Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines Mausmodells für akutes Nierenversagen unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion vorgestellt. Dieses Protokoll konzentriert sich auf ein Mausmodell mit ischämischer Nierenschädigung und die sorgfältige Extraktion von microRNA-Proben.

Zusammenfassung

MicroRNAs (miRNAs) sind an verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt und sind wirksame Biomarker für die Früherkennung von Krankheiten und die Behandlung bei Mäusen. Standardprotokolle für die Aufreinigung von miRNAs und den Nachweis ihrer Expression in den Nieren von Mäusen mit akutem Nierenversagen (AKI) sind jedoch nicht gut etabliert. In dieser Studie wurde ein effektives und einfaches Protokoll zur Reinigung und Quantifizierung von miRNAs in den Nieren eines AKI-Mausmodells entwickelt, das durch renale Ischämie-Reperfusion unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) induziert wurde. Dieses Protokoll umfasst fünf Schritte: 1) Induktion von AKI durch renale Ischämie-Reperfusion, 2) Entnahme von Nieren, 3) Reinigung von Gesamt-RNA, einschließlich miRNAs, aus der Niere, 4) cDNA-Synthese durch reverse Transkription von miRNA und 5) qRT-PCR zum Nachweis der miRNA-Expression. Mit Hilfe dieses Protokolls kann das Modell der renalen Ischämie-Reperfusions-Schädigung mit leichten bis schweren Formen der AKI erstellt werden. Darüber hinaus kann bei richtiger Befolgung des Verfahrens ein konsistentes AKI-Modell mit minimalen individuellen Unterschieden erhalten werden. Dieser qRT-PCR-Assay zeigt einen sehr großen dynamischen Bereich und ermöglicht die Unterscheidung reifer miRNAs, die mit hoher Spezifität genau quantifiziert werden können. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das miRNA-Expressionsprofil in AKI-Nieren zu untersuchen.

Einleitung

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) der Niere stellen einen der Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung eines akuten Nierenversagens (AKI) dar¹. AKI spielt eine wichtige Rolle bei der Prognose von Patienten, aber spezifische Therapien und frühdiagnostische Biomarker sind noch nicht etabliert.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs mit ca. 18–25 Basen. miRNAs sind in Körperflüssigkeiten stabil, und ihre Sequenzen sind bei Tieren hoch konserviert². MiRNAs regulieren die Expression mehrerer Proteine über Tausende von Zielen und beeinflussen dadurch verschiedene Signalwege 2,3,4,5,6,7,8. In den letzten Jahren wurde berichtet, dass miRNAs an verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt sind und effektive Biomarker für die Früherkennung verschiedener Krankheiten sind.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die erfolgreiche Aufreinigung und der Nachweis von miRNAs in den Nieren eines AKI-Mausmodells, das durch IRI induziert wurde. Dieses IRI-Modell ist ein weit verbreitetes Modell für AKI und Nierenfibrose. Zu den Vorteilen des IRI-Modells gehört die visuelle Bestätigung, ob eine Ischämie-Reperfusion erreicht wurde, und die Bestimmung des genauen Zeitpunkts des AKI-Beginns. Eine Klemmdauer, die lang genug ist, um einen breiten tubulären Schaden zu verursachen, ist jedoch mit einer hohen Mortalitätsrate verbunden, während eine kurze Klemmdauer keinen tubulären Schaden verursacht, was in diesem experimentellen Modell zu einer großen Variation im Verlauf des tubulären Schadens führt. Im Vergleich zum bilateralen Klemmmodell fungiert das rechte Nephrektomiegewebe, das im unilateralen renalen IRI-Modell entnommen wird, als Kontrolle und stellt das Nierenversagen sicher.

Die Nierenprobe wird unter Verwendung eines Glashomogenisators zerkleinert, wobei Proteine und Nukleinsäuren getrennt und DNA und RNA getrennt werden⁹. Die Gesamt-RNA, einschließlich miRNA, wird aus der Nierenprobe unter Verwendung einer auf Siliziumdioxidmembran basierenden Spin-Säule⁹ aufgereinigt. Anschließend wird die cDNA-Synthese (reverse Transkription) aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern¹⁰ durchgeführt. Schließlich wird die miRNA-Expression mittels qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs¹⁰ bestimmt. Die qRT-PCR kann die Genexpression von Amplifikationsvolumina an Endpunkten im Vergleich zur PCR genauer quantifizieren. Die qRT-PCR misst hohe Konzentrationen und zeichnet sich durch einen großen Dynamikbereich aus, der eine genaue Quantifizierung ermöglicht, die von der Anzahl der Zyklen abhängt. Frühere Studien berichteten, dass einfache Verfahren verwendet werden könnten, um miRNAs in Geweben effektiv zu reinigen und zu detektieren ^8,9,10. Es wurde berichtet, dass die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden für die cDNA-Synthese (reverse Transkription) und den Nachweis der miRNA-Expression durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs eine hohe Genauigkeit und Sensitivität aufweisen¹⁰.

Darüber hinaus ist dieses Protokoll einfach und erzielt konsistente Ergebnisse zwischen den Laboren. Daher ist dieses Protokoll nützlich in Studien, die einen hochpräzisen und sensitiven miRNA-Nachweis in Maus-AKI-Nieren erfordern.

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Protokoll

Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Tierethikkommission der Medizinischen Universität Jichi genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren aus dem Leitfaden für Labortiere der Medizinischen Universität Jichi durchgeführt.

1. IRI-Modell

HINWEIS: Überwachen Sie während des gesamten Eingriffs sorgfältig auf Unterkühlung, Darmbefeuchtung und Narkosetiefe.

1. Bereiten Sie die folgenden Gegenstände vor: ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit in Isofluran getränkter Baumwolle, eine erhitzte Operationsunterlage, eine Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), eine chirurgische Schere und eine Pinzette. Halten Sie den PBS bei 37 °C.
   HINWEIS: Dieses IRI-Modell wurde mit männlichen C57BL/6-Mäusen (9 Wochen; 20–25 g) erstellt, die in einem Raum mit kontrollierter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht waren.
2. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran: Induktionskonzentration 3 % bis 5 %, Erhaltungskonzentration 2 % bis 3 % und Konzentration während des Anklemmens 1 % bis 1,5 %. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust der Reflexe. Die Inhalationsanästhesie hat den Vorteil, dass die Zeit eingestellt werden kann. Der Eingriff kann aufgrund des Peelings des Gewebes, das die Niere umgibt, viel Zeit in Anspruch nehmen. Der Nachteil der Inhalationsanästhesie ist jedoch, dass die Körpertemperatur tendenziell sinkt. Vermeiden Sie während des gesamten Eingriffs eine unnötige Anästhesie.
3. Montieren Sie die anästhesierte Maus auf einer beheizten Operationsunterlage auf dem Rücken, entfernen Sie die Haare, die den Schnittbereich umgeben, und besprühen Sie die Bauchhaut der Maus mit 70% Ethanol.
4. Machen Sie mit einer Schere und Pinzette einen Schnitt in der Mittellinie der Bauchhaut, der Muskeln und der Bauchhaut.
5. Schieben Sie mit einem mit PBS angefeuchteten Wattestäbchen den Darm vorsichtig in Richtung der linken Seite der extraabdominalen Höhle und legen Sie die rechte Niere und den Harnleiter frei. Die lange Eingriffszeit kann zu postoperativen Darmschäden führen. Daher ist es besser, zu operieren, ohne den Darm aus der Bauchhöhle zu entfernen, wenn ein Gesichtsfeld erhalten werden kann. Vermeiden Sie ein Austrocknen des Darms. Trockene Tupfer oder Gaze können Darmschäden verursachen.
6. Heben Sie den rechten Harnleiter mit einer abgewinkelten Pinzette an. Lilizieren Sie den rechten Harnleiter zweimal mit 4/0 seidengeflochtenen Nähten. Schneiden Sie zwischen den Nähten und lassen Sie die Naht, die näher an der Niere liegt, länger.
7. Halten Sie die verbleibende Naht vorsichtig fest, ohne zu stark zu ziehen, und präzieren Sie das Bindegewebe und das Fett entlang der Niere stumpf. Die Operation von hinten reduziert das Risiko von Leberschäden.
   1. Identifizieren Sie ein Blutgefäß, das die rechte Niere mit Blut versorgt, und binden Sie es dann oder schneiden Sie es ab. Wenn die rechte Niere ausreichend abgelöst ist, ligieren Sie die rechte Nierenarterie und -vene mit einer 4/0 seidengeflochtenen Naht. Anstatt zu nähen, verwenden Sie einen hämostatischen Clip.
   2. Schieben Sie mit einem mit PBS angefeuchteten Wattestäbchen den Darm vorsichtig in Richtung der rechten Seite der extrabauchweiten Höhle, um die linke Niere freizulegen, und bedecken Sie den Darm dann mit einem angefeuchteten Tuch, um ein Austrocknen zu verhindern. Präparieren Sie das Bindegewebe und das Fett um die linke Niere.
8. Identifizieren Sie ein Blutgefäß, das die linke Niere mit Blut versorgt, und binden Sie es dann ab oder schneiden Sie es ab. Klemmen Sie die Nierenarterie und die Nierenvene ab, um eine Ischämie der linken Niere zu induzieren. Positionieren Sie den hämostatischen Clip etwa 1 cm von der Niere entfernt, um eine Schädigung des Nierenparenchyms zu vermeiden. Eine erfolgreiche Ischämie kann durch eine allmähliche, gleichmäßige Verdunkelung der Niere visuell bestätigt werden.
9. Bringen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle zurück und achten Sie darauf, dass sich der Darm nicht verdreht. Schließen Sie vorübergehend die Bauchhaut und ziehen Sie sie ab, um ein feuchtes Milieu zu erhalten. Reduzieren Sie die Konzentration der Inhalationsanästhesie so weit wie möglich und versuchen Sie, das Tier warm zu halten. Die Spannzeit beträgt 25–45 min. Eine längere Klemmzeit führt zu schwereren Nierenschäden, erhöht aber auch die Langzeitsterblichkeit. Passen Sie sich an, indem Sie die pathologischen Ergebnisse analysieren.
10. Entfernen Sie die Klemme nach Beendigung der Ischämie. Stellen Sie sicher, dass sich die Durchblutung, die Reperfusion und die Nierenfarbe verbessern. Vergewissern Sie sich, dass der Darm nicht verdreht ist, bevor Sie die Bauchhaut schließen. Instillieren Sie PBS intraperitoneal als Volumenergänzung, bevor der Bauch in zwei Schichten verschlossen wird. Verschließen Sie die Bauchhaut mit 4-0 Nylonnähten. Bei längeren Nierenentnahmezeiträumen kann die Möglichkeit von Darmadhäsionen durch getrenntes Verschließen der Bauchdecke und des Bauchfells verringert werden.
11. Um das Risiko einer postoperativen Infektion zu minimieren, tragen Sie ein Antiseptikum (z. B. Jod/Alkohol-Lösung) auf den Operationsbereich auf.

2. Entnahme von Nierenproben

HINWEIS: Dieses Video hat eine Klemmzeit von 45 Minuten, wobei die Nieren 24 Stunden später entnommen werden.

1. Betäuben Sie das Tier mit 5% Isofluran und bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der Reflexe.
2. Machen Sie mit einer Schere und Pinzette einen Schnitt in der Mittellinie der Bauchhaut, der Muskeln und der Bauchhaut. Entnehmen Sie das Blut aus der unteren Hohlvene, die mit einer 27-G-Nadel punktiert wurde.
3. Machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Brustwand und führen Sie eine 23 G Nadel in die linke Herzkammer ein. Bestätigen Sie den Rückfluss. Machen Sie einen Schnitt in der Leber und injizieren Sie 20 ml PBS. Wenn das Blut abfließt, verfärbt sich die Leber von rot nach rosa, was bestätigt, dass ausreichend Blut abgelassen wurde.
4. Entfernen Sie die linke Niere mit einer Pinzette und einer Schere und waschen Sie sie mit PBS in einer Petrischale. Entfernen Sie die Nierenfaszie mit einer Pinzette und achten Sie darauf, die Niere nicht auszutrocknen.
5. Schneiden Sie die Niere in zwei Hälften und verwenden Sie eine Hälfte für die Histopathologie und die andere Hälfte für den nächsten Schritt. Vermeiden Sie das Nierenbecken und entnehmen Sie 30 mg der Niere. Lagern Sie diesen vor Gebrauch bei -80 °C.

3. Aufreinigung von miRNAs aus Nierenproben

HINWEIS: Hier werden Nierenproben mit einem Gewicht von 30 mg mit einem Glashomogenisator und einem Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spin-Säule homogenisiert. Anschließend wird miRNA aus der Nierenprobe mit Hilfe einer Spin-Säule auf Siliziumdioxid-Membran-Basis isoliert.

1. Bereiten Sie die folgenden Artikel vor: 1,5 oder 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 100 % Ethanol, Chloroform, einen Glashomogenisator, Eis, ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spin-Säule⁹, Spin-Säulen⁹ auf Basis von Siliziumdioxid-Membranen, Lysereagenz auf Phenol-/Guanidin-Basis, Waschpuffer mit Guanidin und Ethanol (Waschpuffer 1) und Waschpuffer mit Ethanol (Waschpuffer 2).
2. Geben Sie eine 30 mg Nierenprobe in einen Glashomogenisator und fügen Sie 700 μl Phenol/Guanidin-basiertes Lysereagenz hinzu. Führen Sie diesen Schritt auf Eis durch, da das Gewebe durch Hitze denaturiert wird.
3. Homogenisieren Sie die Nierenprobe, indem Sie den Stößel langsam auf die Probe drücken, indem Sie ihn drehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrere Dutzend Mal auf Eis, bis sich die Nierenprobe vollständig in dem Phenol/Guanidin-basierten Lysereagenz aufgelöst hat. Wenn miRNA in nachfolgenden Messungen nicht erhalten wird, liegt dies wahrscheinlich an einer unzureichenden Auflösung.
4. Zur weiteren Homogenisierung wird das homogenisierte Lysat in das Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spin-Säule überführt, die in einem 2,0-ml-Sammelröhrchen platziert ist. Zentrifugieren Sie diesen bei 14.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
5. Übertragen Sie das homogenisierte Lysat in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Geben Sie 140 μl Chloroform zum homogenisierten Lysat und verschließen Sie das Röhrchen fest. Mischen Sie das Röhrchen durch Inversion für 15 s.
7. Inkubieren Sie die Proben 2–3 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann zentrifugieren Sie sie bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C.
8. Den Überstand (normalerweise 300 μl) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen, ohne den Niederschlag zu stören, und 1,5 Volumen (normalerweise 450 μl) 100 % Ethanol hinzufügen. Mischen Sie die Probe, indem Sie sie 5 s lang vortexen.
9. Pipettieren Sie bis zu 700 μl der Probe in eine Spin-Säule auf Basis von Siliziumdioxidmembranen, die in einem 2,0-ml-Sammelröhrchen platziert wird. Schließen Sie die Säulenkappe und zentrifugieren Sie 15 s lang bei 15.000 × g . Nach der Zentrifugation ist der Durchfluss im Sammelröhrchen zu entsorgen.
10. Geben Sie 700 μl Waschpuffer 1 in die Schleudersäule auf Kieselsäuremembranbasis, um die Probe gründlich zu waschen. Schließen Sie den Deckel der Säule und zentrifugieren Sie sie 15 s lang bei 15.000 × g . Nach der Zentrifugation ist der Durchfluss im Sammelröhrchen zu entsorgen.
11. Geben Sie 500 μl Waschpuffer 2 in die Spin-Säule auf Siliziumdioxidmembran-Basis, um alle Salzspuren zu entfernen. Schließen Sie die Kappe der Säule und zentrifugieren Sie sie 15 s lang bei 15.000 × g . Nach der Zentrifugation ist der Durchfluss im Sammelröhrchen zu entsorgen.
    1. Wiederholen Sie Schritt 3.11.
12. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule auf Basis von Siliziumdioxidmembranen erneut bei 15.000 × g für 1 min. Nach der Zentrifugation ist der Durchfluss im Sammelröhrchen zu entsorgen.
13. Setzen Sie die Spin-Säule auf Siliziumdioxidmembranbasis in ein neues 1,5-ml-Entnahmeröhrchen ein. Füllen Sie 25 μl RNasefreies Wasser in die Säule und schließen Sie die Säulenkappe. Lassen Sie die Probe 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 15.000 × g .
14. Das 25 μl Eluat, das miRNAs enthält, wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Da miRNA durch wiederholtes Auflösen abgebaut wird, wird empfohlen, die Probe in 2 oder 3 Röhrchen zu geben. Lagern Sie diese vor Gebrauch bei -80 °C.

4. Reverse Transkription von miRNA

HINWEIS: Hier werden 1,0 μg der isolierten RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern reverse-transkribiert.

1. Bereiten Sie die folgenden Artikel vor: 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen; 8-Well-Streifenrohre; RNase-freies Wasser; Eis; eine 10-fache Nukleinsäuremischung, die Desoxynukleotide, Ribonukleotidtriphosphate und Oligo-dT-Primer enthält; eine Mischung aus Poly(A)-Polymerase und reverser Transkriptase; und aktivierender Puffer, einschließlich Mg²⁺, Desoxyribonukleotide, Oligo-dT-Primer und zufällige Primer¹⁰.
2. Bereiten Sie eine Mastermix-Lösung vor, die 2,0 μl 10x Nukleinsäuremix, 2,0 μl Poly(A)-Polymerase und Reverse-Transkriptase-Mix und 4,0 μl 5x aktivierenden Puffer, einschließlich Mg²⁺, Desoxyribonukleotide, Oligo-dT-Primer und zufällige Primer, für insgesamt 8,0 μl pro Röhrchen enthält.
3. Geben Sie 8,0 μl der Mastermix-Lösung in jedes Röhrchen.
4. Geben Sie 1,0 μg isolierte miRNAs, die aus der Nierenprobe gereinigt wurden, in jedes Röhrchen.
5. Geben Sie RNase-freies Wasser in jedes Röhrchen bis zu einer Gesamtmenge von 20 μl. Gründlich durch Pipettieren mischen und 15 s lang bei 1.500 x g zentrifugieren.
6. Die Proben werden 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer sofortigen Inkubation von 5 Minuten bei 95 °C. Dieser Schritt kann in einem Thermocycler durchgeführt werden.
7. Übertragen Sie die cDNA in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie sie 10-mal (1:10) mit RNase-freiem Wasser.
8. Lagern Sie die verdünnte cDNA vor der Verwendung kurzfristig auf Eis und langfristig bei -80 °C.

5. qRT-PCR von miRNA

HINWEIS: Die qRT-PCR von miRNA wird unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs durchgeführt. Hier wurden Primer für U6 small nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p und miRNA-574-5p verwendet.

1. Bereiten Sie die folgenden Artikel vor: 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, 96-Well-Reaktionsplatten für die qRT-PCR, Klebefilm für die 96-Well-Reaktionsplatte, miRNA-spezifische Primer, PCR-Mastermix bestehend aus Taq-DNA-Polymerase, PCR-Puffer, Desoxynukleotiden und Universalprimern¹⁰ sowie ein Echtzeit-PCR-Instrument.
2. Bereiten Sie einen Mastermix vor, der 12,5 μl 2x PCR-Mastermix, 2,5 μl jedes miRNA-Primers (5 μM), gelöst in nukleasefreiem Wasser, und 1,25 μl 10x Universalprimer für jede Vertiefung enthält.
3. Geben Sie 22,5 μl des Mastermixes in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
4. Geben Sie 2,5 μl Template-cDNA in jede Vertiefung.
5. Versiegeln Sie die Platte mit der Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 × g für 30 s.
6. Führen Sie das PCR-Zyklusprogramm mit dem Echtzeit-PCR-Instrument und der Software wie folgt aus.
   1. Legen Sie die Platte in das real-time PCR-Instrument. Weisen Sie der Probe und der Ziel-miRNA in jeder Vertiefung mit der Real-Time-PCR-Software einen Namen zu.
   2. Geben Sie die folgenden PCR-Zyklusbedingungen gemäß den Anweisungen in die Echtzeit-PCR-Software ein: Vorinkubation bei 95 °C für 15 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen Denaturierung bei 94 °C für 15 s, Glühen bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 70 °C für 30 s.
7. Analysieren Sie die qRT-PCR-Daten mit der Software des Real-Time-PCR-Instruments. Auf unspezifische Reaktionen prüfen. Analysieren Sie die Dissoziationskurve oder die Schmelzkurve, um zu bestätigen, dass keine andere als die beabsichtigte Verstärkung stattgefunden hat.
   1. Normalisieren Sie das Expressionsniveau von Ziel-miRNAs auf RNU-6 als endogene Kontrolle. Berechnen Sie das relative Expressionsniveau von Ziel-miRNAs mit der ^{2-ΔΔCT-Methode 11}.

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Ergebnisse

Hier wurde das miRNA-Expressionsprofil in AKI-Mäusen untersucht. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Organen und Geweben von Mäusen untersucht. MiRNAs sind wichtige posttranskriptionelle Regulatoren und werden derzeit ausgiebig bei der Charakterisierung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich AKI, untersucht. MiRNAs haben das Potenzial, zur Aufklärung pathologischer Zustände beizutragen und bei der Behandlung von AKI¹² eingesetzt zu werd...

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Diskussion

Unter Verwendung des in diesem Manuskript vorgestellten Protokolls wurden miRNAs aus der Niere von IRI-Mäusen erfolgreich aufgereinigt und mittels qRT-PCR nachgewiesen. Zu den kritischen Punkten des IRI-induzierenden Verfahrens im Protokoll gehört die sorgfältige Überwachung der Körpertemperatur und der Anästhesiekonzentrationen, von denen bekannt ist, dass sie AKI²⁰ beeinflussen. Die Stärke dieses Protokolls besteht darin, dass es eine visuelle Bestätigun...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bent Tip Tapered Tweezers without Hook	Natsume Seisakusho	MA-47
Buffer RLT	Qiagen	79216	wash buffer 1
Buffer RWT	Qiagen	1067933	wash buffer 2
C57B6 mice	SLC	not assign
forcep with Teeth	Natsume Seisakusho	MA-49
forcep without Teeth	Natsume Seisakusho	MA-48-1
Hemostatic clips	Natsume Seisakusho	KN−353
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-132-3p primer	Qiagen	MS00003458	5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p primer	Qiagen	MS00029274	5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p primer	Qiagen	MS00031514	5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p primer	Qiagen	MS00003815	5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p primer	Qiagen	MS00009079	5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p primer	Qiagen	MS00003871	5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p primer	Qiagen	MS00043617	5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	silica-membrane based spin column
miScript II RT kit	Qiagen	218161
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	not disclosed
surgical scissors	Natsume Seisakusho	B-2
Vascular clip applier	VITALITEC	1621420