARN objetivo en cada pocillo mediante el software de PCR en tiempo real.
   2. Introduzca las siguientes condiciones de ciclo de PCR en el software de PCR en tiempo real de acuerdo con las instrucciones: preincubación a 95 °C durante 15 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 15 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 70 °C durante 30 s.
7. Analice los datos de qRT-PCR utilizando el software del instrumento de PCR en tiempo real. Compruebe si hay reacciones inespecíficas. Analice la curva de disociación o la curva de fusión para confirmar que no se ha producido una amplificación distinta a la prevista.
   1. Normalizar el nivel de expresión de los miRNAs diana a RNU-6 como control endógeno. Calcular el nivel de expresión relativa de los miRNAs diana utilizando el método 2^{−ΔΔCT 11}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Aquí, se investigó el perfil de expresión de miRNA en ratones AKI. El perfil de expresión de miRNA se ha investigado en varios órganos y tejidos en ratones. Los miRNAs son importantes reguladores postranscripcionales y ahora se están estudiando ampliamente en la caracterización de una variedad de enfermedades, incluida la LRA. Los miRNAs tienen el potencial de ayudar a dilucidar condiciones patológicas y ser aplicados al tratamiento de la LRA¹². Las princi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Utilizando el protocolo presentado en este manuscrito, los miRNAs del riñón de ratones IRI fueron purificados y detectados con éxito mediante qRT-PCR. Los puntos críticos del procedimiento de inducción de IRI en el protocolo incluyen un monitoreo cuidadoso de la temperatura corporal y las concentraciones de anestesia, que se sabe que afectan a la LRA²⁰. El punto fuerte de este protocolo es que permite confirmar visualmente si se ha logrado la isquemia-reperfu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primer	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420