监测三D培养中的癌细胞入侵和T细胞毒性

摘要

该方法同时评价了三D球类测定和T细胞毒性中的癌细胞入侵。球体在无脚手架的阿加罗斯多微井铸件中生成。I型胶原蛋白基质中的共同培养和嵌入在同一设备中进行，允许监测癌细胞入侵和T细胞中角细胞毒性。

摘要

在用免疫疗法治疗癌症方面取得了重大进展，尽管许多癌症仍然对治疗具有抗药性。数量有限的测定方法允许直接监测和机械洞察肿瘤和免疫细胞之间的相互作用，其中，T细胞在执行适应性免疫系统对癌细胞的细胞毒性反应方面起着重要作用。大多数测定基于细胞的二维（2D）共培养，因为相对易用性，但侵入性生长表型的代表性有限，这是癌细胞的标志之一。目前的三维（3D）共培养系统要么需要特殊设备，要么需要单独的监测，以入侵共培养的癌细胞和相互作用的T细胞。

在这里，我们描述了一种同时监测癌细胞球体和T细胞毒性在共培养的三D中的侵入性行为的方法。球体形成是由无支架的阿加罗斯微井中具有 U 形底部的增强细胞相互作用驱动的。T细胞共培养和癌细胞入侵到第一型胶原蛋白基质中，在亚高糖铸件的微井内进行，无需转移细胞，从而在整个测定过程中保持完好的3D共培养系统。胶原蛋白基质可与阿加罗斯铸件分离，允许免疫荧光（IF）染色和细胞共合成像。此外，细胞可以分离为进一步生长或接受分析，如基因表达或荧光激活细胞排序（FACS）。最后，在嵌入和分段后，可以通过免疫组织化学（IHC）对3D共培养进行分析。测定的可能修改包括细胞外基质（ECM）的成分改变，以及癌细胞中加入不同的频闪或免疫细胞。

引言

尽管癌症免疫治疗在过去十年中有了显著改善，但我们对敏感性和治疗耐药性的机械理解仍然相当^差。肿瘤具有显著的异质性，肿瘤细胞与微环境以及免疫细胞的动态相互作用，影响肿瘤细胞死亡、侵入性行为和免疫治疗的反应，包括^{免疫疗法1、2、3。,2,3}作为自适应免疫系统的一个手臂，T细胞执行细胞特异性细胞毒性。对T细胞识别和对癌细胞的反应的分析提供了对免疫调节治疗的耐药性和敏感性的机械洞察。

在适当的环境中，癌症和T细胞之间的体外建模和监测相互作用一直具有挑战性，到目前为止，导致有限的机械洞察力。大多数基于细胞的测定依赖于二维（2D）环境，缺乏关键特征，这些特征对于重新概括体内生理学^{4,4、5、6,6}中的三维（3D）至关重要，即空间细胞相互作用、与细胞外基质（ECM）7^的接触、动态代谢需求、因质量^生长而增加的缺氧8以及肿瘤微环境（TME）9^的影响。另一方面，目前使用的三维（3D）共培养和入侵测定系统仍然存在一些缺陷:（1）球体生成和收获^{5、10、（2）}对球体大小缺乏控制，^5,其耗时性质， 形状和细胞^密度11、12、（3）低通量^,型测定，（4）特殊设备^{的要求13、14、（5）,14}需要将共培养转移到不同环境中进行^{不同的测定15、16、17。,16,1712}特别是，共同文化测定的转移往往导致球体的破坏和共同文化完整性的丧失。这尤其适用于具有减少细胞粘附力的"松散"球体。例如，大多数 3D 入侵分析要求球体在初始形成后收获，然后在 ECM^{14、15、16,15中重新暂停}。此重新暂停步骤导致对球体之间的距离失去控制。由于肿瘤球体之间的距离会影响其侵入性行为，这种控制损失引入了高的间检测方差，并降低了可重复性。此外，通过连续离心步骤对周围和肿瘤球类渗透免疫细胞进行评估的细胞分馏测定的应用仅限于产生更稳定的球状球体¹⁷的肿瘤细胞群。

概念和方法

我们的方法使用"一体式"+3D球体共培养模型解决上述缺陷，该模型不需要将球体转移用于后续检测。我们调整了球状形成装置（ 见材料表），以生成一个检测，同时监测癌细胞的侵入性行为和共培养T细胞的细胞毒性。此方法用户友好，价格低廉，允许在相对较高的吞吐量 3D 设置中快速轻松地进行操作。根据所用设备的类型，通过修改种子细胞的数量，在单个移液步骤中可以生成多达 81 个大型统一大小的球体，并控制单个球体大小。在无支架的 agarose 多孔铸件中，通过增强的细胞-细胞相互作用（带 U 形底部）来强制形成球体形成。我们调整了这个3D系统，用于基于动态细胞的功能研究，以及终端分子和生化检测，包括荧光活性细胞分选（FACS）、免疫荧光（IF）或免疫组织化学（IHC）染色，以及完整3D共培养的基因表达分析。

在功能研究方面，在一型胶原蛋白中嵌入球类，导致癌细胞从等量球状体入侵，并允许监测基本细胞系特异性特征，如单细胞与集体细胞迁移18，19。^18,19此外，胶原蛋白基质很容易与黄玫瑰铸件分离，形成1\u20122毫米厚的补丁，含有多个球体，可通过共和显微镜进一步加工用于 IF 染色和成像。这可以在高通量筛选中揭示不同的细胞入侵和细胞-矩阵相互作用。此外，胶原蛋白基质中的细胞可以在胶原蛋白消化和单细胞分离后分离，以便随后的细胞培养或分析。

对于 球体的 IHC 分析，在固定和分割黄糖铸件后，蛋白质或其他感兴趣的分子是可检测的，同时保持球体的地理位置。在所述方法中，球体直接嵌入在红糖铸件中的羟基甲糖加工凝胶中，凝胶作为"盖子"，将球体保留在微井底部。在石蜡嵌入²⁰的石蜡后，以铸件底部为起点进行连续水平剖面。

这种方法与传统的球体 IHC 分切形成对比，该剖块要求在嵌入羟基甲糖加工凝胶²¹ 之前需要采集细胞，并冒着球形破坏的风险，从而失去细胞的空间排列。此外，通过离心来评估免疫细胞是否渗透或保持肿瘤球体¹⁷ 的外围环境，通过直接嵌入来避免细胞分馏。

此外，3D共培养可以通过混合肿瘤、频闪或免疫细胞进行，从而研究肿瘤细胞串扰或重述不同的肿瘤微环境，用于分析细胞-细胞相互作用，包括与内皮细胞^{共培养16。}

此 3D 球状共培养设置可用于执行肿瘤微环境中不同细胞类型的共培养，并评估改变的 ECM 元素的影响。除了第一类胶原蛋白外，其他 ECM 成分（如母体、母细胞/胶原混合物、纤维素）也可以使用，因为肿瘤细胞入侵受不同基质²²的丰度影响。此外，agarose铸件的微井适用于原细胞系的球体形成和低细胞粘附性细胞。

研究方案

在补充文件1中可以找到整个协议中一些常用 单词的列表和说明。

1. 球体的生成

1. 在 1x PBS 中准备和中可 <3>2%的加糖（例如，50 mL 中的 1 g agarose（1x PBS）和1x PBS的10微井橡胶模具中1克加糖。
   注意:避免使用低熔化的阿加罗斯生成用于 IHC 处理的阿加罗斯铸件。
2. 准备阿加罗斯铸件
   注:35微井铸件用于入侵、免疫荧光（IF）和细胞分离测定。81微井铸件用于细胞毒性、免疫细胞化学（IHC）、细胞分离和RNA提取测定。
   1. 在阿加罗斯被自动干燥后，让熔融的加糖冷却至约60°u201270°C。 在细胞培养罩中，使用无菌技术和移液器 500 μL 的熔融气葡萄糖制成每井 81 微井橡胶模具或每井 330 μL 到 35 微井橡胶模具中。
      注意:在混合或移液糖时避免产生气泡。通过轻轻移液去除任何气泡。
   2. 凝固红糖后，小心弯曲橡胶模具，以去除其中铸件的加糖。在此，将双手放在适当的井板上方，让阿加罗斯铸件右滴入井板的一个井中。
      注:将橡胶模具弯曲到不同位置，以避免过度弯曲。弯曲橡胶模具并同时从底部轻轻推来，可能会有所帮助。
   3. 要平衡阿加罗斯铸件，添加细胞培养基，包括DMEM，辅以10%的胎儿牛血清（12井板2.5 mL/井，24井板1 mL/井）。将井板放入细胞培养箱（37°C，5%CO2），孵₂育1小时。
3. 同时，为播种准备细胞培养。
   注:每个阿加罗斯铸件的总细胞种子数将由调查员决定。对于穆林原发性胰腺癌细胞系，为以下所有测定种种35，000个细胞/35微井铸件和81，000个细胞/81微井铸件（平均1000个细胞/球体）。球体的平均直径约为150μu2012200μm后48小时。
4. 首先通过倾斜井板，拆下带 P1000 移液器的 agarose 铸件周围的细胞培养基。然后小心地取出播种室中的介质。
5. 小心地将准备好的肿瘤细胞悬浮液滴入细胞播种室。小心地将井板放回细胞培养库（37°C，5%CO_2），15分钟。
   注:在这一步中，细胞将沉淀到阿加罗斯铸件的微井中。
6. 在 agarose 铸件外侧添加额外的介质（12 井板为 2.5 mL/well，24 井板为 1 mL/well）。
7. 将井板放回细胞培养箱（37°C，5%CO2）48小时。₂
   注:通常细胞在微井中形成球体需要长达几个小时。一般来说，实体肿瘤细胞球体在24小时后形成，48小时后稳定。但是，这在不同的单元格行之间可能有所不同。如有必要，使用 agarose 铸件小心倾斜井板，用 P1000 移液器去除周围的细胞培养基，从而改变细胞培养基。然后小心地加入新鲜的介质，沿着井壁移液。通常没有必要更改铸件中的介质，因为其体积小，并且存在移除球体的风险。

2. 与T细胞联合培养

1. 在适当的T细胞培养基（RPMI辅以10%胎儿血清和100单位/mL青霉素/链霉素）中，在75μL（35微井铸件）或190μL（81微井铸件）中重新增加所需的T细胞数量。
2. 首先通过倾斜井板，拆下使用 P1000 移液器的 agarose 铸件周围的细胞培养基。然后，用 P200 移液器轻轻瞄准播种室的一角，同时用另一只手保持井板倾斜，缓慢而小心地拆下铸件内的介质。
3. （关键步骤 1）由于存在去除球体的风险，因此通过比较去除介质之前和之后在去除介质之前和之后通过显微镜下以 10 倍放大率查看来控制球体的丢失。
4. 小心地将T细胞悬浮液滴入阿加罗斯铸件的种子室中，将P200移液器在铸件上方约0.5厘米。
5. （关键步骤 2）在添加 T 细胞时，存在冲出球体的风险。因此，添加T细胞非常缓慢，在播种室上方约0.5厘米至关重要。
   注:减少冲出球体数量的一个可能性是将移液器指向播种室的一角，同时添加 T 细胞，从而只会冒此角中球体被冲出的风险。
6. 小心地将井板放回细胞培养库（37°C，5%CO_2），15分钟。
7. 从培养箱中取出井板，在井壁上缓慢移液，在糖分周围加入新鲜细胞培养基（RPMI辅以10%胎儿牛血清和100个单位/mL青霉素/链霉素）。
8. 将井板放回细胞培养箱 48小时。

3. 将 3D 共培养嵌入 I 型胶原蛋白基质

1. 准备中和型 I 胶原蛋白
   1. 使用无血清基基介质 （RPMI） 稀释库存胶原蛋白，最终工作浓度为 3 mg/mL。每100μL稀释胶原蛋白，加入11μL的10x PBS和1.2μL 1 M氢氧化钠（NaOH）。
   2. 保持冰上和孵育（中和）1小时。
2. 首先通过倾斜井板，拆下使用 P1000 移液器的 agarose 铸件周围的细胞培养基。然后，缓慢而小心地拆下铸件内的介质，用 P200 移液器轻轻瞄准播种室的一角，同时用另一只手保持井板倾斜。
   注:在这里，完全去除阿加罗斯铸件周围的细胞培养基至关重要。
3. 小心移液中和胶原蛋白 I 混合滴入 agarose 铸造的种子室，通过按住 P200 移液器约 0.5 厘米以上的铸件。
4. 立即将井板放入细胞培养箱中 4 分钟（35 微井铸件）或 5 分钟（81 微井铸件）。
   注意:（关键步骤3）严格保持给定的孵育时间至关重要。否则，入侵行为可能无法重现。
5. 倒置井板，让它在培养箱中翻转1小时。
   注:由于表面张力，铸件将一直附着在井板底部。在使用血清浓度高的特殊细胞培养基（例如，RPMI辅以20%胎儿牛血清）的情况下，在井中去除培养基后可能需要使用1x PBS的额外洗涤步骤，以增加表面张力。
6. 把井板从培养箱里拿出来，倒回来。添加新鲜的细胞培养基（RPMI辅以10%的胎儿牛血清和100单位/mL青霉素/链霉素）周围，通过沿着井壁缓慢移液施铸的阿加罗斯。
7. 将井板放回细胞培养培养箱48小时。

4. 细胞毒性测定

1. 准备 3 mL 的 1x PBS 与 2% 胎儿牛血清每阿加罗斯铸造。
2. 共培养4天后，用P1000移液器将糖铸件周围的细胞培养基去除，用另一只手稍微倾斜井板。
   注:共同文化的总时间段由调查员决定。
3. 将 1 mL 的 1x PBS = 2% FBS 与 P1000 移液器分发到播种室中，将球体从微井中移出。
4. 在井中的体积中重复步骤 4.3 两次，将其转移到 15 mL 管中。
5. 在室温 （RT） 下以 300 x g 离心管 10 s。
6. 使用 P1000 移液器小心地拆下上流液。
7. 用 2% FBS 添加 1 mL 1x PBS，并在 RT 时以 300 x g 的离心机 1 分钟清洗细胞。
8. 重复清洗步骤（步骤 4.7）。
9. 去除上经剂并加入1 mL的细胞分离酶溶液（参见 材料表）。
10. 使用 P200 移液器和移液器上下，以分解细胞群集。
11. 在细胞培养箱中孵育细胞20分钟（37°C，5%CO₂）。
12. 重复步骤 4.10。
    注:将±10μL拿出来，在细胞培养皿上播种（在显微镜下放大10倍）球类在单个细胞中的分离程度。如有必要，再增加5分钟。
13. 加入4 mL的全细胞培养基（RPMI辅以10%的胎儿牛血清和100个单位/mL青霉素/链霉素），通过反转管3\u20124次混合。
14. 在 RT 以 400 x g 的离心机进行 4 分钟。
15. 去除上流剂，重新在FACS缓冲液中重新填充细胞，用于凋亡细胞的附生V染色。
    注:从这里开始，任何FACS染色和细胞分析都可以进行。

5. 用于 IHC 分切的羟基乙酰甲糖加工凝胶嵌入

注:在这里，避免使用低熔化的阿加罗斯来生成加糖铸件至关重要。

1. 在共培养结束时，首先通过倾斜井板，用 P1000 移液器去除带气糖铸件周围的细胞培养基。然后，用 P200 移液器轻轻瞄准播种室的一角，同时用另一只手保持井板倾斜，缓慢而小心地拆下铸件内的介质。
2. 通过轻轻瞄准播种室的一角，用P200移液器轻轻瞄准播种室的一角，先移液10%的正向。然后将 10% 的甲醛加入阿加罗斯铸件的外在，直到完全覆盖。将阿加罗斯铸件固定为 10% 正式，为 1d。
3. 第二天取出正式形式。
4. 小心移液器 210 μL （81 微井铸件） 或 100 μL （35 微井铸件） 预加热和液化羟基甲糖加工凝胶 （见 材料表） 通过按住 P200 移液器约 0.5 厘米以上的铸件滴入 agarose 铸件的种子室。
5. 让羟基甲糖加工凝胶在RT凝固10分钟。
6. 将加糖铸件转移到 1x PBS。
   注:对于更长的储存时间，将铸件嵌入 70% 乙醇中，以防止污染。
7. 通过乙醇系列（每系列1小时:70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇[每个3倍变化]）使凝胶部分脱水。然后在清除溶液中清除 3x，每次 1 小时（例如，脂肪烃 [例如，清土]或 Xylenes），然后手动或组织处理机中与熔融石蜡（每次 3x 为 1 小时）一起渗透。将铸件嵌入石蜡中，以便以每节 5 μm 的速度进行后续分节。
8. 将蜡放在西明中，每片3倍，每次3分钟，然后通过分级酒精系列补充水分组织部分:100%乙醇2分钟，95%乙醇1分钟，80%乙醇30秒，70%乙醇30秒，然后放入水中。
9. 在100°C的蔬菜蒸笼中进行热诱导表位检索20分钟，随后在10 mM柠檬酸钠pH 6.0溶液中进行20分钟的冷却，并阻止带_H2O₂的内源过氧化物。
10. 用正常目标血清阻断部分，并在夜间暴露在抗CD8抗体（稀释1/25）中。
11. 应用抗兔-HRP结合二次抗体（ 参见材料表），并使用3，3'-二苯胺（DAB）铬素进行染色。用 11% 哈里斯赤氧素溶液对抗核 （参见 材料表）。

6. 监测和分析共培养中的球类入侵

注:成像球体入侵胶原蛋白一矩阵的时间点将由研究者决定。使用放大倍率为 10 倍的倒置显微镜获取细胞培养图像。理想的时间点取决于要测试的单元系以及 ECM 部件。更多的侵入性细胞系将在加入胶原蛋白后几个小时内开始扩散到胶原蛋白中。由于共培养中的T细胞可能会阻止在非常早的时间点从球体出口的完整视图，因此通常图像是在0小时（作为参考）、24小时和48小时添加胶原蛋白后拍摄的。

1. 通过手动计算从球体和/或使用图像分析软件（例如图像 J）显示的"尖峰"数量来量化侵入性。
   1. 通过手动计算球体的"尖峰"数，将入侵分析为球体的"尖峰"数量。
      注:由调查员决定，球体的突起被视为"尖峰"。决策标准可能是从球体边缘测量的"尖峰"的长度。
   2. 分析入侵作为入侵区相对于球体的大小。
      1. 使用 手绘工具（ 图 J）跟踪总面积的边框（入侵 + 球体区域）。
      2. 单击 顶部 菜单中的"分析"，然后单击 "测量 "以显示区域测量值。
      3. 跟踪总球体区域的边框。
      4. 单击 顶部 菜单中的"分析"，然后单击 "测量 "以显示区域测量值。
      5. 将测量结果列表复制到电子表格中，并使用公式计算总入侵/球体:总入侵 = 总面积/球体面积。

7. 免疫荧光染色

1. 准备以下内容。
   1. 使用 2.3 mL 的 1x PBS 和 2.7 mL 的 10% 正式素准备 5.4% 的甲醛 （5 mL）。
   2. 使用 50 mL 的 1x PBS 和 2.5 mL 的 10% Octoxynol（储存在 RT）准备 0.5% Octoxynol （50 mL）。
   3. 使用 200 mL 的 1x PBS、200 毫克牛血清白蛋白 （BSA）、4 mL 的 10% 八氧醇、1 mL 的 10% 多糖酸酯 20（使用前预热至 RT;在 4 °C 下过滤和储存）准备 IF 缓冲液 （200 mL）。
   4. 使用 5 mL IF 缓冲液和 500 μL 山羊血清（使用前预热至 RT）准备阻解溶液 （5 mL）。
   5. 保持 8 孔室滑轨、玻璃盖玻片和安装介质准备就绪。
2. 第 0 天
   1. 修复整个阿加罗斯铸造， 包括球体， 在 5.4% 正式在 RT 在加湿室过夜。
3. 第 1 天
   1. 通过倾斜井板，拆下用 P1000 移液器在 agarose 铸件周围的细胞培养基。
   2. 将胶原蛋白贴片转移到8井室幻灯片中，用圆滑的尖尖钳抓住阿加罗斯铸件内胶原蛋白基质的一角，在一次自信的动作中将其从阿加罗斯铸件上剥下来。
      注:胶原蛋白贴片应容易与阿加罗斯铸件分离。否则，使用 P1000 移液器在播种室区域中小心地添加培养基，或反转黄玫瑰铸件，轻轻摇动井板以移出胶原蛋白基质。
   3. 每口井加入250μL 0.5%的八氧醇 （见材料表）。在 Rt 孵育 1 小时。
   4. 吸气八氧醇，每井添加250μL的阻尼溶液。在 Rt 时阻止 1 小时。
   5. 同时，稀释原抗体（抗角蛋白稀释8:1/500;法罗丁 546: 1/200;在阻解溶液中，铲:1/1000），计算每孔250μL。
   6. 在阻断溶液中加入原抗体，并将腔室幻灯片放在加湿室中，在RT进行过夜孵育。
4. 第2天
   1. 通过吸气去除阻断溶液中的原抗体。
   2. 通过添加 300 μL 的 IF 缓冲液进行洗涤 3 次，让它在 RT 上坐 5 分钟。
      注:就让它坐下吧，没有必要把它放在摇床上。
   3. 稀释阻断溶液中的二级抗体（用于抗角蛋白8:抗大鼠，稀释1/500）。
   4. 将250μL的二次抗体加入每个井的阻断溶液中，并在RT下孵育1小时。从这里开始，保护样品免受光线的光。
   5. 通过吸气去除阻断溶液中的二级抗体。
   6. 通过添加 300 μL 的 IF 缓冲液洗涤 3 次，让它在 RT 上坐 5 分钟。
   7. 用 1x PBS 冲洗样品并吸气。
   8. 小心地拆下腔室滑轨的墙壁，以便仅保留底部的玻璃滑梯。
   9. 将至少 200 μL 的安装介质添加到玻璃盖玻片中，然后慢慢将盖玻片滴在样品上。
      注:避免产生气泡，因为这会影响图像质量。可以通过以 45° 角轻轻将盖滑放在幻灯片的长边上或缓慢降低幻灯片上的盖滑来防止气泡。
   10. 将安装的样品放在黑暗干燥的地方，让它过夜。成像可以在第二天执行。
       注:盖玻片最初可能会移动一点，一旦放置在胶原蛋白补丁。让玻璃滑梯在均匀区域坐上几分钟。盖玻片将平展样品，以便玻璃滑梯和盖玻片之间不会随着时间的推移留下间隙。

8. 从胶原蛋白基质中分离细胞

1. 准备以下内容。
   1. 在含血清细胞培养基中准备 1 mg/mL 胶原酶 4（在 -20 °C 下储存等分泌胶原酶 4 稀释）
   2. 在 1x PBS 中准备 2.5% BSA，并用它涂覆所有管和移液器尖端（使用前过滤 BSA 溶液）。
   3. 使用前预热 BSA 解决方案和细胞培养基。
2. 准备2 mL的胶原酶4溶液（1毫克/mL），以消化从35微井阿加罗斯铸件中最多消化三个胶原蛋白基质。
3. 将多达三个 75 μL 胶原蛋白基质从 35 微井阿加罗斯铸件转移到 2.5% BSA 预涂层 15 mL 管中。用圆滑的尖尖钳子抓住阿加罗斯铸件播种室中胶原蛋白基质的一角，并在一次自信的动作中把它从阿加罗斯铸件上剥下来。
4. 用剪刀切开 P1000 尖端的尖端。用 2.5% BSA 预涂剩余尖端，通过上下移液尽可能分解胶原蛋白基质。在37°C下孵育管子15分钟。
5. （关键步骤 4）每5分钟检查胶原蛋白基质是否溶解。在将10μL的样品拿出来并播种到细胞培养皿上，以10倍的放大倍率在显微镜下观察之前，再上下移液。如有必要，再添加 5 分钟。
6. 用10 mL的预暖细胞培养基（DMEM辅以10%的胎儿牛血清）填充管子。通过反转管 3\u20124 次轻轻混合。
7. 在RT下以400 x g离心 管4分钟。
8. 小心地取出上一液，留下 2 mL 的体积。
9. （关键步骤 5）在第一个离心步骤后离开2 mL，因为在携带细胞的管子底部可能仍有未溶解的胶原蛋白。
10. 每次加入10 mL的含血清细胞培养培养，执行两个洗涤步骤。每次以 400 x g 的离心机 在 RT 中 4 分钟。
11. 最后一次洗涤步骤后，取出尽可能多的介质，只留下细胞颗粒。
12. 将细胞颗粒重新在1 mL的细胞分离酶溶液中（见 材料表）。
13. 使用 P200 移液器和移液器上下，以分解细胞群集。
14. 在细胞培养箱中孵育细胞20分钟（37°C，5%CO₂）。
15. 重复步骤 8.13。
    注:将±10μL拿出来，在细胞培养皿上播种，在显微镜下以10倍的放大倍率观察，查看球体分离成单个细胞的程度。如有必要，再增加5分钟。
16. 加入4 mL的细胞培养基（DMEM辅以10%的胎儿牛血清），通过倒置管3\u20124次混合。
17. 在 RT 以 400 x g 的离心机进行 4 分钟。
18. 拆下上一液。从这里开始，可以进行FACS染色或细胞培养。

9. 从胶原蛋白基质中提取RNA

1. 用苯酚（见材料表），100%氯Table of Materials仿，70%无RNase乙醇，RNA提取试剂盒（见材料表），无无无无无苯二甲酸酯1.5 mL管，无RNase 15 mL管和无RNase ddH₂O。
2. 将多达 12 个 190 μL 胶原蛋白基质从 81 微井阿加罗斯铸件转移到 15 mL 管中。用圆滑的尖尖钳子抓住阿加罗斯铸件播种室中胶原蛋白基质的一角，并在一次自信的动作中把它从阿加罗斯铸件上剥下来。
   注:基质也可以在-80°C下冷冻，直到准备好提取RNA。
3. 在15 mL管中的胶原蛋白基质中加入1 mL硫化铀与苯酚（见材料表）。 Table of Materials
   注:含有苯酚的硫化铀必须完全覆盖胶原蛋白基质。
4. 旋转管10\u20120 s。
5. 使用 20 G 针头和 5 mL 注射器使基质均匀，直到它们完全溶解。
6. 让矩阵在 RT 中坐 5 分钟。
7. 在基质中加入200μL的纯氯仿，并大力摇动管体15 s。
8. 立即将混合物转移到 1.5 mL 管中。
9. 让混合在RT中坐至少5分钟，直到相位分离。
10. 在 4 °C 下以 12，000 x g 将 1.5 mL 管 离心 15 分钟。
11. 用 500 μL 的 70% 乙醇填充新的 1.5 mL 管。
    注:取决于离心后水相的体积（见步骤9.12。这可能不是500μL。70% 乙醇的量应等于水相的体积。
12. 小心地将离心样品的上水相转移到 70% 充满乙醇的管中，然后通过上下移液彻底混合。
13. （关键步骤 6）在去除上相时，注意不要干扰硫化铀底部的层与苯酚分离，因为这将污染RNA。
14. 将样品添加到RNA提取列（包含在RNA提取试剂盒中， 参见材料表）。从这里开始，按照制造商的RNA从细胞纯化的协议。

结果

3D共培养模型允许图1A所示的不同测定，可以根据需要进行组合或修改。在我们建立的实验装置中，肿瘤和T细胞共同培养2天，然后开始进行入侵测定，以选择侵入性和/或耐药肿瘤细胞（图1B）。第4天进行入侵的定量，从胶原蛋白基质中分离"幸存者"细胞，或直接处理^{RNA 23}或从基质中提取DNA（图1B）。将 3D 培养基?...

讨论

此处介绍的方法描述了3D肿瘤球类生成，它允许与T细胞、基于细胞的功能和分子分析以及使用单一设备进行各种监测和分析的可能性进行共培养。我们方法的主要优点是，它不需要将 3D 区域性转移到单独的检测中，并在整个检测过程中保持 3D 培养的完整性。

此处显示的工作流可以根据需要进行修改。球体形成、T细胞共培养或细胞毒性测定的孵育时间可能需要根据不同的实?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols