Un metodo di rilevamento quantitativo per i microRNA nel rene di un modello murino di danno renale ischemico

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo per rilevare l'espressione di microRNA nei reni di un modello murino di insufficienza renale acuta utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa in tempo reale. Questo protocollo enfatizza un modello murino di danno renale ischemico e l'attenta estrazione di campioni di microRNA.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono coinvolti in vari stati patologici e sono biomarcatori efficaci per la diagnosi precoce delle malattie e il trattamento nei topi. Tuttavia, i protocolli standard per la purificazione dei miRNA e il rilevamento della loro espressione nei reni dei topi con insufficienza renale acuta (AKI) non sono stati ben stabiliti. Questo studio ha sviluppato un protocollo efficace e semplice per purificare e quantificare i miRNA nei reni di un modello murino AKI indotto da ischemia-riperfusione renale utilizzando la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Questo protocollo comprende cinque fasi: 1) induzione di AKI mediante ischemia-riperfusione renale, 2) prelievo di reni, 3) purificazione dell'RNA totale, compresi i miRNA, dai reni, 4) sintesi di cDNA mediante trascrizione inversa di miRNA e 5) qRT-PCR per rilevare l'espressione di miRNA. Utilizzando questo protocollo, il modello di danno da ischemia-riperfusione renale può essere generato con forme da lievi a gravi di AKI. Inoltre, se la procedura viene seguita correttamente, è possibile ottenere un modello AKI coerente con differenze individuali minime. Questo test qRT-PCR mostra un intervallo dinamico molto ampio e consente la discriminazione di miRNA maturi, che possono essere quantificati con precisione con elevata specificità. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il profilo di espressione dei miRNA nei reni AKI.

Introduzione

Il danno da ischemia-riperfusione (IRI) del rene rappresenta uno dei principali fattori di rischio per lo sviluppo del danno renale acuto (AKI)¹. L'AKI svolge un ruolo significativo nella prognosi dei pazienti, ma non sono state stabilite terapie specifiche e biomarcatori diagnostici precoci.

I microRNA (miRNA) sono brevi RNA non codificanti con circa 18-25 basi. I miRNA sono stabili nei fluidi corporei e le loro sequenze sono altamente conservate tra gli animali². I miRNA regolano l'espressione di più proteine attraverso migliaia di bersagli, influenzando così diverse vie di segnalazione 2,3,4,5,6,7,8. Negli ultimi anni, è stato riportato che i miRNA sono coinvolti in vari stati patologici e sono biomarcatori efficaci per la diagnosi precoce di diverse malattie.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare e rilevare con successo i miRNA nei reni di un modello murino AKI indotto da IRI. Questo modello IRI è un modello ampiamente utilizzato di AKI e fibrosi renale. I vantaggi del modello IRI includono la possibilità di confermare visivamente se l'ischemia-riperfusione è stata raggiunta e determinare il momento esatto di insorgenza dell'AKI. Tuttavia, una durata del morsetto sufficientemente lunga da causare un ampio danno tubulare è associata a un alto tasso di mortalità, mentre una breve durata del morsetto non causa danni tubulari, il che si traduce in un'ampia variazione nella progressione del danno tubulare in questo modello sperimentale. Rispetto al modello di clampaggio bilaterale, il tessuto nefrectomico destro raccolto nel modello IRI renale unilaterale funge da controllo e garantisce l'insufficienza renale.

Il campione di rene viene schiacciato utilizzando un omogeneizzatore di vetro, in cui vengono separate le proteine e gli acidi nucleici e il DNA e l'RNA⁹. L'RNA totale, incluso il miRNA, viene purificato dal campione di rene utilizzando una colonna di spin⁹ a base di membrana di silice. Successivamente, la sintesi del cDNA (trascrizione inversa) viene eseguita dall'RNA totale utilizzando la poli(A) polimerasi e i primer oligo-dT¹⁰. Infine, l'espressione dei miRNA è determinata mediante qRT-PCR utilizzando un colorante intercalante¹⁰. La qRT-PCR può quantificare in modo più accurato l'espressione genica rispetto alla PCR dei volumi di amplificazione agli endpoint. La qRT-PCR misura alte concentrazioni ed è caratterizzata da un ampio intervallo dinamico, che consente una quantificazione accurata che dipende dal numero di cicli. Studi precedenti hanno riportato che semplici processi potrebbero essere utilizzati per purificare e rilevare efficacemente i miRNA nei tessuti ^8,9,10. È stato riportato che i metodi descritti in questo protocollo per la sintesi del cDNA (trascrizione inversa) e il rilevamento dell'espressione di miRNA mediante qRT-PCR utilizzando un colorante intercalante mostrano un'elevata accuratezza e sensibilità¹⁰.

Inoltre, questo protocollo è semplice e consente di ottenere risultati coerenti tra i laboratori. Pertanto, questo protocollo è utile negli studi che richiedono un rilevamento altamente accurato e sensibile dei miRNA nei reni AKI di topo.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale dell'Università di Medicina di Jichi ed eseguiti in conformità con le linee guida sull'uso e la cura degli animali da esperimento della Guida per gli animali da laboratorio dell'Università di Medicina di Jichi.

1. Modello IRI

NOTA: Monitorare attentamente l'ipotermia, l'idratazione intestinale e la profondità dell'anestesia durante tutta la procedura.

1. Preparare i seguenti elementi: una provetta da centrifuga da 50 ml contenente cotone imbevuto di isoflurano, un tampone chirurgico riscaldato, una piastra di Petri con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), forbici chirurgiche e pinze. Mantenere il PBS a 37 °C.
   NOTA: Questo modello IRI è stato generato utilizzando topi maschi C57BL/6 (9 settimane; 20-25 g) alloggiati in una stanza con temperatura e umidità controllate e un ciclo luce-buio di 12 ore.
2. Anestetizzare l'animale usando isoflurano: concentrazione di induzione 3%-5%, concentrazione di mantenimento 2%-3% e concentrazione durante il clampaggio 1%-1,5%. Confermare la profondità dell'anestesia mediante la perdita dei riflessi. L'anestesia per inalazione ha il vantaggio che il tempo può essere regolato. La procedura potrebbe richiedere una notevole quantità di tempo a causa dell'esfoliazione del tessuto che circonda il rene. Tuttavia, lo svantaggio dell'anestesia per inalazione è che la temperatura corporea tende a scendere. Durante la procedura, evitare l'anestesia non necessaria.
3. Montare il mouse anestetizzato su un tampone chirurgico riscaldato sul retro, rimuovere i peli che circondano l'area dell'incisione e spruzzare la pelle addominale del topo con etanolo al 70%.
4. Praticare un'incisione sulla linea mediana nella pelle addominale, nei muscoli e nella membrana peritoneale usando forbici e pinze.
5. Utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con PBS, spingere delicatamente l'intestino verso il lato sinistro della cavità extra-addominale, esponendo il rene destro e l'uretere. È probabile che il lungo tempo della procedura causi lesioni intestinali postoperatorie. Pertanto, è meglio operare senza rimuovere l'intestino dalla cavità addominale quando è possibile ottenere un campo visivo. Evita di seccare l'intestino. Tamponi secchi o garze possono causare danni intestinali.
6. Sollevare l'uretere destro con una pinza angolata. Legare due volte l'uretere destro utilizzando suture intrecciate in seta 4/0. Taglia tra le suture, lasciando più a lungo la sutura più vicina al rene.
7. Tenere con cura la sutura rimanente senza tirare troppo e sezionare senza mezzi termini il tessuto connettivo e il grasso lungo il rene. L'esecuzione di un intervento chirurgico da dietro riduce il rischio di danni al fegato.
   1. Identificare un vaso sanguigno, diverso dalle arterie e dalle vene renali, che fornisce sangue al rene destro, quindi legarlo o tagliarlo. Quando il rene destro è sufficientemente staccato, legare l'arteria renale destra e la vena utilizzando una sutura intrecciata di seta 4/0. Invece di suturare, utilizzare una clip emostatica.
   2. Utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con PBS, spingere delicatamente l'intestino verso il lato destro della cavità extra-addominale per esporre il rene sinistro, quindi coprire l'intestino con un telo inumidito per evitare che si secchi. Sezionare il tessuto connettivo e il grasso intorno al rene sinistro.
8. Identificare un vaso sanguigno, diverso dalle arterie e dalle vene renali, che fornisce sangue al rene sinistro, quindi legarlo o tagliarlo. Clamp l'arteria renale e la vena renale per indurre l'ischemia renale sinistra. Posizionare la clip emostatica a circa 1 cm dal rene per evitare danni al parenchima renale. Il successo dell'ischemia può essere confermato visivamente da un graduale e uniforme oscuramento del rene.
9. Rimettere l'intestino nella cavità addominale, avendo cura di evitare torsioni intestinali; Chiudere temporaneamente la pelle addominale e il drappo per mantenere un ambiente umido. Riduci il più possibile la concentrazione di anestesia per inalazione e cerca di mantenere l'animale al caldo. Il tempo di serraggio è di 25-45 min. Un tempo di clampaggio più lungo induce un danno renale più grave, ma aumenta anche la mortalità a lungo termine. Regola analizzando i risultati della patologia.
10. Rimuovere il morsetto al termine del periodo di ischemia. Assicurarsi che la riperfusione del flusso sanguigno e il colore dei reni migliorino. Verificare che l'intestino non sia attorcigliato prima di chiudere la pelle addominale. Instillare PBS per via intraperitoneale come integratore di volume prima che l'addome sia chiuso in due strati. Chiudere la pelle addominale utilizzando suture di nylon 4-0. Per periodi di rimozione renale più lunghi, la possibilità di aderenze intestinali può essere ridotta chiudendo separatamente la parete addominale e il peritoneo.
11. Per ridurre al minimo il rischio di infezione post-operatoria, applicare un antisettico (ad es. soluzione di iodio/alcol) sull'area chirurgica.

2. Raccolta di campioni di rene

NOTA: Questo video ha un tempo di serraggio di 45 minuti, raccogliendo i reni 24 ore dopo.

1. Anestetizzare l'animale con isoflurano al 5% e confermare la profondità dell'anestesia mediante la perdita dei riflessi.
2. Praticare un'incisione sulla linea mediana nella pelle addominale, nei muscoli e nella membrana peritoneale usando forbici e pinze. Raccogliere il sangue dalla vena cava inferiore perforata con un ago da 27 G.
3. Praticare un'incisione sulla linea mediana nella parete toracica e inserire un ago da 23 G nel ventricolo sinistro. Confermare il riflusso. Praticare un'incisione nel fegato e iniettare 20 ml di PBS. Mentre il sangue drena, il fegato cambia colore dal rosso al rosa, confermando che è stato drenato abbastanza sangue.
4. Rimuovere il rene sinistro usando pinze e forbici e lavarlo con PBS in una capsula di Petri. Rimuovere la fascia renale usando una pinza, facendo attenzione a non seccare il rene.
5. Taglia il rene a metà e usa una metà per l'istopatologia e l'altra metà per il passaggio successivo. Evitare la pelvi renale e raccogliere 30 mg di rene. Conservare a -80 °C prima dell'uso.

3. Purificazione dei miRNA da campioni di rene

NOTA: Qui, i campioni di rene del peso di 30 mg vengono omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore di vetro e un sistema di triturazione dei biopolimeri in una colonna di centrifuga per microcentrifuga. Successivamente, il miRNA del campione di rene viene isolato utilizzando una colonna di spin a base di membrana di silice.

1. Preparare i seguenti elementi: provette per microcentrifuga da 1,5 o 2,0 mL, etanolo al 100%, cloroformio, un omogeneizzatore di vetro, ghiaccio, un sistema di triturazione dei biopolimeri in una colonna rotante per microcentrifuga^{9, colonne} rotanti 9 a base di membrana di silice, reagente di lisi a base di fenolo/guanidina, tampone di lavaggio contenente guanidina ed etanolo (tampone di lavaggio 1) e tampone di lavaggio contenente etanolo (tampone di lavaggio 2).
2. Inserire un campione di rene da 30 mg in un omogeneizzatore di vetro e aggiungere 700 μl di reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Eseguire questo passaggio sul ghiaccio perché il tessuto viene denaturato dal calore.
3. Omogeneizzare il campione di rene premendo lentamente il pestello sul campione ruotandolo. Ripetere questo processo diverse dozzine di volte con ghiaccio fino a quando il campione di rene non si è completamente sciolto nel reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Quando il miRNA non viene ottenuto nelle misurazioni successive, ciò è probabilmente dovuto a una dissoluzione insufficiente.
4. Per un'ulteriore omogeneizzazione, trasferire il lisato omogeneizzato al sistema di triturazione del biopolimero in una colonna di centrifuga per microcentrifuga posta in una provetta di raccolta da 2,0 mL. Centrifugare a 14.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
5. Trasferire il lisato omogeneizzato in una nuova provetta da microcentrifuga.
6. Aggiungere 140 μl di cloroformio al lisato omogeneizzato e tappare bene la provetta. Miscelare il tubo per inversione per 15 s.
7. Incubare i campioni per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugarli a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
8. Trasferire il surnatante (normalmente 300 μl) in una nuova provetta da microcentrifuga senza disturbare il precipitato e aggiungere 1,5 volumi (normalmente 450 μl) di etanolo al 100%. Mescolare il campione mediante vortice per 5 s.
9. Pipettare fino a 700 μl di campione in una colonna rotante a base di membrana di silice posta in una provetta di raccolta da 2,0 mL. Chiudere il tappo della colonna e centrifugare a 15.000 × g per 15 s. Dopo la centrifugazione, gettare il flusso nella provetta di raccolta.
10. Aggiungere 700 μl di tampone di lavaggio 1 alla colonna di centrifuga a base di membrana di silice per lavare a fondo il campione. Chiudere il tappo della colonna e centrifugarla a 15.000 × g per 15 s. Dopo la centrifugazione, gettare il flusso nella provetta di raccolta.
11. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio 2 alla colonna di centrifuga a base di membrana di silice per rimuovere eventuali tracce di sale. Chiudere il tappo della colonna e centrifugare a 15.000 × g per 15 s. Dopo la centrifugazione, gettare il flusso nella provetta di raccolta.
    1. Ripetere il passaggio 3.11.
12. Centrifugare nuovamente la colonna di centrifuga a base di membrana di silice a 15.000 × g per 1 minuto. Dopo la centrifugazione, gettare il flusso nella provetta di raccolta.
13. Posizionare la colonna di centrifuga a base di membrana di silice in una nuova provetta di raccolta da 1,5 mL. Trasferire 25 μL di acqua priva di RNasi nella colonna e chiudere il tappo della colonna. Lasciare il campione a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi centrifugarlo a 15.000 × g per 1 minuto.
14. Trasferire l'eluato da 25 μL contenente miRNA in una nuova provetta da microcentrifuga. Poiché il miRNA viene degradato a causa della dissoluzione ripetuta, si consiglia di erogare il campione in 2 o 3 provette. Conservarli a una temperatura di -80 °C prima dell'uso.

4. Trascrizione inversa dei miRNA

NOTA: Qui, 1,0 μg di RNA isolato vengono trascritti inversamente utilizzando la trascrittasi inversa, la poli(A) polimerasi e i primer oligo-dT.

1. Preparare i seguenti elementi: provette per microcentrifuga da 1,5 mL; provette a nastro a 8 pozzetti; acqua priva di RNasi; ghiaccio; una miscela di acidi nucleici 10x contenente deossinucleotidi, ribonucleotidi, trifosfati e primer oligo-dT; una miscela di poli(A) polimerasi e trascrittasi inversa; e tampone attivante, inclusi Mg²⁺, desossiribonucleotidi, primer oligo-dT e primer casuali¹⁰.
2. Preparare una soluzione di miscela master contenente 2,0 μl di miscela di acidi nucleici 10x, 2,0 μl di poli(A) polimerasi e miscela di trascrittasi inversa e 4,0 μl di tampone attivante 5x, inclusi Mg²⁺, desossiribonucleotidi, primer oligo-dT e primer casuali, per un totale di 8,0 μl per provetta.
3. Erogare 8,0 μl della soluzione di miscela master in ciascuna provetta.
4. Aggiungere 1,0 μg di miRNA isolati purificati dal campione di rene a ciascuna provetta.
5. Aggiungere acqua priva di RNasi in ciascuna provetta per un totale di 20 μl. Miscelare accuratamente mediante pipettaggio e centrifugare a 1.500 x g per 15 s.
6. Incubare i campioni per 60 minuti a 37 °C, quindi incubare immediatamente per 5 minuti a 95 °C. Questo passaggio può essere eseguito in un termociclatore.
7. Trasferire il cDNA in una nuova provetta da microcentrifuga e diluire 10 volte (1:10) con acqua priva di RNasi.
8. Conservare il cDNA diluito a breve termine su ghiaccio e a lungo termine a -80 °C prima dell'uso.

5. qRT-PCR di miRNA

NOTA: la qRT-PCR del miRNA viene eseguita utilizzando un colorante intercalante. Qui, sono stati utilizzati primer per U6 small nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p e miRNA-574-5p.

1. Preparare i seguenti elementi: provette per microcentrifuga da 1,5 mL, piastre di reazione a 96 pozzetti per qRT-PCR, pellicola adesiva per la piastra di reazione a 96 pozzetti, primer specifici per miRNA, PCR Master Mix comprendente Taq DNA polimerasi, tampone PCR, deossinucleotidi e primer universali¹⁰ e uno strumento PCR in tempo reale.
2. Preparare una miscela master contenente 12,5 μl di 2x PCR Master Mix, 2,5 μl di ciascun primer miRNA (5 μM) disciolto in acqua priva di nucleasi e 1,25 μl di 10x primer universali per ciascun pozzetto.
3. Erogare 22,5 μl della miscela master in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
4. Aggiungere 2,5 μL di cDNA stampo a ciascun pozzetto.
5. Sigillare la piastra con la pellicola adesiva per la piastra di reazione a 96 pozzetti. Quindi, centrifugare la piastra a 1.000 × g per 30 s.
6. Utilizzando lo strumento e il software PCR in tempo reale, eseguire il programma di ciclo PCR come segue.
   1. Posizionare la piastra nello strumento PCR in tempo reale. Assegna un nome al campione e indirizza il miRNA in ogni pozzetto utilizzando il software Real-Time PCR.
   2. Inserire le seguenti condizioni di ciclo PCR nel software PCR in tempo reale secondo le istruzioni: preincubazione a 95 °C per 15 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 94 °C per 15 s, ricottura a 55 °C per 30 s ed estensione a 70 °C per 30 s.
7. Analizza i dati qRT-PCR utilizzando il software dello strumento PCR in tempo reale. Verificare la presenza di reazioni non specifiche. Analizza la curva di dissociazione o la curva di fusione per confermare che non si è verificata un'amplificazione diversa da quella prevista.
   1. Normalizzare il livello di espressione dei miRNA bersaglio in RNU-6 come controllo endogeno. Calcolare il livello di espressione relativa dei miRNA bersaglio utilizzando il metodo 2^{−ΔΔCT 11}.

Risultati

Qui, è stato studiato il profilo di espressione dei miRNA nei topi AKI. Il profilo di espressione dei miRNA è stato studiato in vari organi e tessuti nei topi. I miRNA sono importanti regolatori post-trascrizionali e sono ora ampiamente studiati nella caratterizzazione di una varietà di malattie, tra cui l'AKI. I miRNA hanno il potenziale per aiutare a chiarire le condizioni patologiche ed essere applicati al trattamento di AKI¹². Le principali cause di AKI son...

Discussione

Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, i miRNA del rene di topi IRI sono stati purificati con successo e rilevati mediante qRT-PCR. I punti critici della procedura che induce IRI nel protocollo includono un attento monitoraggio della temperatura corporea e delle concentrazioni di anestesia, che sono note per influenzare l'AKI²⁰. Il punto di forza di questo protocollo è che consente la conferma visiva se l'ischemia-riperfusione è stata raggiu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primer	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420