3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

要約

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。

要約

多くの癌は治療に耐性を持ち続けているが、免疫療法による癌の治療には大きな進歩が見られた。アッセイの限られた数は、腫瘍と免疫細胞の相互作用に直接監視し、機械化的な洞察を可能にし、その中で、T細胞は、癌細胞に対する適応免疫系の細胞傷害応答を実行する上で重要な役割を果たす。ほとんどのアッセイは、使用の相対的な容易さによる細胞の2次元(2D)共培養に基づいていますが、癌細胞の特徴の1つである侵襲的な成長表現型の表現は限られています。現在の3次元(3D)共培養システムは、特別な装置または共培養癌細胞の侵入と相互作用T細胞のための別々の監視を必要とします。

ここでは、共培養における癌細胞スフェロイドとT細胞細胞毒性の3Dにおける侵襲的挙動を同時にモニタリングするアプローチについて述べている。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマイクロウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって駆動される。T細胞共培養および癌細胞の両方のI型コラーゲンマトリックスへの浸潤は、アガロースキャストのマイクロウェル内で細胞を転移することなく行われ、アッセイ全体で無傷の3D共培養システムを維持する。コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから分離することができ、免疫蛍光(IF)染色および細胞の共焦点イメージングを可能にする。また、細胞は、さらなる増殖のために単離したり、遺伝子発現や蛍光活性化細胞選別(FACS)などの分析を行ったりすることができる。最後に、3D共培養は、埋め込みおよび切除後の免疫検査(IHC)によって分析することができる。アッセイの可能な修飾は、細胞外マトリックス(ECM)の変質された組成物だけでなく、癌細胞と異なる間質または免疫細胞を含めることが含まれる。

概要

過去10年間のがん免疫療法の大幅な改善にもかかわらず、治療に対する感受性と耐性に関する私たちの機械学的理解はまだかなり貧弱^です。腫瘍が実質的な不均一性を示し、腫瘍細胞とそれらの微小環境および免疫細胞との動的相互作用が、腫瘍細胞死に影響を与え、免疫療法^{11、2、32,3}を含む治療に対する侵襲的な行動および応答を示すことが十分に確立されている。適応免疫系の一つの腕として、T細胞は細胞特異的細胞毒性を実行する。T細胞認識とがん細胞への応答の分析は、免疫調節治療に対する耐性と感受性に関する機械的な洞察を提供します。

適切な環境におけるがんとT細胞の相互作用をインビトロでモデル化し、モニタリングすることは困難であり、これまでのところ、限られた機械主義的な洞察をもたらしました。ほとんどの細胞ベースのアッセイは、生体^,内生理学⁴4、5、6、すなわち空間細胞相互作用、細胞外マトリックス(ECM)7との接触^、5動的代謝需要、質量増殖^による低酸素増加8、および微小微生物(TME)の微小環境(9ME)の影響による増大する3次元(3D)を再現するために重要な重要な特徴を欠く2次元(2D)環境に依存している。⁶⁷⁹一方、現在使用されている3次元(3D)共培養と侵略アッセイシステムには、まだ多くの欠点があります:(1)スフェロイド生成と^,収穫^{5、10、(2)10}スフェロイド⁵サイズの制御の欠如の時間を消費する性質、 形状および細胞密度^{11、12、(3)12}低スループット型アッセイは、(4)特殊機器^{13、14、(5)}異なるアッセイ^{111415、16、17,16}に対する異なる環境に共培養を移す必要性を要求する。^,17特に、共培養アッセイの転移は、しばしばスフェロイドの破壊および共培養完全性の喪失をもたらす。これは、細胞-細胞接着が減少した「緩い」スフェロイドに特に当てはまります。例えば、ほとんどの3Dの侵略アッセイは、スフェロイドが最初の形成後に収穫され^{、ECM 14、15、1615,16}で再中断されることを要求する。¹⁴このリサスペンションステップは、回転楕円体間の距離に対する制御の損失をもたらす。腫瘍スフェロイド間の距離は侵襲的な挙動に影響を与えるので、この制御の喪失は高いアッセイ間分散を導入し、再現性を低下させる。さらに、末梢および腫瘍スフェロイド浸潤免疫細胞の評価のための連続した遠心分離工程による細胞分画アッセイの適用は、より安定したスフェロイド¹⁷を生成する腫瘍細胞集団に限定される。

コンセプトとアプローチ

当社のアプローチでは、上記の不具合に対して、後述のアッセイ用に回転楕円体の移動を必要としない「オールインワン」3Dスフェロイド共培養モデルを使用して対処しています。我々は、スフェロイド形成装置( 材料表を参照)を適応させ、同時に癌細胞の侵襲的挙動と共培養T細胞の細胞傷害性をモニタリングするためのアッセイを生成した。この方法はユーザーフレンドリーで安価で、比較的高スループットの3D設定で迅速かつ容易に処理できます。使用される装置のタイプに依存して、最大81の大きい均一サイズのスフェロイドは、播種された細胞の数を変更することによって個々のスフェロイドサイズを制御して単一のピペットステップで生成することができる。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマルチウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって強制される。この3Dシステムは、動的細胞ベースの機能研究と、蛍光活性化細胞選別(FACS)、免疫蛍光(IF)または免疫組織化学(IHC)染色、無傷の3D共培養の遺伝子発現解析を含むエンドポイント分子および生化学的アッセイに適応させた。

機能研究のために、アガロースキャスト内のI型コラーゲンにスフェロイドを埋め込むと、等距離のスフェロイドからの癌細胞の浸潤を生じ、単一細胞対集団細胞移動^18、19,19などの必須細胞株特異的特徴をモニタリングすることを可能にする。さらに、コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから容易に分離され、複数のスフェロイドを含む1\u20122 mmの厚さのパッチをもたらし、共焦点顕微鏡によるIF染色およびイメージングのためにさらに処理することができる。これにより、ハイスループットスクリーニングで細胞浸潤と細胞マトリックス相互作用が明確に明らかになります。また、コラーゲンマトリックス中の細胞は、コラーゲン消化後に単一細胞解離後に分離して、その後の細胞培養または分析を行うことができる。

スフェロイドのIHC分析では、アガロースキャストの固定および切除後、タンパク質または関心のある他の分子が、スフェロイドの地理的位置を維持しながら検出可能である。ここで説明するアプローチでは、スフェロイドはアガロースキャスト内のHydroxyethylアガロース処理ゲルに直接埋め込まれ、ゲルはマイクロウェルの底部にスフェロイドを保持する「蓋」として機能する。アガロースキャスト²⁰のパラフィン埋め込み後、連続横切りは、キャストの底部を出発点として行う。

このアプローチは、Hydroxyethylアガロース処理ゲル²¹ に埋め込む前に細胞の収穫を必要とするスフェロイドの従来のIHC断面とは対照的であり、このように細胞の空間配置を失うスフェロイドの破壊を招くリスクがある。また、腫瘍スフェロイド¹⁷ に浸潤した免疫細胞または末梢のいずれに免疫細胞が直接埋め込まれるのかを評価するための遠心分離による細胞分画は、直接埋め込むことによって回避される。

さらに、3D共培養は、腫瘍、間質または免疫細胞を付着させることによって行うことができる、そしてこのように腫瘍細胞クロストークを研究するか、または内皮細胞¹⁶との共培養を含む細胞間相互作用を分析するための異なる腫瘍微小環境を再現する。

この3Dスフェロイド共培養設定は、腫瘍微小環境に存在する異なる細胞タイプの共培養を行い、改変されたECM要素の効果を評価するために使用することができる。I型コラーゲン以外にも、他のECM成分(例えば、マトリゲル、マトリゲル/コラーゲン混合物、フィブロネクチン)は、腫瘍細胞浸潤が異なる基質²²の存在によって影響を受けるので使用することができる。また、アガロースキャストのマイクロウェルは、一次細胞株のスフェロイド形成および低細胞接着を有する細胞に適している。

プロトコル

プロトコル全体で頻繁に使用される単語の一覧と説明は 、補足ファイル 1にあります。

1. スフェロイドの生成

1. 1x PBS(例えば、1gのアガロース1x PBSの50 mL)およびオートクレーブ35マイクロウェルゴム型で2%アガロースを調製し、オートクレーブ。
   注意:IHC処理用のアガロースキャストを生成するために低融解アガロースを使用しないでください。
2. アガロースキャストを準備する
   注:35マイクロウェルキャストは、浸潤、免疫蛍光(IF)および細胞分離アッセイに使用されます。81マイクロウェルキャストは、細胞毒性、免疫細胞化学(IHC)、細胞分離およびRNA抽出アッセイに使用されます。
   1. アガロースをオートクレーブした後、溶融アガロースを約60\u201270°Cに冷却させる。 細胞培養フードでは、無菌技術と500μLの溶融アガロースをウェルあたり81マイクロウェルゴム型または330μLに使用し、ウェルあたり35マイクロウェルゴム型にします。
      注意:アガロースを混合またはピペット化しながら、泡を作成しないでください。そっとピペットして泡を取り除きます。
   2. アガロースが固まった後、ゴムの金型を慎重にフレックスして、そこからヒスを取り除きます。ここに、適切なウェルプレートの上に手を置き、アガロースキャストをウェルプレートの1つの井戸に右に落とします。
      メモ:オーバーフレックスを避けるために、異なる位置でゴム金型をフレックスします。ゴム型を曲げて、下から軽く押し込むのも便利です。
   3. アガロースキャストを平衡化するには、10%のウシ胎児血清(12ウェルプレートの場合は2.5mL/well、24ウェルプレートの場合は1mL/well)を添加したDMEMからなる細胞培養培地を添加する。細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)にウェルプレートを入₂れ、1時間インキュベートします。
3. 一方、播種のための細胞培養を準備する。
   注:アガロースキャスト当たりの総細胞播種数は、調査官によって決定される予定です。マウス原発性膵臓癌細胞株の場合、35,000細胞/35マイクロウェルキャストと81,000細胞/81マイクロウェルキャスト(平均1000細胞/スフェロイド)が次のすべてのアッセイに播種されます。スフェロイドの平均直径は、48時間後に約150\u2012200 μmです。
4. まず、ウェルプレートを傾けてP1000ピペットで鋳造したアガロースを取り巻く細胞培養培地を除去する。次に、慎重に播種室内の培地を除去します。
5. 調製した腫瘍細胞懸濁液を細胞の播種室に慎重に播種します。よくプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に15分間₂慎重に戻します。
   注:このステップの間、細胞はアガロースキャストのマイクロウェルに落ち着きます。
6. アガロースキャストの外側に培地を追加します(12ウェルプレートの場合は2.5mL/well、24ウェルプレートの場合は1mL/well)。
7. ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に48₂時間戻します。
   注:通常、細胞がマイクロウェル内にスフェロイドを形成するのに数時間かかります。一般に、固形腫瘍細胞スフェロイドは24時間後に形成され、48時間後に安定である。ただし、これはセルラインによって異なる場合があります。必要に応じて、アガロースキャストでウェルプレートを慎重に傾け、P1000ピペットで周囲の細胞培養培地を除去することにより、細胞培養培地を変更する。その後、慎重に井戸の壁に沿ってそれをピペットによって新鮮な媒体を追加します。通常、小さなボリュームとスフェロイドを除去するリスクのために、キャスト内のメディアを変更する必要はありません。

2. T細胞との共培養

1. 必要な数のT細胞を75μL(35マイクロウェルキャスト)または適切なT細胞培養培地の190 μL(81マイクロウェルキャスト)で再中断します(RPMIは10%の胎児ウシ血清と100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補充)。
2. まず、ウェルプレートを傾けてP1000ピペットでキャストしたアガロースを取り巻く細胞培養培地を取り除きます。その後、P200ピペットでシードチャンバーの一角をそっとターゲットにし、もう一方の手でプレートを傾け続けることで、キャスト内の媒体をゆっくりと慎重に取り除きます。
3. (重要なステップ1)スフェロイドを除去するリスクがあるので、マイクロウェル内のスフェロイドの数を顕微鏡で見て10倍の拡大で観察して除去する前後のスフェロイドの数を比較することにより、スフェロイドの損失をコントロールする。
4. P200ピペットを約0.5cm上に保持して、T細胞懸濁液を慎重にアガロースキャストの播種室に滴下します。
5. (重大なステップ 2)T細胞を加えながら回転楕円体を洗い流す危険性があります。したがって、T細胞を非常にゆっくりと、そして約0.5cmの播種チャンバー上に加えるのが重要です。
   注:洗い流された回転楕円体の数を減らす可能性の1つは、T細胞を追加しながらピペットをシーディングチャンバーの片隅に向けることで、このコーナーのスフェロイドを洗い流す危険性があります。
6. よくプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に15分間₂慎重に戻します。
7. インキュベーターからよくプレートを取り出し、新鮮な細胞培養培地(RPMIは10%のウシ血清と100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補充)を加え、ウェルの壁に沿ってゆっくりとピペット化してアガロースキャストを投げます。
8. ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに 48時間戻します。

3. 3D共培養をI型コラーゲンマトリックスに埋め込む

1. 中和型I型コラーゲンを用意する
   1. ストックコラーゲンを無血清ベース培地(RPMI)で希釈し、最終的な作業濃度を3mg/mLにします。希釈したコラーゲン100μLごとに、10x PBSの11μLと1.2 μL 1 M水酸化ナトリウム(NaOH)を加えます。
   2. 氷の上に置き、1時間インキュベート(中和)します。
2. まず、ウェルプレートを傾けてP1000ピペットでキャストしたアガロースを取り巻く細胞培養培地を取り除きます。その後、P200ピペットでシードチャンバーの一角をそっと向け、もう一方の手でプレートを傾け続けることで、キャスト内の媒体をゆっくりと慎重に取り除きます。
   注:ここでは、アガロースキャストを取り巻く細胞培養培地を完全に除去することが重要です。
3. 慎重に中和したコラーゲンをp200ピペットを約0.5cm上に保持することにより、アガロースキャストの播種室にドロップワイズミックスします。
4. ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに4分間(35マイクロウェルキャスト)または5分間(81マイクロウェルキャスト)します。
   注意:(重大なステップ3)厳密に与えられた潜伏時間に保つことが重要です。そうしないと、侵襲的な動作が再現できない可能性があります。
5. ウェルプレートを反転し、インキュベーターで1時間反転したままにします。
   注:キャストは表面張力のためにウェルプレートの底部に取り付けられたままになります。血清濃度の高い特殊細胞培養培地(例えば、20%ウシ胎児血清を添加したRPMI)が用いられる場合には、培地を除去した後に1xPBSを用いて追加の洗浄工程を行い、表面張力を高める必要がある場合がある。
6. インキュベーターから井戸板を取り出し、それを反転させます。新鮮な細胞培養培地(RPMIは10%のウシ血清と100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補充)を加え、ウェルの壁に沿ってゆっくりとピペット化して投下したアガロースの周りに投下した。
7. ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻します。

4. 細胞毒性アッセイ

1. アガロースキャストあたり2%のウシ胎児血清で1x PBSの3 mLを調製します。
2. 4dの共培養後、他方の手でウェルプレートを少し傾けることでP1000ピペットで鋳造したアガロースを取り巻く細胞培養培地を除去する。
   注:共同文化の合計期間は、調査官によって決定される予定です。
3. P1000ピペットを用いた1mLのPBS + 2%FBSをシーディングチャンバーに分配し、マイクロウェルからスフェロイドを取り除きます。
4. ウェル内のボリュームでステップ4.3を2回繰り返し、15 mLチューブに移します。
5. 室温(RT)で10 sのための300 x g でチューブを遠心分離します。
6. P1000ピペットで上清を慎重に取り除きます。
7. 2%FBSで1mLの1mLを加え、遠心分離機を300xgでg1mlRTで1分間洗浄します。
8. 洗浄工程を繰り返します(ステップ4.7)。
9. 上清を取り除き、細胞解離酵素溶液を1 mL加える( 資料表を参照)。
10. P200ピペットとピペットを上下に使用して、細胞クラスターを分解します。
11. 細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で細胞を20分間インキュベート₂する。
12. ステップ 4.10 を繰り返します。
    注:約10 μLを取り出し、細胞培養皿に種を入れて(顕微鏡下で10倍の倍率で)単一細胞でスフェロイドが解離した状態を観察します。必要に応じて、さらに5分のインキュベーションを加えます。
13. 4 mLの完全な細胞培養培地(RPMIは10%のウシ血清と100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補充)を加え、チューブを3\u20124回反転して混合します。
14. 遠心分離機は400 x g で4分間RTで。
15. 上清を除去し、アカトーシス細胞のアネキシンV染色のためのFACSバッファー内の細胞を再懸濁します。
    注: ここから、FACS 染色と細胞解析を行うことができます。

5. IHC断面用ハイドロキジエチルアガロース処理ゲル埋め込み

注:ここでは、アガロースキャストを生成するために低融解アガロースを使用しないようにすることが重要です。

1. 共培養の終了時に、まず、ウェルプレートを傾けてP1000ピペットを用いて鋳造したアガロースを取り巻く細胞培養培地を除去する。その後、P200ピペットでシードチャンバーの一角をそっとターゲットにし、もう一方の手でプレートを傾け続けることで、キャスト内の媒体をゆっくりと慎重に取り除きます。
2. P200ピペットでシードチャンバーの一角をそっとターゲットにして、シードチャンバーで最初にピペット10%ホルマリンをゆっくりとピペット。その後、完全に覆われるまでアガロースキャストの外側に10%ホルマリンを加えます。アガロースキャストを10%ホルマリンに1dで固定します。
3. 翌日にホルマリンを取り外します。
4. 慎重にピペット210 μL(81マイクロウェルキャスト)または100 μL(35マイクロウェルキャスト)前温めおよび液化ヒドロキセチルアガロース処理ゲル( 材料表を参照)は、P200ピペットを約0.5cm上に保持することによってアガロースキャストの播種チャンバーにドロップする。
5. ハイドロキジエチルアガロース処理ゲルをRTで10分間固めます。
6. アガロースキャストを1x PBSに移します。
   注:より長い保管のために、汚染を防ぐために70%エタノールに鋳造物を埋め込みます。
7. エタノール系列を通してゲル切片を脱水する(各1時間:エタノール70%、エタノール80%、エタノール95%、100%エタノール[3xはそれぞれ変化])。次いで、それぞれ1時間の透明溶液3x(例えば、脂肪族炭化水素(例えば、クリアアイト)、またはキシレン)に透明化し、溶融パラフィン(3x×それぞれ1時間)を浸潤し、手動または組織加工器に浸潤する。パーセクションあたり5 μmで後段に切り分けるためのパラフィンワックスにキャストを埋め込みます。
8. キシレンにスライドを入れてワックスを取り除き、それぞれ3分間3倍の部分を除去し、等級アルコールシリーズを通して組織切片を水分補給します:2分間100%エタノール、1分間のエタノール95%、30sのエタノール80%、30sの70%エタノールを水に入れ、水に入れます。
9. 100°Cの植物蒸し器で20分間熱誘起エピトープ検索を行い、続いて10mMクエン酸ナトリウムpH 6.0溶液で20分間冷却し_、H2O2で内因性ペルオキシダーゼをブロック₂した。
10. 正常なゴール血清でセクションをブロックし、抗CD8抗体(希釈1/25)に一晩にさらす。
11. 抗ウサギHRPコンジュゲート二次抗体( 材料表を参照)を適用し、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)クロマジェンを使用して染色を開発します。11%ハリスヘマトキシリン溶液を有する対ステイン核( 材料表を参照)。

6. 共培養におけるスフェロイドの侵入のモニタリングと分析

注:コラーゲンIマトリックスへのスフェロイド浸潤の撮影時間は、研究者によって決定される予定です。10倍の倍率で反転した顕微鏡を用いて細胞培養画像を取得します。理想的なタイムポイントは、ECM コンポーネントと同様に、テストされるセルラインに依存します。より侵襲的な細胞株は、コラーゲンを添加してから数時間以内にコラーゲンに広がり始めます。共培養中のT細胞は、非常に早い時点でスフェロイドからの出口の全景を妨げる可能性があるため、一般的に画像はコラーゲンを添加した後に0h(基準として)、24時間および48時間で撮影される。

1. 回転楕円体から出てくる「スパイク」の数を手動で数えたり、画像解析ソフトウェア(例えば画像J)を使用して侵襲性を定量化する。
   1. スフェロイドの「スパイク」の数を手動で数えることによって、スフェロイドからの「スパイク」の数として侵入を分析します。
      注:これは、研究者によって決定されるスフェロイドからの突起は「スパイク」と見なされます。決定基準は、回転楕円体のエッジから測定される「スパイク」の長さである可能性があります。
   2. 回転楕円体の大きさに対する侵入領域として侵入を分析します。
      1. フリーハンド描画ツール(イメージJ)を使用して、全領域の境界(浸潤+回転楕円体領域)をトレースします。
      2. トップメニューの [分析 ]をクリックし、[ 測定 ]をクリックして面積の計測値を表示します。
      3. 全体の回転楕円体領域の境界をトレースします。
      4. トップメニューの [分析 ]をクリックし、[ 測定 ]をクリックして面積の計測値を表示します。
      5. 測定結果リストをスプレッドシートにコピーし、合計浸潤 =総面積/回転楕円体領域を使用して、合計の浸潤/回転楕円体を計算します。

7. 免疫蛍光染色

1. 以下の準備をします。
   1. 5.4%ホルマリン(5 mL)を1.3 mLの1x PBSと10%ホルマリンの2.7 mLで準備します。
   2. 1x PBSの50 mLと10%オクトキシノール(RTで保存)の2.5 mLを使用して0.5%オクトキシノール(50 mL)を準備してください。
   3. IFバッファー(200 mL)を1x PBS、200mgのウシ血清アルブミン(BSA)、10%オクトキシノールの4 mL、1mLの10%のポリソルベート20(使用前にRTまでウォームアップ;4°Cでフィルターして保存する)を使用して準備します。
   4. 5 mL IF バッファーと 500 μL のヤギ血清 (使用前に RT までウォームアップ) を使用してブロッキング溶液 (5 mL) を準備します。
   5. 8ウェルチャンバースライド、ガラスカバーリップ、および取り付けメディアを準備してください。
2. 0日目
   1. スフェロイドを含むアガロースキャスト全体を、加湿チャンバーのRTで一晩5.4%ホルマリンで固定します。
3. 1日目
   1. P1000ピペットでキャストしたアガロースを取り巻く細胞培養培地を、ウェルプレートに傾けて除去する。
   2. アガロースキャストの播種室内のコラーゲンマトリックスの隅をつかみ、洗練された尖った先端ピンセットでコラーゲンマトリックスの隅をつかんで、コラーゲンパッチを8ウェルチャンバースライドに移し、単一の自信に満ちた動きでアガロースキャストを剥がします。
      注:コラーゲンパッチは、アガロースキャストから簡単に分離する必要があります。それ以外の場合は、P1000ピペットを使用して、播種チャンバーの領域に慎重に培養液を添加するか、アガロースキャストを反転させ、ウェルプレートを穏やかに振ってコラーゲンマトリックスを取り除きます。
   3. 250 μL の 0.5% オクトキシノール ( 材料表を参照) をウェルごとに追加します。RTで1時間インキュベートします。
   4. オクトキシノールを吸引し、1ウェルあたり250 μLのブロッキング溶液を加えます。RTで1時間ブロックします。
   5. 一方、一次抗体を希釈する(抗ケラチンの希釈 8:1/500;ファロイジン 546: 1/200;Hoechst:1/1000)ブロッキング溶液で、ウェルあたり250 μLを計算します。
   6. ブロッキング溶液に一次抗体を加え、チャンバースライドを加湿チャンバーに入れ、RTで一晩インキュベーションします。
4. 2日目
   1. 吸引することによりブロッキング溶液中の一次抗体を除去する。
   2. 300 μLのIFバッファを加えて3回洗浄し、RTで5分間座らせます。
      注:ただ座らせて、シェーカーの上に置く必要はありません。
   3. 二次抗体をブロッキング溶液で希釈する(抗ケラチン8:抗ラット、希釈1/500)。
   4. ブロッキング溶液に250μLの二次抗体を各ウェルに加え、RTで1時間インキュベートします。ここから、光からサンプルを保護します。
   5. 発汗によりブロッキング溶液中の二次抗体を除去する。
   6. 300 μLのIFバッファを加えて3回洗浄し、RTで5分間座らせます。
   7. 1x PBSでサンプルをすすいで吸引します。
   8. 下部のガラススライドだけが残るように、チャンバースライドの壁を慎重に取り外します。
   9. 取り付け用メディアを少なくとも200μL増し、サンプルの上にゆっくりとカバースリップを落とします。
      注: イメージの品質に影響を与えるため、バブルの作成は避けてください。気泡は、スライドの長い端にカバースリップを45°の角度でゆっくりと下げること、またはスライドのカバースリップをゆっくりと下げることによって防止できます。
   10. 取り付けられたサンプルを暗くて乾燥した場所に置き、一晩座らせます。イメージングは翌日に行うことができます。
       注:カバースリップは、最初はコラーゲンパッチの上に置かれると少しシフトする可能性があります。ガラスのスライドを数分間均等な領域に置きます。カバースリップは、時間の経過とともにガラススライドとカバースリップの間にギャップが残らないようにサンプルを平らにします。

8. コラーゲンマトリックスからの細胞の分離

1. 以下の準備をします。
   1. 血清含有細胞培養培地に1mg/mLコラゲナーゼ4を調製(-20°Cで4希釈したジロゲナーゼ4を保存)
   2. 1x PBSで2.5%BSAを準備し、それを用いてすべてのチューブとピペットの先端をコーティングします(使用前にBSA溶液をフィルター)。
   3. BSA溶液および細胞培養培地を使用前に予熱する。
2. コラゲラーゼ4溶液(1mg/mL)2 mLを調製し、35マイクロウェルアガロースキャストから最大3つのコラーゲンマトリックスを消化します。
3. 35マイクロウェルアガロースキャストから最大3つの75 μLコラーゲンマトリックスを2.5%BSAプレコーティング15 mLチューブに移します。なめらかな尖った先端ピンセットで投げられたアガロースキャストの播種室内のコラーゲンマトリックスの角をつかみ、単一の自信に満ちた動きでアガロースキャストを剥がします。
4. P1000チップの先端をはさみでベベルカットします。残りの先端を2.5%BSAでプレコートし、上下にピペットを作ってコラーゲンマトリックスを可能な限り分解します。37°Cで15分間チューブをインキュベートします。
5. (重大なステップ4)5分ごとに、コラーゲンマトリックスが溶けているかどうかを確認します。ピペットは、サンプルの10 μLを取り出す前に再び上下にして、10倍の倍率で顕微鏡下で観察するための細胞培養皿に播種します。必要に応じてさらに5分を追加します。
6. チューブを10 mLの前温め細胞培養培地(DMEMは10%のウシ血清で補う)で満たします。チューブを3\u20124回反転して軽く混ぜます。
7. チューブを400 x g で4分間RTで遠心します。
8. 上清を慎重に取り出し、2mLのボリュームを残します。
9. (重大なステップ5)最初の遠心分離ステップの後に2 mLを残して、それらに沿って細胞を運ぶチューブの下部に未溶解コラーゲンがまだある可能性があります。
10. 血清含有細胞培養液を毎回10mL添加して2つの洗浄工程を行う。遠心分離機はRTで4分間400 x g で毎回。
11. 最後の洗浄ステップの後、できるだけ多くの培地を取り除き、細胞ペレットだけを残します。
12. 細胞ペレットを1 mLの細胞解離酵素溶液に再懸濁させる( 材料表を参照)。
13. P200ピペットとピペットを上下に使用して、細胞クラスターを分解します。
14. 細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で細胞を20分間インキュベート₂する。
15. ステップ 8.13 を繰り返します。
    注:約10 μLを取り出し、細胞培養皿に種を入れて顕微鏡下で10倍の倍率で観察し、スフェロイドが単一細胞にどれだけうまく解離しているかを確認してください。必要に応じて、さらに5分のインキュベーションを加えます。
16. 4 mLの細胞培養培地(DMEMは10%牛血清を補充)を加え、チューブを3\u20124回反転して混合します。
17. 遠心分離機は400 x g で4分間RTで。
18. 上清を取り除く。ここから以降、FACS染色または細胞培養を行うことができる。

9. コラーゲンマトリックスからのRNA抽出

1. フェノール(材料表を参照)、クロロホルム100%、RNaseフリーエタノール、RNA抽出キット(材料表参照)、RNaseフリー1.5 mLチューブ、RNaseフリー15mLチューブ、RNaseフリーddH2 Oでグアニジニウムチオシアネートを調製します。₂
2. 81マイクロウェルアガロースキャストから15 mLのチューブに最大12個の190 μLコラーゲンマトリックスを移します。なめらかな尖った先端ピンセットで投げられたアガロースキャストの播種室内のコラーゲンマトリックスの角をつかみ、単一の自信に満ちた動きでアガロースキャストを剥がします。
   注:マトリックスはRNA抽出の準備ができるまで-80 °Cで凍結することもできます。
3. 15 mL チューブのコラーゲンマトリックスにフェノール( 材料表を参照)を使用して 1 mL のグアニジニウムチオシアネートを加えます。
   注:フェノールとグアニジニウムチオシアネートは、コラーゲンマトリックスを完全にカバーする必要があります。
4. 10\u201220 sのチューブを渦。
5. 20G針と5mLの注射器でマトリックスを完全に溶解するまで均質化します。
6. マトリックスをRTで5分間座らせます。
7. 200 μLの純粋なクロロホルムをマトリックスに加え、チューブを15秒ほど激しく振ります。
8. すぐに1.5 mLチューブにミックスを移します。
9. 相が分離されるまで、ミックスをRTで少なくとも5分間座らせます。
10. 1.5 mLチューブを12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
11. 新しい1.5 mLチューブに、70%エタノールの500 μLを充填します。
    注:遠心分離後の水相の体積に依存します(ステップ9.12を参照してください。70%エタノールの量は、水相の体積と等しくする必要があります。
12. 慎重に70%エタノール充填チューブに遠心サンプルの上部水相を移し、上下にピペットを入れ、十分に混合します。
13. (重大なステップ6)これはRNAを汚染するので、上相を除去しながらフェノール分離とグアニジニウムチオシアネートの底部の層を乱さないように注意してください。
14. RNA 抽出カラムにサンプルを追加します (RNA 抽出キットに含まれる 、 材料表を参照してください)。ここから、細胞からのRNA精製のためのメーカーのプロトコルに従ってください。

結果

3Dの共培養モデルは、必要に応じて組み合わせたり変更したりできる 、図1Aに示すさまざまなアッセイを可能にします。我々の確立された実験セットアップにおいて、腫瘍およびT細胞は、侵襲的および/または耐性腫瘍細胞の選択のための浸潤アッセイの開始に続いて2日間共培養される(図1B)。4日目に、浸潤の定量が行われ、「生存者」細胞はコラ...

ディスカッション

ここで提示される方法は、T細胞との共培養、細胞ベースの機能的および分子アッセイ、ならびに単一の装置を用いた様々なモニタリングおよび分析の可能性を可能にする3D腫瘍スフェロイド生成について説明する。我々のアプローチの大きな利点は、3D培養物を別のアッセイに移す必要がなくて、アッセイ全体で3D培養の完全性を維持する点です。

ここで示すワークフロ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols