Méthode de détection quantitative de microARN dans le rein d’un modèle murin de lésion rénale ischémique

Résumé

Cet article présente un protocole de détection de l’expression de microARN dans les reins d’un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse en temps réel. Ce protocole met l’accent sur un modèle murin d’insuffisance rénale ischémique et sur l’extraction minutieuse d’échantillons de microARN.

Résumé

Les microARN (miARN) sont impliqués dans divers états pathologiques et sont des biomarqueurs efficaces pour le diagnostic précoce des maladies et le traitement chez la souris. Cependant, les protocoles standard pour la purification des miARN et la détection de leur expression dans les reins des souris atteintes d’insuffisance rénale aiguë (IRA) n’ont pas été bien établis. Cette étude a développé un protocole simple et efficace pour purifier et quantifier les miARN dans les reins d’un modèle murin d’IRA induit par ischémie-reperfusion rénale à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse en temps réel (qRT-PCR). Ce protocole comprend cinq étapes : 1) l’induction de l’IRA par ischémie-reperfusion rénale, 2) le prélèvement des reins, 3) la purification de l’ARN total, y compris les miARN, des reins, 4) la synthèse de l’ADNc par transcription inverse des miARN, et 5) la qRT-PCR pour détecter l’expression des miARN. En utilisant ce protocole, le modèle de lésion d’ischémie-reperfusion rénale peut être généré avec des formes légères à sévères d’IRA. De plus, si la procédure est suivie correctement, il est possible d’obtenir un modèle d’IRA cohérent avec des différences individuelles minimales. Ce test qRT-PCR présente une très large plage dynamique et permet de discriminer les miARN matures, qui peuvent être quantifiés avec précision avec une grande spécificité. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le profil d’expression des miARN dans les reins d’IRA.

Introduction

L’ischémie-reperfusion (IRA) du rein représente l’un des principaux facteurs de risque de développement de l’insuffisance rénale aiguë (IRA)¹. L’IRA joue un rôle important dans le pronostic des patients, mais des traitements spécifiques et des biomarqueurs diagnostiques précoces n’ont pas été établis.

Les microARN (miARN) sont des ARN courts et non codants avec environ 18 à 25 bases. Les miARN sont stables dans les fluides corporels et leurs séquences sont très conservées chez les animaux². Les miARN régulent l’expression de plusieurs protéines à travers des milliers de cibles, influençant ainsi diverses voies de signalisation 2,3,4,5,6,7,8. Ces dernières années, il a été rapporté que les miARN sont impliqués dans divers états pathologiques et sont des biomarqueurs efficaces pour le diagnostic précoce de plusieurs maladies.

L’objectif global de ce protocole est de purifier et de détecter avec succès les miARN dans les reins d’un modèle murin d’IRA induit par l’IRI. Ce modèle IRI est un modèle largement utilisé de l’IRA et de la fibrose rénale. Les avantages du modèle IRI incluent la possibilité de confirmer visuellement si l’ischémie-reperfusion a été réalisée et de déterminer le moment exact de l’apparition de l’IRA. Cependant, une durée de clamp suffisamment longue pour causer des lésions tubulaires larges est associée à un taux de mortalité élevé, tandis qu’une courte durée de clamp ne provoque pas de dommages tubulaires, ce qui entraîne une grande variation dans la progression des dommages tubulaires dans ce modèle expérimental. Par rapport au modèle de clampage bilatéral, le tissu de néphrectomie droit prélevé dans le modèle IRI rénal unilatéral agit comme un contrôle et assure l’insuffisance rénale.

L’échantillon de rein est écrasé à l’aide d’un homogénéisateur en verre, dans lequel les protéines et les acides nucléiques sont séparés, et l’ADN et l’ARN sont séparés⁹. L’ARN total, y compris les miARN, est purifié à partir de l’échantillon de rein à l’aide d’une colonne^{de spin 9} à base de membrane de silice. Par la suite, la synthèse de l’ADNc (transcription inverse) est réalisée à partir de l’ARN total à l’aide de la poly(A) polymérase et des amorces oligo-dT¹⁰. Enfin, l’expression du miARN est déterminée par qRT-PCR à l’aide d’un colorant intercalateur¹⁰. La qRT-PCR peut quantifier plus précisément l’expression des gènes par rapport à la PCR des volumes d’amplification aux extrémités. La qRT-PCR mesure des concentrations élevées et se caractérise par une large plage dynamique, ce qui permet une quantification précise qui dépend du nombre de cycles. Des études antérieures ont rapporté que des processus simples pouvaient être utilisés pour purifier et détecter efficacement les miARN dans les tissus ^8,9,10. Les méthodes décrites dans ce protocole pour la synthèse de l’ADNc (transcription inverse) et la détection de l’expression des miARN par qRT-PCR à l’aide d’un colorant intercalateur ont été signalées comme présentant une précision et une sensibilité élevées¹⁰.

De plus, ce protocole est simple et permet d’obtenir des résultats cohérents entre les laboratoires. Par conséquent, ce protocole est utile dans les études qui nécessitent une détection très précise et sensible des miARN dans les reins d’IRA de souris.

Protocole

Tous les protocoles d’expérimentation animale ont été approuvés par le comité d’éthique animale de l’Université médicale de Jichi et exécutés conformément aux directives d’utilisation et de soin des animaux de laboratoire du Guide de l’Université médicale de Jichi pour les animaux de laboratoire.

1. Modèle IRI

REMARQUE : Surveillez attentivement l’hypothermie, l’hydratation intestinale et la profondeur de l’anesthésie tout au long de la procédure.

1. Préparez les éléments suivants : un tube à centrifuger de 50 ml contenant du coton imbibé d’isoflurane, un tampon chirurgical chauffé, une boîte de Pétri avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), des ciseaux chirurgicaux et des pinces. Maintenez le PBS à 37 °C.
   REMARQUE : Ce modèle IRI a été généré à l’aide de souris C57BL/6 mâles (9 semaines ; 20 à 25 g) logées dans une pièce à température et humidité contrôlées et avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures.
2. Anesthésier l’animal à l’aide d’isoflurane : concentration d’induction 3 à 5 %, concentration d’entretien 2 % à 3 % et concentration pendant le clampage 1 % à 1,5 %. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par la perte des réflexes. L’anesthésie par inhalation présente l’avantage de pouvoir ajuster le temps. La procédure peut prendre beaucoup de temps en raison de l’exfoliation des tissus entourant le rein. Cependant, l’inconvénient de l’anesthésie par inhalation est que la température corporelle a tendance à baisser. Tout au long de la procédure, évitez les anesthésies inutiles.
3. Montez la souris anesthésiée sur un coussin chirurgical chauffé sur son dos, retirez les poils entourant la zone d’incision et vaporisez la peau abdominale de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
4. Faites une incision médiane dans la peau abdominale, les muscles et la membrane péritonéale à l’aide de ciseaux et de pinces.
5. À l’aide d’un coton-tige imbibé de PBS, poussez doucement l’intestin vers le côté gauche de la cavité extra-abdominale, exposant le rein et l’uretère droits. La longue durée de la procédure est susceptible de provoquer des lésions intestinales postopératoires. Ainsi, il est préférable d’opérer sans retirer les intestins de la cavité abdominale lorsqu’un champ visuel peut être obtenu. Évitez de dessécher les intestins. Les écouvillons secs ou la gaze peuvent causer des dommages intestinaux.
6. Soulevez l’uretère droit à l’aide d’une pince coudée. Lister l’uretère droit deux fois à l’aide de sutures tressées en soie 4/0. Coupez entre les sutures, en laissant plus longtemps la suture la plus proche du rein.
7. Tenez soigneusement la suture restante sans trop tirer et disséquez franchement le tissu conjonctif et la graisse le long du rein. Effectuer une intervention chirurgicale par derrière réduit le risque de lésions hépatiques.
   1. Identifiez un vaisseau sanguin, autre que les artères rénales et les veines, qui alimente le rein droit en sang, puis ligaturez-le ou coupez-le. Lorsque le rein droit est suffisamment détaché, ligaturez l’artère et la veine rénales droites à l’aide d’une suture tressée en soie 4/0. Au lieu de suturer, utilisez une pince hémostatique.
   2. À l’aide d’un coton-tige imbibé de PBS, poussez doucement l’intestin vers le côté droit de la cavité extra-abdominale pour exposer le rein gauche, puis couvrez l’intestin avec un drap humidifié pour l’empêcher de se dessécher. Disséquez le tissu conjonctif et la graisse autour du rein gauche.
8. Identifiez un vaisseau sanguin, autre que les artères rénales et les veines, qui alimente le rein gauche en sang, puis ligaturez-le ou coupez-le. Clamper l’artère rénale et la veine rénale pour induire une ischémie rénale gauche. Positionnez le clip hémostatique à environ 1 cm du rein pour éviter d’endommager le parenchyme rénal. Le succès de l’ischémie peut être confirmé visuellement par un assombrissement progressif et uniforme du rein.
9. Retournez les intestins dans la cavité abdominale en prenant soin d’éviter la torsion intestinale ; Fermez temporairement la peau abdominale et drapez pour maintenir un environnement humide. Réduisez autant que possible la concentration de l’anesthésie par inhalation et essayez de garder l’animal au chaud. Le temps de serrage est de 25 à 45 min. Un temps de clampage plus long induit des lésions rénales plus graves mais augmente également la mortalité à long terme. Ajustez en analysant les résultats de la pathologie.
10. Retirez la pince une fois la période d’ischémie terminée. Assurez-vous que la reperfusion du flux sanguin et la couleur des reins s’améliorent. Confirmez que l’intestin n’est pas tordu avant de fermer la peau abdominale. Instiller PBS par voie intrapéritonéale comme supplément de volume avant que l’abdomen ne soit fermé en deux couches. Fermez la peau abdominale à l’aide de sutures en nylon 4-0. Pour des périodes d’ablation rénale plus longues, la possibilité d’adhérences intestinales peut être réduite en fermant séparément la paroi abdominale et le péritoine.
11. Pour minimiser le risque d’infection postopératoire, appliquez un antiseptique (par exemple, une solution iode/alcool) sur la zone chirurgicale.

2. Prélèvement d’échantillons de rein

REMARQUE : Cette vidéo a un temps de clampage de 45 minutes, recueillant les reins 24 h plus tard.

1. Anesthésier l’animal avec 5 % d’isoflurane et confirmer la profondeur de l’anesthésie par la perte des réflexes.
2. Faites une incision médiane dans la peau abdominale, les muscles et la membrane péritonéale à l’aide de ciseaux et de pinces. Prélever le sang de la veine cave inférieure perforée par une aiguille de 27 G.
3. Faites une incision médiane dans la paroi thoracique et insérez une aiguille de 23 G dans le ventricule gauche. Confirmez le reflux. Faites une incision dans le foie et injectez 20 ml de PBS. Au fur et à mesure que le sang s’écoule, le foie change de couleur du rouge au rose, confirmant qu’une quantité suffisante de sang a été drainée.
4. Retirez le rein gauche à l’aide d’une pince et de ciseaux et lavez-le avec du PBS dans une boîte de Pétri. Retirez le fascia rénal à l’aide d’une pince, en faisant attention de ne pas assécher le rein.
5. Coupez le rein en deux et utilisez une moitié pour l’histopathologie et l’autre moitié pour l’étape suivante. Évitez le bassinet du rein et prélevez 30 mg de rein. Rangez-le à −80 °C avant utilisation.

3. Purifier les miARN d’échantillons de rein

REMARQUE : Ici, les échantillons de rein pesant 30 mg sont homogénéisés à l’aide d’un homogénéisateur en verre et d’un système de broyage de biopolymères dans une colonne de centrifugation par microcentrifugation. Par la suite, les miARN de l’échantillon de rein sont isolés à l’aide d’une colonne de spin à base de membrane de silice.

1. Préparez les articles suivants : des tubes de microcentrifugation de 1,5 ou 2,0 ml, de l’éthanol à 100 %, du chloroforme, un homogénéisateur de verre, de la glace, un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de centrifugation⁹, des colonnes de centrifugation⁹ à base de membrane de silice, un réactif de lyse à base de phénol/guanidine, un tampon de lavage contenant de la guanidine et de l’éthanol (tampon de lavage 1) et un tampon de lavage contenant de l’éthanol (tampon de lavage 2).
2. Placez un échantillon de rein de 30 mg dans un homogénéisateur en verre et ajoutez 700 μL de réactif de lyse à base de phénol/guanidine. Effectuez cette étape sur de la glace car le tissu est dénaturé par la chaleur.
3. Homogénéisez l’échantillon de rein en appuyant lentement le pilon sur l’échantillon en le tordant. Répétez ce processus plusieurs dizaines de fois sur de la glace jusqu’à ce que l’échantillon de rein soit complètement dissous dans le réactif de lyse à base de phénol/guanidine. Lorsque le miARN n’est pas obtenu lors des mesures ultérieures, cela est probablement dû à une dissolution insuffisante.
4. Pour une homogénéisation plus poussée, transférez le lysat homogénéisé dans le système de broyage des biopolymères dans une colonne de centrifugation placée dans un tube de collecte de 2,0 mL. Centrifugez-le à 14 000 × g pendant 3 min à température ambiante.
5. Transférez le lysat homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugation.
6. Ajoutez 140 μL de chloroforme au lysat homogénéisé et fermez solidement le tube. Mélanger le tube par inversion pendant 15 s.
7. Incuber les échantillons pendant 2 à 3 minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez-les à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
8. Transférez le surnageant (normalement 300 μL) dans un nouveau tube de microcentrifugation sans perturber le précipité et ajoutez 1,5 volume (normalement 450 μL) d’éthanol à 100 %. Mélangez l’échantillon en vortex pendant 5 s.
9. Pipeter jusqu’à 700 μL de l’échantillon dans une colonne de centrifugation à base de membrane de silice placée dans un tube de prélèvement de 2,0 mL. Fermez le capuchon de la colonne et centrifugez à 15 000 × g pendant 15 s. Après la centrifugation, jeter le flux dans le tube de collecte.
10. Ajoutez 700 μL de tampon de lavage 1 dans la colonne de centrifugation à base de membrane de silice pour laver soigneusement l’échantillon. Fermez le capuchon de la colonne et centrifugez-la à 15 000 × g pendant 15 s. Après la centrifugation, jeter le flux dans le tube de collecte.
11. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage 2 à la colonne de centrifugation à membrane de silice pour éliminer toute trace de sel. Fermer le capuchon de la colonne, et centrifuger à 15 000 × g pendant 15 s. Après la centrifugation, jeter le flux dans le tube de collecte.
    1. Répétez l’étape 3.11.
12. Centrifuger à nouveau la colonne de centrifugation à 15 000 × g pendant 1 min. Après la centrifugation, jeter le flux dans le tube de collecte.
13. Placez la colonne de centrifugation à base de membrane de silice dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 ml. Transférez 25 μL d’eau sans RNase dans la colonne et fermez le capuchon de la colonne. Laissez l’échantillon à température ambiante pendant 5 min, puis centrifugez-le à 15 000 × g pendant 1 min.
14. Transférez l’éluat de 25 μL contenant des miARN dans un nouveau tube de microcentrifugation. Étant donné que le miARN est dégradé par dissolution répétée, il est recommandé de distribuer l’échantillon dans 2 ou 3 tubes. Rangez-les à −80 °C avant de les utiliser.

4. Transcription inverse des miARN

REMARQUE : Ici, 1,0 μg d’ARN isolé est transcrit en sens inverse à l’aide de la transcriptase inverse, de la poly(A) polymérase et des amorces oligo-dT.

1. Préparez les articles suivants : tubes de microcentrifugation de 1,5 ml ; Tubes à bande à 8 puits ; Eau sans RNase ; glace; un mélange d’acides nucléiques 10x contenant des désoxynucléotides, des triphosphates de ribonucléotide et des amorces oligo-dT ; un mélange de poly(A) polymérase et de transcriptase inverse ; et tampon d’activation, y compris le Mg²⁺, les désoxyribonucléotides, les amorces oligo-dT et les amorces aléatoires¹⁰.
2. Préparez une solution de mélange maître contenant 2,0 μL de mélange d’acides nucléiques 10x, 2,0 μL de poly(A) polymérase et de transcriptase inverse, et 4,0 μL de tampon d’activation 5x, y compris Mg²⁺, des désoxyribonucléotides, des amorces oligo-dT et des amorces aléatoires, pour un total de 8,0 μL par tube.
3. Versez 8,0 μL de la solution de mélange maître dans chaque tube.
4. Ajouter 1,0 μg de miARN isolés purifiés de l’échantillon de rein dans chaque tube.
5. Ajouter de l’eau exempte de RNase dans chaque tube jusqu’à un total de 20 μL. Bien mélanger par pipetage et centrifuger à 1 500 x g pendant 15 s.
6. Incuber les échantillons pendant 60 min à 37 °C, suivi immédiatement d’une incubation pendant 5 min à 95 °C. Cette étape peut être réalisée dans un thermocycleur.
7. Transférez l’ADNc dans un nouveau tube de microcentrifugation et diluez 10 fois (1:10) avec de l’eau sans RNase.
8. Conservez l’ADNc dilué à court terme sur de la glace et à long terme à −80 °C avant utilisation.

5. qRT-PCR des miARN

REMARQUE : La qRT-PCR des miARN est réalisée à l’aide d’un colorant intercalateur. Ici, des amorces pour U6 small nuclear 2 (ARN-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p et miRNA-574-5p ont été utilisés.

1. Préparez les éléments suivants : des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, des plaques réactionnelles à 96 puits pour la qRT-PCR, un film adhésif pour la plaque réactionnelle à 96 puits, des amorces spécifiques aux miARN, un Master Mix PCR comprenant de l’ADN polymérase Taq, un tampon PCR, des désoxynucléotides et des amorces universelles¹⁰, et un instrument de PCR en temps réel.
2. Préparez un mélange maître contenant 12,5 μL de 2 Master Mix PCR, 2,5 μL de chaque amorce de miARN (5 μM) dissoute dans de l’eau sans nucléase et 1,25 μL de 10 amorces universelles pour chaque puits.
3. Versez 22,5 μL du mélange principal dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
4. Ajouter 2,5 μL d’ADNc modèle dans chaque puits.
5. Scellez la plaque avec le film adhésif pour la plaque de réaction à 96 puits. Ensuite, centrifugez la plaque à 1 000 × g pendant 30 s.
6. À l’aide de l’instrument et du logiciel de PCR en temps réel, exécutez le programme de cyclage PCR comme suit.
   1. Placez la plaque dans l’instrument de PCR en temps réel. Attribuez un nom à l’échantillon et au miARN cible dans chaque puits à l’aide du logiciel de PCR en temps réel.
   2. Entrez les conditions de cycle de PCR suivantes dans le logiciel de PCR en temps réel conformément aux instructions : préincubation à 95 °C pendant 15 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 15 s, de recuit à 55 °C pendant 30 s et d’extension à 70 °C pendant 30 s.
7. Analysez les données qRT-PCR à l’aide du logiciel de l’instrument de PCR en temps réel. Vérifiez s’il y a des réactions non spécifiques. Analysez la courbe de dissociation ou la courbe de fusion pour confirmer qu’il n’y a pas eu d’amplification autre que celle prévue.
   1. Normaliser le niveau d’expression des miARN cibles pour RNU-6 en tant que contrôle endogène. Calculez le niveau d’expression relatif des miARN cibles à l’aide de la méthode 2^{−ΔΔCT 11}.

Résultats

Ici, le profil d’expression des miARN chez les souris AKI a été étudié. Le profil d’expression des miARN a été étudié dans divers organes et tissus chez la souris. Les miARN sont d’importants régulateurs post-transcriptionnels et sont maintenant largement étudiés dans la caractérisation de diverses maladies, y compris l’IRA. Les miARN ont le potentiel d’aider à élucider des conditions pathologiques et d’être appliqués au traitement de l’IRA^...

Discussion

En utilisant le protocole présenté dans ce manuscrit, les miARN du rein de souris IRI ont été purifiés et détectés avec succès par qRT-PCR. Les points critiques de la procédure d’induction de l’IRI dans le protocole comprennent une surveillance minutieuse de la température corporelle et des concentrations d’anesthésie, qui sont connues pour affecter l’IRA²⁰. La force de ce protocole est qu’il permet de confirmer visuellement si une ischémie-r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primer	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420