Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Riepilogo

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Abstract

Sono stati compiuti progressi significativi nel trattamento del cancro con l'immunoterapia, anche se un gran numero di tumori rimane resistente al trattamento. Un numero limitato di saggi consente il monitoraggio diretto e le intuizioni meccanicistiche sulle interazioni tra tumore e cellule immunitarie, tra cui, le cellule T svolgono un ruolo significativo nell'esecuzione della risposta citotossica del sistema immunitario adattivo alle cellule tumorali. La maggior parte dei saggi si basa sulla co-coltura bidimensionale (2D) delle cellule a causa della relativa facilità d'uso, ma con una rappresentazione limitata del fenotipo di crescita invasiva, uno dei segni distintivi delle cellule tumorali. Gli attuali sistemi di co-coltura tridimensionali (3D) richiedono attrezzature speciali o un monitoraggio separato per l'invasione delle cellule tumorali co-culture e l'interazione delle cellule T.

Qui descriviamo un approccio per monitorare contemporaneamente il comportamento invasivo in 3D degli sferoidi delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella co-coltura. La formazione di spheroid è guidata da interazioni tra cellule cellulari migliorate in calchi di microwell agarose senza scaffold con fondi a forma di U. Sia la co-coltura delle cellule T che l'invasione delle cellule tumorali nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dei microwell dei calchi di agarose senza la necessità di trasferire le cellule, mantenendo così un sistema di co-coltura 3D intatto in tutto il saggio. La matrice del collagene può essere separata dal cast di agarose, consentendo l'immunofluorescenza (IF) e l'imaging confocale delle cellule. Inoltre, le cellule possono essere isolate per un'ulteriore crescita o sottoposte ad analisi come per l'espressione genica o lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Infine, la co-coltura 3D può essere analizzata dall'immunostochimica (IHC) dopo l'incorporamento e il sessamento. Possibili modifiche del saggio includono composizioni alterate della matrice extracellulare (ECM) così come l'inclusione di diverse cellule stroe o immunitarie con le cellule tumorali.

Introduzione

Nonostante i miglioramenti significativi nell'immunoterapia del cancro nell'ultimo decennio, la nostra comprensione meccanicistica della sensibilità e della resistenza ai trattamenti sono ancora piuttosto^{scarsi 1}. È ben noto che i tumori mostrano una sostanziale eterogeneità e che le interazioni dinamiche delle cellule tumorali con il loro microambiente così come con le cellule immunitarie, impattano la morte delle cellule tumorali, il comportamento invasivo e la risposta ai trattamenti che includono l'immunoterapia^1,2,3. Come un braccio del sistema immunitario adattivo, le cellule T eseguono la citotossicità specifica delle cellule. L'analisi del riconoscimento delle cellule T e della risposta alle cellule tumorali fornisce informazioni meccanicistiche sulla resistenza e la sensibilità ai trattamenti modulatori immunitari.

La modellazione in vitro e il monitoraggio delle interazioni tra il cancro e le cellule T in un ambiente appropriato sono stati impegnativi e finora hanno portato a limitate intuizioni meccanicistiche. La maggior parte dei saggi basati sulle cellule si basano su un ambiente bidimensionale (2D), che manca di caratteristiche chiave che sono fondamentali per ricapitolare il tridimensionale (3D) in fisiologia vivo^4,5,6, vale a dire interazioni spaziali cellulare-cellula, contatto con la matrice extracellulare (ECM)⁷, domanda metabolica dinamica, aumento dell'ipossia a causa della crescita di massa⁸, e gli effetti del microenvio tumorale (TME)⁹. D'altra parte, ci sono ancora una serie di carenze con i sistemi di co-cultura e di analisi dell'invasione tridimensionali (3D) attualmente utilizzati: (1) la natura che richiede tempo della generazione di sferoidi e del raccolto^5,10, (2) la mancanza di controllo sulle dimensioni dello smero, forma e densità cellulare^11,12, (3) i saggi di tipo a bassa velocità effettiva, (4) il requisito per le attrezzature speciali^13,14, (5) la necessità di trasferire la co-cultura in ambienti distinti per diversi saggi^15,16,17. In particolare, il trasferimento di un saggio di co-cultura spesso porta alla rottura degli sroidi e alla perdita dell'integrità della co-cultura. Questo vale soprattutto per gli sferoidi "sciolti" con adesione ridotta delle cellule cellulari. Ad esempio, la maggior parte dei saggi di invasione 3D richiedono che gli sroidi vengono raccolti dopo la loro formazione iniziale e poi rispeso in ECM^14,15,16. Questa fase di resuspensione si traduce in una perdita di controllo sulla distanza tra sferoidi. Poiché la distanza tra gli sferoidi tumorali influisce sul loro comportamento invasivo, questa perdita di controllo introduce un'elevata varianza inter-assay e riduce la riproducibilità. Inoltre, l'applicazione di saggi di frazioni cellulari da parte di fasi di centrifugazione consecutive per la valutazione delle cellule immunitarie infiltranti nello sferoide periferico e tumorale è limitata alle popolazioni di cellule tumorali che generano sferoidi più stabili¹⁷.

Concetto e approccio

Il nostro approccio affronta le carenze di cui sopra utilizzando un "All-in-One"- modello di co-coltura sferoide 3D, che non richiede il trasferimento di sateidi per i successivi saggi. Abbiamo adattato un dispositivo di formazione sferoide (vedi Tabella dei Materiali) per generare un saggio per monitorare contemporaneamente il comportamento invasivo delle cellule tumorali e la citotossicità delle cellule T co-culturate. Questo metodo è facile da usare, poco costoso e consente una gestione rapida e semplice in un'impostazione 3D relativamente elevata. A seconda del tipo di dispositivo utilizzato, possono essere generati fino a 81 sferoidi di grandi dimensioni uniformi in un unico passaggio di pipettatura con controllo sulla dimensione del singolo sferoide modificando il numero di cellule seme. La formazione di spheroid è forzata da interazioni tra cellule-cellule migliorate in cast multi-pozzo agarose senza scaffold con fondi a forma di U. Abbiamo adattato questo sistema 3D per studi funzionali dinamici basati sulle cellule, nonché per analisi molecolari e biochimiche che includono lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), l'immunofluorescenza (IF) o l'immunohistochimica (IHC), nonché l'analisi dell'espressione genica della co-coltura 3D intatta.

Per gli studi funzionali, l'incorporamento di sferoidi nel collagene di tipo I all'interno dei cast di agarose si traduce in invasione delle cellule tumorali da sferoidi equidinti e permette di monitorare le caratteristiche specifiche specifiche della linea cellulare essenziale, come la migrazione di singole cellule contro cellule^{collettive 18,19}. Inoltre, la matrice di collagene è facilmente separata dal cast di agarose, con conseguente una patch spessa 1-u20122 mm contenente sferoidi multipli, che possono essere ulteriormente elaborati per la colorazione IF e l'imaging mediante microscopia confocale. Questo può rivelare l'invasione cellulare distinta e le interazioni cellulare-matrice in uno screening ad alta velocità effettiva. Inoltre, le cellule nella matrice di collagene possono essere isolate dopo la digestione del collagene e la dissociazione a singola cellula per la successiva coltivazione o analisi cellulare.

Per l'analisi IHC di sheroidi, dopo la fissazione e il sessismo del cast di agarose, proteine o altre molecole di interesse sono rilevabili pur mantenendo le posizioni geografiche degli sferoidi. Nell'approccio descritto qui, gli sferoidi sono direttamente incorporati nel gel di elaborazione dell'agarose Idrossietile all'interno del cast di agarose e il gel funge da "coperchio" per trattenere gli sferoidi nella parte inferiore dei microwell. Dopo l'incorporamento della paraffina del cast di agarose²⁰, la sezionazione orizzontale seriale viene eseguita con la parte inferiore del cast che funge da punto di partenza.

Questo approccio contrasta con il tradizionale sezionamento IHC di sferoidi che richiede la raccolta delle cellule prima di incorporarsi nel gel di elaborazione dell'agaro idrossitile²¹ e rischia di interrompere gli sferoidi perdendo così la disposizione spaziale delle cellule. Inoltre, la frazioni cellulari per centrifugazione per valutare se le cellule immunitarie infiltrate o rimaste periferiche agli sferoidi tumorali¹⁷ sono evitate mediante incorporazione diretta.

Inoltre, la co-coltura 3D può essere eseguita da tumore admixing, cellule stroe o immunitarie, e quindi studiando crosstalk delle cellule tumorali o ricapitolando diversi microambienti tumorali per analizzare le interazioni cellulare-cellula tra cui co-culture con cellule endoteliali¹⁶.

Questa impostazione di co-coltura dello sferoide 3D può essere utilizzata per eseguire la co-coltura di diversi tipi di cellule presenti nel microambiente tumorale e per valutare gli effetti degli elementi ECM alterati. Oltre al collagene di tipo I, altri componenti ECM (ad esempio, matrigel, miscele di matrigel/collagen, fibronectina), possono essere utilizzati poiché l'invasione delle cellule tumorali è influenzata dall'abbondanza di diversi substrati²². Inoltre, i microwell del cast di agarose sono adatti per la formazione di sferoidi di linee cellulari primarie e per le cellule con bassa adesione cellulare.

Protocollo

Un elenco e una spiegazione di alcune parole usate di frequente in tutto il protocollo sono disponibili nel file supplementare 1.

1. Generazione di sroidi

1. Preparare e autoclave 2% agarose in stampi di gomma 1x PBS (ad esempio, 1 g agarose in 50 mL di 1x PBS) e autoclave 35- e 81-microwell stampi di gomma.
   CAUTION: Evitare di utilizzare agarose a bassa fusione per generare i getti di agarose per l'elaborazione IHC.
2. Preparare cast di agarose
   NOTA: i calchi da 35 microwell vengono utilizzati per l'invasione, l'immunofluorescenza (IF) e i saggi di isolamento delle cellule. I calchi da 81 microwell sono utilizzati per la citotossicità, l'immunostochimica (IHC), l'isolamento delle cellule e i saggi di estrazione dell'RNA.
   1. Dopo che l'agarose è stato autoclaved, lasciare raffreddare l'agarose fuso a circa 60 u201270 . In un cappuccio di coltura cellulare, utilizzare la tecnica asettica e pipetta 500 L di agarose fuso in uno stampo di gomma 81-microwell per pozzo o 330 L in uno stampo di gomma da 35 microwell per pozzo.
      CAUTION: Evitare di creare bolle durante la miscelazione o pipettare agarose. Rimuovere eventuali bolle mediante pipettatura delicatamente.
   2. Dopo che l'agarose è solidificato, flettere con attenzione lo stampo di gomma per rimuovere il cast di agarose da esso. In questo caso, mettere le mani sopra il pozzo appropriato e lasciare che il lancio di agarose cadere a destra in un pozzo del pozzo.
      NOTA: Flettere lo stampo in gomma in posizioni diverse per evitare di sovras flettere. Potrebbe essere utile flettere lo stampo di gomma e spingere delicatamente dal basso allo stesso tempo.
   3. Per equilibrare i calco di agarose, aggiungere il mezzo di coltura cellulare, costituito da DMEM integrato con 10% di siero bovino fetale (2,5 mL/bene per piastra 12-well e 1 mL/pozzo per piastra 24-well). Mettere il pozzo in un incubatore di coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% CO₂₎e incubare per 1 h.
3. Nel frattempo, preparare la coltura cellulare per il seeding.
   NOTA: il numero totale di semina delle cellule per cast di agarose deve essere deciso dall'investigatore. Per le linee cellulari del cancro al pancreas primario murino, 35.000 cellule/35 microwell cast e 81.000 cellule/81-microwell cast (in media 1000 cellule/sheroidi) sono semi per tutti i seguenti saggi. Il diametro medio di uno smeroide è di circa 150 u2012200 m dopo 48 h.
4. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose con una pipetta P1000 prima inclinando il pozzo. Quindi rimuovere con attenzione il mezzo nella camera di semina.
5. Semina con cura la sospensione delle cellule tumorali preparata goccia-saggio nella camera di semina cellulare. Rimettere con cura la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% DI CO₂₎per 15 minuti.
   NOTA: Durante questa fase le cellule si depositano nei microwell del cast di agarose.
6. Aggiungere ulteriore mezzo all'esterno del cast di agarose (2,5 mL/pozzo per piastra 12-well e 1 mL/pozzo per piastra 24-well).
7. Rimettere la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% DI CO₂₎per 48 h.
   NOTA: Di solito ci vogliono fino a poche ore per le cellule a formare sferoidi nei microwell. In generale, gli sferoidi delle cellule tumorali solide si formano dopo 24 h e sono stabili dopo 48 h. Tuttavia, questo può variare tra le diverse linee di cella. Se necessario, cambiare il mezzo di coltura cellulare inclinando con attenzione la piastra con i calco di agarose e rimuovendo il mezzo di coltura cellulare circostante con una pipetta P1000. Quindi aggiungere con attenzione mezzo fresco pipettando lungo la parete del pozzo. Di solito non è necessario cambiare il supporto all'interno dei cal d'essa a causa del suo piccolo volume e del rischio di rimuovere gli sferoidi.

2. Co-coltura con le cellule T

1. Rispendere il numero richiesto di cellule T in 75 cellule T (35-microwell cast) o in 190 l (81 microwell cast) del mezzo di coltura a cellule T appropriato (RPMI integrato con 10% di siero bovino fetale e 100 unità/penicillina mL/streptomicina).
2. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose con una pipetta P1000 prima inclinando il pozzo. Quindi rimuovere lentamente e con attenzione il mezzo all'interno del calco puntando delicatamente un angolo della camera di semina con una pipetta P200 mantenendo il ben piatto inclinato con l'altra mano.
3. (Passaggio critico 1) Poiché esiste il rischio di rimuovere gli sferoidi, controllare la perdita di sferoidi confrontando il numero di sferoidi all'interno dei microfichi prima e dopo la rimozione del mezzo visualizzando al microscopio a ingrandimento 10x.
4. Seminare con cura la sospensione a T drop-wise nella camera di semina del cast di agarose tenendo la pipetta P200 circa 0,5 cm sopra il cast.
5. (Passaggio critico 2) C'è il rischio di svuotare gli sferoidi durante l'aggiunta delle cellule T. Pertanto, è fondamentale aggiungere le cellule T molto lentamente e circa 0,5 cm sopra la camera di semina.
   NOTA: Una possibilità di diminuire il numero di sferoidi lavati fuori è puntando la pipetta ad un angolo della camera di semina mentre si aggiungono le cellule T, rischiando così solo gli sroidi in questo angolo per essere scaricati.
6. Ri posto con cura la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% CO₂) per 15 min.
7. Togliere la piastra dall'incubatrice e aggiungere il mezzo di coltura cellulare fresca (RPMI integrato con 10% di siero bovino fetale e 100 unità/penicillina mL/streptomicina) intorno al getto di agarose lentamente pipettandolo lungo la parete del pozzo.
8. Rimettere la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare per 48 h.

3. Incorporamento della co-coltura 3D nella matrice di collagene di tipo I

1. Preparare collagene di tipo I neutralizzato
   1. Diluire il collagene di stock con mezzo di base libero dal siero (RPMI) ad una concentrazione di lavoro finale di 3 mg/mL. Per ogni 100 L di collagene diluito, aggiungere 11 L di 10x PBS e 1,2 L 1 M di idrossido di sodio (NaOH).
   2. Tenere sul ghiaccio e incubare (neutralizzare) per 1 h.
2. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose con una pipetta P1000 prima inclinando il pozzo. Quindi, rimuovere lentamente e con attenzione il mezzo all'interno del calco puntando delicatamente un angolo della camera di semina con una pipetta P200 mantenendo il ben piatto inclinato con l'altra mano.
   NOTA: Qui, è fondamentale rimuovere completamente il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose.
3. Pipetta con cura il collagene neutralizzato me lassiamo a goccia nella camera di semina del cast di agarose tenendo la pipetta P200 a circa 0,5 cm sopra il cast.
4. Mettere immediatamente la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare per 4 min (35 microwell cast) o 5 min (81-microwell cast).
   CAUTION: (Passaggio critico 3) È fondamentale mantenere rigorosamente il tempo di incubazione specificato. In caso contrario, il comportamento invasivo potrebbe non essere riproducibile.
5. Invertire il pozzo e lasciarlo capovolto nell'incubatrice per 1 h.
   NOTA: I calni rimarranno attaccati al fondo della piastra del pozzo a causa della tensione superficiale. Nel caso in cui venga utilizzato un mezzo di coltura cellulare speciale con alta concentrazione di siero (ad esempio, RPMI integrato con 20% di siero bovino fetale), un ulteriore passaggio di lavaggio con 1x PBS dopo aver rimosso il mezzo nel pozzo potrebbe essere necessario per aumentare la tensione superficiale.
6. Togliere il piatto dall'incubatrice e invertirlo. Aggiungere il mezzo di coltura cellulare fresco (RPMI integrato con 10% di siero bovino fetale e 100 unità/penicillina mL/streptomicina) intorno all'agarose gettato lentamente pipetting lungo la parete del pozzo.
7. Rimettere la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare per 48 h.

4. Analisi della citotossicità

1. Preparare 3 mL di 1x PBS con 2% di siero bovino fetale per cast di agarose.
2. Dopo la co-coltura per 4 d, rimuovere il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose con una pipetta P1000 inclinando leggermente il pozzo con l'altra mano.
   NOTA: il periodo di tempo totale della co-cultura deve essere deciso dall'investigatore.
3. Distribuire 1 mL di 1x PBS - 2% FBS con una pipetta P1000 nella camera di semina per spostare gli sferoidi dai microwell.
4. Ripetere il passaggio 4.3 due volte con il volume nel pozzo e trasferirlo in un tubo da 15 mL.
5. Centrifugare il tubo a 300 x g per 10 s a temperatura ambiente (RT).
6. Rimuovere con attenzione il supernatant con una pipetta P1000.
7. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di 1x PBS con 2% FBS e centrifuga a 300 x g per 1 min a RT.
8. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 4.7).
9. Rimuovere il supernatant e aggiungere 1 mL della soluzione di enzimi di dissociazione cellulare (vedi Tabella dei materiali).
10. Utilizzare una pipetta P200 e una pipetta su e giù per suddividere i cluster di cellule.
11. Incubare le cellule per 20 minuti nell'incubatore di coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% CO₂).
12. Ripetere il passaggio 4.10.
    NOTA: Togliere 10 dollari e seminare su un piatto di coltura cellulare per osservare (sotto il microscopio a ingrandimento 10x) quanto bene gli sferoidi si sono dissociati in singole cellule. Se necessario, aggiungere 5 minuti di ulteriore incubazione.
13. Aggiungere 4 mL di mezzo di coltura cellulare completa (RPMI integrato con 10% siero bovino fetale e 100 unità/penicillina mL/streptomicina) e mescolare invertendo il tubo 3-u20124 volte.
14. Centrifuga a 400 x g per 4 min a RT.
15. Rimuovere il supernatante e risuspendere le cellule nel buffer FACS per la colorazione Annexin V delle cellule apoptotiche.
    NOTA: Da qui è possibile eseguire qualsiasi colorazione FACS e l'analisi cellulare.

5. Incorporamento di gel di elaborazione dell'agarose idrossietile per la sezione IHC

NOTA: Qui è fondamentale evitare di utilizzare agarose a bassa fusione per generare i cal proiettati agarose.

1. Alla fine della co-coltura, rimuovere il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose con una pipetta P1000 prima inclinando il pozzo. Quindi rimuovere lentamente e con attenzione il mezzo all'interno del calco puntando delicatamente un angolo della camera di semina con una pipetta P200 mantenendo il ben piatto inclinato con l'altra mano.
2. Pipetta lentamente 10% formalina prima nella camera di semina puntando delicatamente un angolo della camera di semina con una pipetta P200. Quindi aggiungere 10% formalin all'esterno del cast di agarose fino a quando non è completamente coperto. Fissare il cast di agarose in 10% formalina per 1 d.
3. Rimuovere il formatolin il giorno successivo.
4. Pipetta con cura 210 l .L (81-microwell cast) o 100 l (35-microwell cast) di gel di lavorazione dell'agarosi idrossietile pre-riscaldato e liquefatto (vedi Tabella deimateriali ) goccia-saggio nella camera di semina del cast di agarose tenendo la pipetta P200 circa 0,5 cm sopra il cast.
5. Lasciare che il gel di lavorazione dell'agaro idrossitile si solidifichino per 10 min a RT.
6. Trasferire il cast agarose su 1x PBS.
   NOTA: per una conservazione più lunga, incorporare il cast nel 70% di etanolo per prevenire la contaminazione.
7. Disidratare le sezioni di gel attraverso una serie di etanolo (1 h ciascuno: 70% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo [3x cambia ciascuno]). Quindi cancellare in una soluzione di compensazione 3x per 1 h ciascuno (ad esempio, idrocarburi alifatici [ad esempio, Clearite], o xylenes), e infiltrarsi con paraffina fusa (3x per 1 h ciascuno), manualmente o in un processatore di tessuto. Incorporare il cast in cera di paraffina per la successiva sezionazione a 5 m per sezione.
8. Rimuovere la cera mettendo i vetrini in xylenes, 3x per 3 min ciascuno, quindi reidratare le sezioni di tessuto attraverso una serie di alcol grado: 100% etanolo per 2 min, 95% etanolo per 1 min, 80% etanolo per 30 s e 70% etanolo per 30 s, quindi mettere in acqua.
9. Eseguire il recupero di epitopi indotta dal calore in un piroscafo vegetale a 100 gradi centigradi per 20 min, seguito da 20 minuti di raffreddamento in una soluzione di citrato di sodio da 10 mM pH 6.0 e bloccare le perossidi endogene con H₂O₂.
10. Bloccare le sezioni con il normale siero obiettivo ed esporle all'anticorpo anti-CD8 (diluizione 1/25) durante la notte.
11. Applicare anticorpi secondari coniugati anti-coniglio-HRP (vedi Tabella dei Materiali)e sviluppare la colorazione utilizzando il cromosogeno 3,3'-Diaminobenzidine (DAB). Controstano i nuclei con una soluzione di ematossia Harris dell'11% (vedi Tabella dei Materiali).

6. Monitoraggio e analisi dell'invasione dello sferoide nella co-cultura

NOTA: Il punto di tempo dell'invasione dello sferoideo nell'invasione del collagene I deve essere deciso dallo sperimentatore. Acquisire immagini di coltura cellulare utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 10x. Il punto di tempo ideale dipende dalla linea cellulare in fase di test, nonché dal componente ECM. Linee cellulari più invasive inizieranno a diffondersi nel collagene entro poche ore dopo l'aggiunta del collagene. Poiché le cellule T nella co-coltura potrebbero impedire una visione completa dell'uscita dagli sferoidi in tempi molto precorsi, generalmente le immagini vengono scattate a 0 h (come riferimento), 24 h e 48 h dopo aver aggiunto il collagene.

1. Quantitate l'invasività contando manualmente il numero di "spikes" che escono dallo smeriglio e/o utilizzando un software di analisi delle immagini, ad esempio, Image J.
   1. Analizzare l'invasione come il numero di "spikes" dallo smeriglio contando manualmente il numero di "spikes" di uno smeriglio.
      NOTA: Deve essere deciso dall'investigatore quali sporgenze dagli sroidi sono considerate come "spikes". Un criterio di decisione potrebbe essere la lunghezza del "spike" misurato dal bordo dello smerioide.
   2. Analizzare l'invasione come l'area di invasione rispetto alle dimensioni dello smerioide.
      1. Utilizzare lo strumento disegno a mano libera (Immagine J) per tracciare il bordo dell'area totale (invasione e area sferoide).
      2. Fare clic su Analizza nel menu in alto, quindi fare clic su Misura per visualizzare la misurazione dell'area.
      3. Traccia il confine dell'area totale dello sferoide.
      4. Fare clic su Analizza nel menu in alto, quindi fare clic su Misura per visualizzare la misurazione dell'area.
      5. Copiare l'elenco dei risultati misurati in un foglio di calcolo e calcolare l'invasione totale / sheroid utilizzando la formula: invasione totale - area totale / area sheroid.

7. Colorazione immunofluorescenza

1. Preparare quanto segue.
   1. Preparare il 5,4% di formalin (5 mL) utilizzando 2,3 mL di 1x PBS e 2,7 mL del 10% di formalina.
   2. Preparare 0,5% Octoxynol (50 mL) utilizzando 50 mL di 1x PBS e 2,5 mL del 10% Octoxynol (negozio a RT).
   3. Preparare IF Buffer (200 mL) utilizzando 200 mL di 1x PBS, 200 mg di albumina di siero bovino (BSA), 4 mL del 10% Octoxynol, 1 mL del 10% di polisorbate 20 (riscaldamento a RT prima dell'uso; filtro e memorizzazione a 4 gradi centigradi).
   4. Preparare la soluzione di blocco (5 mL) utilizzando 5 mL IF Buffer e 500 L di siero di capra (riscaldamento a RT prima dell'uso).
   5. Tenere pronti i vetrini da camera a 8 pozzo, i coperture in vetro e i supporti di montaggio.
2. Giorno 0
   1. Fissare l'intero cast di agarose, comprese le ssteroidi, durante la notte in formalina 5.4% a RT in una camera umidificata.
3. Giorno 1
   1. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare che circonda il cast di agarose con una pipetta P1000 inclinando il pozzo.
   2. Trasferire il cerotto di collagene in una camera a 8 possenti afferrando un angolo della matrice di collagene all'interno della camera di semina del cast di agarose con pinzette a punta appuntita elegante e staccarlo dal cast di agarose in un unico movimento sicuro.
      NOTA: Il cerotto di collagene deve essere facilmente separato dal cast di agarose. In caso contrario, utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere con attenzione il mezzo di coltura nell'area della camera di semina o invertire il cast di agarose e scuotere delicatamente la piastra di scarico per spostare la matrice di collagene.
   3. Aggiungere 250 L dello 0,5% Octoxynol (vedi Tabella dei materiali)per bene. Incubare per 1 h a RT.
   4. Aspirare l'Octoxynol e aggiungere 250 L di soluzione di blocco per pozzo. Blocco per 1 h a RT.
   5. Nel frattempo, diluire l'anticorpo primario (diluizione per anti-keratina 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) nella soluzione di blocco, calcolando per 250 L per pozzo.
   6. Aggiungere l'anticorpo primario nella soluzione di blocco e posizionare lo scivolo della camera in una camera umidificata per l'incubazione notturna a RT.
4. Giorno 2
   1. Rimuovere l'anticorpo primario nella soluzione di blocco aspirando.
   2. Lavare 3 volte aggiungendo 300 L di IF Buffer e lasciarlo riposare per 5 min a RT.
      NOTA: Basta lasciarlo riposare, non c'è bisogno di metterlo su uno shaker.
   3. Diluire l'anticorpo secondario nella soluzione di blocco (per anti-keratina 8: anti-ratto, diluizione 1/500).
   4. Aggiungere 250 L di anticorpo secondario in soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare per 1 h a RT. Da qui in avanti, proteggere i campioni dalla luce.
   5. Rimuovere l'anticorpo secondario nella soluzione di blocco aspirando.
   6. Lavare 3 volte con 300 L di IF Buffer aggiungendo e lasciare riposare per 5 min a RT.
   7. Sciacquare i campioni con 1x PBS e aspirarlo.
   8. Rimuovere con attenzione le pareti dello scivolo camera in modo che rimanga solo lo scivolo di vetro nella parte inferiore.
   9. Aggiungere almeno 200 L di supporto di montaggio a un coperture di vetro e rilasciare lentamente il coperture sul campione.
      NOTA: evitare di creare bolle in quanto ciò influirà sulla qualità dell'immagine. Le bolle possono essere prevenute posizionando delicatamente lo slittamento del coperchio sul bordo lungo del scivolo ad un angolo di 45 gradi o abbassando lentamente lo slittamento del coperchio sul bordo.
   10. Mettere i campioni montati in un luogo buio e asciutto e lasciarlo riposare durante la notte. L'imaging può essere eseguito il giorno seguente.
       NOTA: Il coverslip potrebbe inizialmente spostarsi un po 'una volta posizionato sopra la patch di collagene. Lasciare che lo scivolo di vetro si sieda su un'area pari per qualche minuto. Il coverslip appiattirà il campione in modo che non ci sarà alcuno spazio tra la diapositiva di vetro e coverslip nel tempo.

8. Isolamento delle cellule dalla matrice di collagene

1. Preparare quanto segue.
   1. Preparare 1 mg/mL collagenase 4 in mezzo di coltura cellulare contenente siero (memorizzare collagenasi aliquoted 4 diluizioni a -20 gradi centigradi)
   2. Preparare il 2,5% di BSA in 1x PBS e rivestire con esso tutti i tubi e le punte delle pipette (filtro della soluzione BSA prima dell'uso).
   3. Preguerra la soluzione BSA e il mezzo di coltura cellulare prima dell'uso.
2. Preparare 2 mL di soluzione di collagenasi 4 (1 mg/mL) per digerire un massimo di tre matrici di collagene da 35-microwell agarose casts.
3. Trasferire fino a tre matrici di collagene da 75 15 microwell in un tubo di 15 mL pre-rivestito di BSA del 2,5%. Afferra un angolo della matrice di collagene all'interno della camera di semina del cast di agarose con pinzette a punta appuntita elegante e staccarlo dal cast di agarose in un unico movimento sicuro.
4. Taglio smussato della punta di una punta P1000 con forbici. Pre-coat la punta rimanente con 2.5% BSA e abbattere la matrice di collagene il più possibile pipettando su e giù. Incubare il tubo per 15 minuti a 37 gradi centigradi.
5. (Passaggio critico 4) Ad ogni 5 minuti, controllare se la matrice di collagene si è dissolta. Pipetta su e giù di nuovo prima di prendere 10 L del campione e seminarlo su un piatto di coltura cellulare per l'osservazione al microscopio a 10x ingrandimento. Aggiungere altri 5 minuti se necessario.
6. Riempire il tubo con 10 mL di mezzo di coltura cellulare preriguerra (DMEM integrato con 10% siero bovino fetale). Mescolare delicatamente invertendo il tubo 3-u20124 volte.
7. Centrifugare il tubo a 400 x g per 4 min a RT.
8. Rimuovere con attenzione il supernante e lasciare 2 mL di volume.
9. (Passaggio critico 5) Lasciare 2 mL dopo la prima fase di centrifugazione in quanto potrebbe esserci ancora collagene non dissolto nella parte inferiore del tubo che trasporta le cellule lungo di loro.
10. Eseguire due passaggi di lavaggio aggiungendo 10 mL di supporto di coltura cellulare contenente siero ogni volta. Centrifuga ogni volta a 400 x g per 4 min a RT.
11. Dopo l'ultimo passaggio di lavaggio, rimuovere il più mezzo possibile e lasciare solo il pellet cellulare.
12. Rispendere il pellet cellulare in 1 mL della soluzione di enzimi di dissociazione cellulare (vedi Tabella dei materiali).
13. Utilizzare una pipetta P200 e una pipetta su e giù per suddividere i cluster di cellule.
14. Incubare le cellule per 20 minuti nell'incubatore di coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% CO₂).
15. Ripetere il passaggio 8.13.
    NOTA: Togliere 10 dollari e seminare su un piatto di coltura cellulare per osservare al microscopio un ingrandimento 10x per vedere quanto bene gli sferoidi si sono dissociati in singole cellule. Se necessario, aggiungere 5 minuti di ulteriore incubazione.
16. Aggiungere 4 mL di mezzo di coltura cellulare (DMEM integrato con 10% siero bovino fetale) e mescolare invertendo il tubo 3-u20124 volte.
17. Centrifuga a 400 x g per 4 min a RT.
18. Rimuovere il supernante. Da qui in poi, è possibile eseguire la colorazione FACS o la coltura cellulare.

9. Estrazione dell'RNA dalla matrice del collagene

1. Preparare il guanidinio tiocyanato con fenolo (vedi Tabella dei materiali), 100% cloroformio, 70% di etanolo senza RNase, kit di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali),tubi da 1,5 mL senza RNase, tubi da 15 mL senza RNase e ddH₂O senza RNase.
2. Trasferire fino a dodici matrici di collagene da 190 gradi da 81-microwell agarose in un tubo da 15 mL. Afferra un angolo della matrice di collagene all'interno della camera di semina del cast di agarose con pinzette a punta appuntita elegante e staccarlo dal cast di agarose in un unico movimento sicuro.
   NOTA: Le matrici possono anche essere congelate a -80 gradi centigradi fino a quando non sono pronte per l'estrazione dell'RNA.
3. Aggiungere 1 mL di guanidinio con fenolo (vedi Tabella dei materiali) alle matrici di collagene nel tubo da 15 mL.
   NOTA: Il diociano di guanidinio con fenolo deve coprire completamente le matrici di collagene.
4. Vortex i tubi per 10 u201220 s.
5. Omogeneizzare le matrici con aghi da 20 G e siringhe da 5 mL fino a quando non sono completamente dissolte.
6. Lasciate che le matrici si siedano per 5 minuti a RT.
7. Aggiungere 200 l di cloroformio puro alle matrici e agitare vigorosamente il tubo per 15 s.
8. Trasferire immediatamente il mix a tubi da 1,5 mL.
9. Lasciare riposare il mix per almeno 5 minuti a RT fino a quando le fasi sono separate.
10. Centrifugare i tubi da 1,5 mL a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
11. Riempire un nuovo tubo da 1,5 mL con 500 L del 70% di etanolo.
    NOTA: A seconda del volume della fase aque dopo la centrifugazione (vedere il punto 9.12. La quantità di etanolo del 70% deve essere uguale al volume della fase aque.
12. Trasferire con cura la fase aquea superiore dei campioni centrifugati al tubo pieno di etanolo al 70% e mescolare accuratamente mediante pipettamento su e giù.
13. (Passaggio critico 6) Fare attenzione a non disturbare gli strati nella parte inferiore del guanidinio tiocyanato con separazione fenolo durante la rimozione della fase superiore, in quanto questo contamina l'RNA.
14. Aggiungere il campione a una colonna di estrazione dell'RNA (incluso nel kit di estrazione dell'RNA, vedere Tabella dei materiali). Da qui in avanti, seguire il protocollo del produttore per la purificazione dell'RNA dalle cellule.

Risultati

Il modello di co-cultura 3D consente diversi saggi illustrati nella Figura 1A, che possono essere combinati o modificati in base alle esigenze. Nella nostra configurazione sperimentale consolidata, tumore e cellule T sono co-culturati per 2 giorni seguiti dall'avvio del saggio di invasione per la selezione di cellule tumorali invasive e/o resistenti (Figura 1B). Il giorno 4 viene eseguita la quantificazione dell'invasione e le cellule "sopravvissute" sono isolat...

Discussione

Il metodo qui presentato descrive la generazione di sferoidi tumorali 3D, che consente la co-coltura con cellule T, saggi funzionali e molecolari basati sulle cellule, nonché una varietà di possibilità di monitoraggio e analisi utilizzando un unico dispositivo. Il principale vantaggio del nostro approccio è che non richiede il trasferimento della cultura 3D a un saggio separato e mantiene l'integrità della cultura 3D in tutti i test.

Il flusso di lavoro qui presentato può essere modifica...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols