Мониторинг вторжения раковых клеток и цитотоксичности Т-клеток в 3D-культуре

Представленный подход одновременно оценивает вторжение раковых клеток в 3D-сфероидные анализы и цитотоксичность Т-клеток. Сфероиды генерируются в эшафот-бесплатно агарозы мульти-микроуэлл литой. Со-культура и встраивание в коллагеновую матрицу типа I выполняются в одном устройстве, которое позволяет контролировать вторжение раковых клеток и цитотоксичность Т-клеток.

Аннотация

Значительный прогресс был достигнут в лечении рака с помощью иммунотерапии, хотя большое количество раковых заболеваний остаются устойчивыми к лечению. Ограниченное количество анализов позволяет для прямого мониторинга и механистического понимания взаимодействия между опухолью и иммунными клетками, среди которых, Т-клетки играют значительную роль в выполнении цитотоксической реакции адаптивной иммунной системы на раковые клетки. Большинство анализов основаны на двумерной (2D) совместной культуре клеток из-за относительной простоты использования, но с ограниченным представлением фенотипа инвазивного роста, одной из отличительных черт раковых клеток. Современные трехмерные (3D) системы совместной культуры требуют либо специального оборудования, либо отдельного мониторинга для вторжения со-культурных раковых клеток и взаимодействующих Т-клеток.

Здесь мы описываем подход к одновременному мониторингу инвазивного поведения в 3D сфероидов раковых клеток и цитотоксии Т-клеток в со-культуре. Образование сфероидов обусловлено расширением клеточно-клеточных взаимодействий в микроуровновых отливах агарозы без агарозы с U-образными днами. Оба Т-клеток совместной культуры и раковых клеток вторжения в тип I коллагена матрицы выполняются в микроуэллах агарозы бросает без необходимости передачи клеток, тем самым сохраняя нетронутыми 3D совместной культуры системы на протяжении всего анализа. Коллагеновая матрица может быть отделена от агарозного отливки, что позволяет окрашивать иммунофторесценцию (ИФ) и конфокальные изображения клеток. Кроме того, клетки могут быть изолированы для дальнейшего роста или подвергнуты анализу, например, для экспрессии генов или флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Наконец, 3D-ко-культура может быть проанализирована иммуногистохимией (IHC) после встраивания и секционирования. Возможные модификации анализа включают измененные составы внеклеточной матрицы (ЭКМ), а также включение различных стромальных или иммунных клеток с раковыми клетками.

Введение

Несмотря на значительные улучшения в иммунотерапии рака за последнее десятилетие, наше механистическое понимание чувствительности и устойчивости к лечению по-прежнему довольно бедны¹. Хорошо известно, что опухоли проявляют существенную неоднородность, и что динамические взаимодействия опухолевых клеток с их микроокноронностью, а также с иммунными клетками, влияют на гибель опухолевых клеток, инвазивное поведение и реакцию^{на лечение, которые включают иммунотерапию 1}^,²^,³. Как одна рука адаптивной иммунной системы, Т-клетки выполняют клеточной цитотоксичности. Анализ Т-клеточного распознавания и реакции на раковые клетки дает механистическое понимание устойчивости и чувствительности к иммунной модуляторной терапии.

В пробирке моделирования и мониторинга взаимодействия между раком и Т-клеток в соответствующей среде была сложной задачей и до сих пор, привело к ограниченной механистической идеи. Большинство анализов на основе клеток опираются на двухмерную (2D) среду, что не хватает ключевых функций, которые имеют решающее значение для recapitulating трехмерных (3D) в физиологии vivo⁴^,⁵^,⁶, а именно пространственных клеточно-клеточных взаимодействий, контакт с внеклеточной матрицы (ECM) 7 ,^{динамический}метаболический спрос, увеличение гипоксии^{из-за массового роста 8}, и последствия микроэквиронации опухоли (TME)⁹. С другой стороны, Есть еще ряд недостатков с в настоящее время используется трехмерных (3D) совместной культуры и вторжения систем анализа: (1) трудоемкий характер фероидной генерации^{и урожай 5}^,¹⁰, (2) отсутствие контроля над размером сфероидов, форма и плотность^{клеток 11}^,¹², (3) низкой пропускной способности типа анализы, (4) требование для специального оборудования^13,^,¹⁴, (5) необходимость передачи совместной культуры в различных средах для различных^{анализов 15}^,¹⁶^,¹⁷. В частности, передача анализа совместной культуры часто приводит к нарушению сфероидов и утрате целостности со-культуры. Это особенно относится к "свободным" сфероидам с уменьшенной клеточной адгезией. Например, большинство 3D вторжения анализы требуют, чтобы сфероиды собирают после их первоначального формирования, а затем повторно в ECM¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Этот шаг повторного поиска приводит к потере контроля над расстоянием между сфероидами. Поскольку расстояние между сфероидами опухоли влияет на их инвазивное поведение, эта потеря контроля вводит высокую межассальную дисперсию и уменьшает воспроизводимость. Кроме того, применение анализов фракционирования клеток последовательными шагами центрифугации для оценки периферических и опухолевых сфероидов, проникающих в иммунные клетки, ограничивается популяциями опухолевых клеток, которые генерируют более стабильные^{сфероиды 17.}

Концепция и подход

Наш подход устраняет вышеупомянутые недостатки с помощью модели «Все в одном» — 3D сфероидной ко-культуры, которая не требует передачи сфероидов для последующих анализов. Мы адаптировали устройство формирования сфероидов (см. Таблицу материалов)для создания анализа для одновременного мониторинга инвазивного поведения раковых клеток и цитотоксии со-культурных Т-клеток. Этот метод является удобным, недорогим и позволяет быстро и легко обрабатывать в относительно высокой пропускной способности 3D настройки. В зависимости от типа используемого устройства, до 81 большого одинаково размера сфероидов могут быть созданы в одном шаге трубопроводов с контролем над индивидуальным размером сфероида путем изменения количества клеток, посеянных. Образование сфероидов вызвано расширением клеточно-клеточных взаимодействий в эшафот-бесплатных агарозных многофункциональных слепков с U-образными дном. Мы адаптировали эту 3D-систему для динамических функциональных исследований на основе клеток, а также молекулярных и биохимических анализов конечных точек, которые включают флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), иммунофторесценцию (IF) или иммуногистохимию (IHC) окрашивание, а также анализ экспрессии генов нетронутой 3D-ко-культуры.

Для функциональных исследований,встраивание сфероидов в коллаген типа I в агарозе бросает приводит к вторжению раковых клеток из равноумных сфероидов и позволяет контролировать основные клеточные линии конкретных особенностей, таких как одноклеточная против коллективной^{миграции клеток 18}^,¹⁹. Кроме того, коллагеновая матрица легко отделяется от литой агарозы, в результате чего патч толщиной 1'u20122 мм, содержащий несколько сфероидов, которые могут быть дополнительно обработаны для ИФ-окрашивания и визуализации с помощью конфокальная микроскопия. Это может выявить различные вторжения клеток и клеточной матрицы взаимодействия в высокой пропускной способности скрининга. Кроме того, клетки в коллагеновой матрице могут быть изолированы после пищеварения коллагена и разной диссоциации клеток для последующего культивирования клеток или анализа.

Для IHC-анализа сфероидовпосле фиксации и секционирования агарозного отливки обнаруживаются белки или другие молекулы, представляющие интерес, сохраняя при этом географическое положение сфероидов. В описанной здесь подходе сфероиды непосредственно встроены в гидроксиэтил агарозный гель для обработки агарозы, а гель служит «крышкой» для удержания сфероидов в нижней части микроуровн. После встраивания парафина агарозы^{литые 20}, серийный горизонтальный раздел выполняется с нижней части литой выступающей в качестве отправной точки.

Этот подход контрастирует с обычным IHC секционирование сфероидов, что требует сбора клеток перед встраиванием в Гидроксиэтил^{агарозы обработки геля 21 и рискует} нарушения сфероидов, таким образом, потеряв пространственное расположение клеток. Кроме того, фракционирование клеток центрифугой для оценки того, проникновения иммунных клеток или остается периферической для^{опухолевых сфероидов 17, избегается} путем прямого встраивания.

Кроме того, 3D-ко-культура может быть выполнена путем смешивания опухоли, стромальных или иммунных клеток, и, таким образом, изучение опухолевых клеток перекрестный разговор или recapitulating различных микроокнороний опухоли для анализа клеточно-клеточных взаимодействий, включая совместно культуры с эндотелиальными^{клетками 16}.

Этот 3D сфероид со-культуры настройки могут быть использованы для выполнения совместной культуры различных типов клеток, присутствующих в микроэквиронации опухоли и для оценки последствий измененных элементов ECM. Кроме коллагена типа I, другие компоненты ECM (например, матригель, матригель/коллагеновые смеси, фибронектин), могут быть использованы, так как вторжение опухолевых клеток влияет на обилие различных субстратов²². Кроме того, микровеллы агарозного отлитого подходят для формирования сфероидов первичных клеточных линий и для клеток с низкоклеточной адгезией.

протокол

Список и объяснение некоторых часто используемых слов на протяжении всего протокола можно найти в дополнительном файле 1.

1. Поколение сфероидов

Подготовка и автоклав 2% агарозы в 1x PBS (например, 1 г агарозы в 50 мл 1x PBS) и автоклав 35- и 81-микроуэлл резиновые формы.
ВНИМАНИЕ: Избегайте использования низкоплавильной агарозы для генерации агарозных слепок для обработки IHC.
Подготовка агарозы бросает
ПРИМЕЧАНИЕ: 35-микроуэлл бросает используются для вторжения, иммунофторесценции (IF) и изоляции клеток анализы. 81-микроуэлл бросает используются для цитотоксичности, иммуногистохимии (IHC), клеточной изоляции и анализа экстракции РНК.
1. После того, как агароза была autoclaved, пусть расплавленной агарозы остыть примерно до 60'u201270 КК. В капюшоне клеточной культуры используйте асептическую технику и пипетку 500 МКЛ расплавленной агарозы в 81-микроуэлл резиновой плесени на колодец или 330 МКЛ в 35-микроуэлл резиновой плесени на колодец.
  ВНИМАНИЕ: Избегайте создания пузырьков при смешивании или трубчатой агарозы. Удалите пузырьки, аккуратно трубчатые.
2. После того, как агароза затвердевет, тщательно сгибайте резиновую форму, чтобы удалить из нее агарозу. При этом, поместите руки выше соответствующих хорошо пластины и пусть агароза литые падение прямо в один колодец хорошо пластины.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Flex резиновой формы в разных положениях, с тем чтобы избежать чрезмерного сгибания. Это может быть полезно, чтобы сгибать резиновую плесень и нажмите осторожно снизу в то же время.
3. Чтобы уравночные отливки агарозы, добавьте клеточной культуры среды, состоящей из DMEM дополняется 10% плода бычьей сыворотки (2,5 мл / хорошо для 12-хорошо пластины и 1 мл / хорошо для 24-хорошо пластины). Поместите хорошо пластину в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) и инкубировать в течение 1 ч.
Между тем, подготовить клеточной культуры для посева.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий номер посева клеток на агароуз литые должен быть решен следователем. Для murine первичных линий раковых клеток поджелудочной железы, 35000 клеток / 35-микроуэлл литые и 81000 клеток / 81-микроуэлл литые (в среднем 1000 клеток / сфероидов) посеяны для всех следующих анализов. Средний диаметр сфероида составляет около 150–2012200 мкм после 48 ч.
Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки сначала наклоняя хорошо пластины. Затем аккуратно удалите среду в посевной камере.
Тщательно семян подготовленных опухолевых клеток подвески падение мудрым в камеру посева клеток. Аккуратно поместите хорошо пластину обратно в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага клетки будут оседать в микролагов агарозы литой.
Добавьте дополнительную среду к внешней стороне отлитого агарозы (2,5 мл/хорошо для 12-хорошо пластины и 1 мл/хорошо для 24-хорошо пластины).
Положите хорошо пластины обратно в инкубатор культуры клеток (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) для 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает до нескольких часов для клеток, чтобы сформировать сфероиды в микроуэллах. В целом, твердые сфероиды опухолевых клеток образуются после 24 ч и стабильны после 48 ч. Тем не менее, это может варьироваться между различными линиями клеток. При необходимости измените среду клеточной культуры, тщательно наклонив хорошо пластину с агарозой бросает и удаления окружающей среды культуры клеток с P1000 пипетки. Затем аккуратно добавить свежие среды, трубя его вдоль стены хорошо. Обычно нет необходимости менять средства массовой информации в отлитиях из-за его небольшого объема и риска удаления сфероидов.

2. Со-культура с Т-ячейками

Resuspend необходимое количество Т-клеток в 75 йл (35-микроуэлл литые) или в 190 йл (81-микроуэлл литые) соответствующих Т-клеток культуры среды (RPMI дополнен 10% плода крупного рогатого скота сыворотки и 100 единиц / МЛ пенициллин / стрептомицин).
Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки во-первых, наклоняя хорошо пластины. Затем медленно и осторожно удалить среду в литых мягко ориентации один угол посевной камеры с P200 пипетки, сохраняя при этом хорошо пластины наклонена с другой стороны.
(Критический шаг 1) Поскольку существует риск удаления сфероидов, контроль за потерей сфероидов путем сравнения количества сфероидов в микроуэллах до и после удаления среды при просмотре под микроскопом при 10-х увеличении.
Тщательно семян Т-клеточной подвески падение мудрым в посевной камере агарозы бросили, удерживая P200 пипетки около 0,5 см выше литой.
(Критический шаг 2) Существует риск промывки сфероидов при добавлении Т-клеток. Поэтому очень важно добавлять Т-клетки очень медленно и примерно на 0,5 см выше посевной камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна из возможностей уменьшить количество промытых сфероидов, указывая пипетки на один угол посевной камеры при добавлении Т-клеток, таким образом, только рискуя сфероидов в этом углу, чтобы быть вымываются.
Аккуратно поместите хорошо пластину обратно в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) в течение 15 минут.
Возьмите хорошо пластины из инкубатора и добавить свежие среды культуры клеток (RPMI дополняется 10% плода бычьей сыворотки и 100 единиц / МЛ пенициллин / стрептомицин) вокруг агарозы бросили медленно трубопроводов его вдоль стены хорошо.
Положите хорошо пластины обратно в инкубатор культуры клеток на 48 ч.

3. Встраивание 3D-ко-культуры в коллагеновую матрицу типа I

Подготовка нейтрализованного коллагена типа I
1. Разбавить бульон коллагена с сывороткой свободной среды базы (RPMI) до окончательной рабочей концентрации 3 мг/мл. На каждые 100 мкл разбавленного коллагена добавляйте 11 МКЛ 10х ПББ и 1,2 МЛ 1 М гидроксида натрия (NaOH).
2. Держите на льду и инкубировать (нейтрализовать) в течение 1 ч.
Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки во-первых, наклоняя хорошо пластины. Затем медленно и осторожно удалите среду в гипсе, аккуратно нацелив один угол посевной камеры с помощью пипетки P200, сохраняя при этом хорошо наклоненный пластиной с другой стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, очень важно, чтобы полностью удалить клеточной культуры среды, окружающие агарозы литой.
Тщательно пипетки нейтрализованного коллагена я смешиваю капли мудрый в посевной камере агарозы бросили, держа P200 пипетки около 0,5 см выше литой.
Положите хорошо пластины сразу в инкубатор культуры клеток в течение 4 мин (35-микроуэлл литые) или 5 мин (81-микроуэлл литой).
ВНИМАНИЕ: (Критический шаг 3) Очень важно строго придерживаться данного времени инкубации. В противном случае, инвазивное поведение не может быть воспроизведено.
Переверните хорошо пластину и оставьте ее в инкубаторе на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слепки будут оставаться прикрепленными к нижней части хорошо пластины из-за поверхностного натяжения. В случае использования специальной клеточной культуры среды с высокой концентрацией сыворотки (например, RPMI, дополненная 20% сыворотки крупного рогатого скота плода), для увеличения поверхностного натяжения может потребоваться дополнительный шаг мытья с 1x PBS после удаления среды в хорошо.
Возьмите хорошо пластины из инкубатора и инвертировать его обратно. Добавить свежие клетки культуры среды (RPMI дополняется 10% плода бычьей сыворотки и 100 единиц / МЛ пенициллин / стрептомицин) вокруг агарозы бросили медленно трубопроводов его вдоль стены хорошо.
Положите хорошо пластины обратно в инкубатор культуры клеток на 48 ч.

4. Анализ цитотоксичности

Подготовка 3 мл 1x PBS с 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота на агарозу литой.
После совместной культуры для 4 d, удалите клеточной культуры среды, окружающие агарозы литые с P1000 пипетки, слегка наклоняя хорошо пластины с другой стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий период времени совместной культуры должен решаться следователем.
Распределите 1 мл 1x PBS и 2% FBS с P1000 пипеткой в посевную камеру, чтобы выбить сфероиды из микроуровн.
Повторите шаг 4.3 дважды с объемом в колодец и перенесите его в 15 мл трубки.
Центрифуга трубки при температуре 300 х г при 10 с при комнатной температуре (RT).
Аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки P1000.
Вымойте клетки, добавив 1 мл 1x PBS с 2% FBS и центрифуги на 300 х г в течение 1 мин на RT.
Повторите шаг стирки (шаг 4.7).
Удалите супернатант и добавьте 1 мл раствора ферментов диссоциации клеток (см. таблицу материалов).
Используйте P200 пипетки и пипетки вверх и вниз, чтобы сломать ячейки кластеров.
Инкубировать клетки в течение 20 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO_2).
Повторите шаг 4.10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 10 фунтов стерлингов и семена на блюдо клеточной культуры, чтобы наблюдать (под микроскопом при 10x увеличении), насколько хорошо сфероиды рассеялись в одиночных клетках. При необходимости добавьте 5 минут дальнейшей инкубации.
Добавьте 4 мл полной клеточной культуры среды (RPMI дополняется 10% сыворотки крупного рогатого скота плода и 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина) и перемешать путем инвертирования трубки 3'u20124 раз.
Центрифуга при 400 x g в течение 4 мин на RT.
Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в буфер FACS для окрашивания апоптотических клеток Annexin V.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсюда можно провести любое окрашивание FACS и анализ клеток.

5. Гидроксиэтил агароза обработки гель встраивания для раздела IHC

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь очень важно, чтобы избежать использования низкоплавильных агарозы для генерации агарозы бросает.

В конце совместной культуры, удалить клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки сначала наклоняя хорошо пластины. Затем медленно и осторожно удалить среду в литых мягко ориентации один угол посевной камеры с P200 пипетки, сохраняя при этом хорошо пластины наклонена с другой стороны.
Медленно пипетка 10% формалин первый в посевной камере, осторожно ориентации один угол посевной камеры с P200 пипетки. Затем добавьте 10% формалин к внешней стороне агарозы литые до тех пор, пока она полностью покрыта. Исправить агарозы бросили в 10% формалин для 1 d.
Удалите формалин на следующий день.
Тщательно пипетка 210 йл (81-микроуэлл литые) или 100 йл (35-микроуэлл литые) предварительно разогретой и сжиженной гидроксиэтил агарозы обработки геля (см. Таблица материалов) дроп-мудрый в посевной камере агарозы бросили, удерживая P200 пипетки около 0,5 см выше литой.
Пусть гидроксиэтил агарозы обработки гель затвердеть в течение 10 мин на RT.
Передача агарозы литые в 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более длительного хранения, вставлять литые в 70% этанола для предотвращения загрязнения.
Обезвоживаемые секции геля через серию этанола (1 ч каждый: 70% этанола, 80% этанола, 95% этанола, 100% этанола (3x изменения каждый). Затем очистите в клиринговом растворе 3x по 1 ч каждый (например, алифатические углеводороды (например, Клирит) или ксилены), и проникните с расплавленным парафином (3x по 1 ч каждый), либо вручную, либо в тканевой процессер. Встраивание литых в парафиновый воск для последующего сечения на 5 мкм на секцию.
Удалите воск, поставив слайды в ксилены, 3x в течение 3 минут каждый, а затем регидратировать ткани разделов через градуированных серии алкоголя: 100% этанола в течение 2 мин, 95% этанола в течение 1 мин, 80% этанола для 30 с и 70% этанола в течение 30 с, а затем поместить в воду.
Выполните тепловой индуцированный эпитоп поиска в овощном пароходе при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 20 минут, а затем 20 мин охлаждения в 10 мМ цитрат рН 6,0 раствора и блок эндогенных пероксид с H₂O₂.
Блокируйте секции с нормальной сывороткой цели и подвергайте их антителам anti-CD8 (разбавлению 1/25) всю ночь.
Применение анти-кролик-HRP спряженных вторичных антител (см. Таблица материалов) и развивать окрашивание с помощью 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) хромаген. Counterstain ядра с 11% Харрис гематоксилин решение (см. Таблицу материалов).

6. Мониторинг и анализ нашествия сфероидов в совместной культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Время точки изображения сфероидов вторжения в матрицу коллагена I должен быть решен следователем. Приобретайте изображения клеточной культуры с помощью перевернутого микроскопа с 10-х увеличением. Идеальная точка времени зависит от тесту линии ячейки, а также от компонента ECM. Более инвазивные клеточные линии начнут распространяться в коллаген в течение нескольких часов после добавления коллагена. Так как Т-клетки в совместной культуре может предотвратить полный вид на выход из сфероидов в очень ранние моменты времени, как правило, изображения принимаются на 0 ч (в качестве ссылки), 24 ч и 48 ч после добавления коллагена.

Квантитатная инвазивность путем ручного подсчета количества "шипов", высовыхающихся из сфероида и/или с помощью программного обеспечения для анализа изображений, например, Изображения J.
1. Анализируйте вторжение как количество «шипов» из сфероида, вручную подсчитывая количество «шипов» сфероида.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть решено следователем, какие выступы из сфероидов рассматриваются как "шипы". Критерием принятия решения может быть длина "шипа", измеряемая от края сфероида.
2. Проанализируйте вторжение как область вторжения относительно размера сфероида.
  1. Используйте инструмент Freehand Draw Tool (Изображение J) для отслеживания границы общей площади (вторжение и сфероидная область).
  2. Нажмите Проанализируйте верхнее меню, а затем нажмите Мера для отображения измерения области.
  3. Отслеживаем границу общей сфероидной области.
  4. Нажмите Проанализируйте верхнее меню, а затем нажмите Мера для отображения измерения области.
  5. Скопируйте измеренный список результатов в электронную таблицу и вычислите общее вторжение/сфероид с помощью формулы: полное вторжение - общая площадь/сфероидная область.

7. Иммунофлуоресценция окрашивания

Подготовьтесь к следующему.
1. Приготовьте 5,4% формалин (5 мл) с использованием 2,3 мл 1x PBS и 2,7 мл 10% формалина.
2. Приготовьте 0,5% октосинола (50 мл) с использованием 50 мл 1x PBS и 2,5 мл 10% октосинола (магазин на RT).
3. Подготовка IF Buffer (200 мл) с использованием 200 мл 1x PBS, 200 мг бычьего сыворотки альбумин (BSA), 4 мл 10% октосинола, 1 мл 10% полисорбата 20 (разогрева до RT перед использованием; фильтр и хранить при 4 градусов по Цельсию).
4. Подготовь блокирующий раствор (5 мл) с помощью 5 мл IF Buffer и 500 МКЛ козьей сыворотки (разогревайте до RT перед использованием).
5. Держите 8-хорошо камерные слайды, стеклянные крышки, и монтажные средства массовой информации готовы.
День 0
1. Исправить весь агарозный литые, в том числе сфероиды, на ночь в 5,4% формалин на RT в увлажненной камере.
День 1
1. Удалите клеточной культуры среды окружающих агарозы литые с P1000 пипетки, наклоняя хорошо пластины.
2. Передача коллагена патч в 8-хорошо камерный слайд, хватая угол коллагеновой матрицы в камере посева агарозы литые с гладким остроконечный кончик пинцета и очистить его от агарозы бросили в одном, уверенное движение.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген патч должен быть легко отделен от агарозы литой. В противном случае, используйте P1000 пипетки, чтобы тщательно добавить культуру среды в области посевной камеры или инвертировать агарозы литые и осторожно встряхнуть хорошо пластины, чтобы выбить коллагеновой матрицы.
3. Добавьте 250 йл 0,5% октосинола (см. таблицу материалов)за колодец. Инкубация в течение 1 ч на RT.
4. Аспирировать октосинол и добавить 250 мкл блокирующего раствора на колодец. Блок на 1 ч на RT.
5. Между тем, разбавить первичное антитело (разбавление для анти кератина 8: 1/500; Фаллоидин 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) в блокирующего растворе, расчет на 250 мкл на колодец.
6. Добавьте первичное антитело в блокирующий раствор и поместите камеру слайда во увлажненной камере для ночной инкубации на RT.
День 2
1. Удалите первичное антитело в блокируя раствор, аспирируя.
2. Вымойте 3 раза, добавив 300 йл IF Buffer и дайте ему сидеть в течение 5 минут на RT.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Просто дайте ему сидеть, нет необходимости ставить его на шейкер.
3. Разбавить вторичное антитело в блокирующий раствор (для анти кератина 8: анти-крыса, разбавление 1/500).
4. Добавьте 250 МКЛ вторичного антитела в блокирующий раствор к каждой колодец и инкубировать в течение 1 ч на RT. С этого далее защитите образцы от света.
5. Удалите вторичное антитело в блокируя раствор, аспирируя.
6. Вымойте 3 раза с 300 йл IF Buffer, добавив, и пусть он сидит в течение 5 минут на RT.
7. Промыть образцы с 1x PBS и аспирировать его.
8. Аккуратно снимите стенки камерного слайда так, чтобы в нижней части осталось только стеклянное горку.
9. Добавьте по крайней мере 200 МКЛ монтажных средств массовой информации в стеклянную крышку и медленно уронить крышку над образцом.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте создания пузырьков, так как это повлияет на качество изображения. Пузыри можно предотвратить, аккуратно поместив крышку скольжения на длинный край слайда под углом 45 "или медленно опуская крышку скольжения на слайде.
10. Положите установленные образцы в темное и сухое место и дайте ему посидеть на ночь. Изображение может быть выполнено на следующий день.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Coverslip может первоначально сдвиг немного один раз размещены на коллагена патч. Пусть стеклянная горка сидеть на равномерной площади в течение нескольких минут. Обложка выровняет образец так, чтобы не было разрыва между стеклянным слайдом и крышкой с течением времени.

8. Изоляция клеток от коллагеновой матрицы

Подготовьтесь к следующему.
1. Подготовка 1 мг/мл коллагеназы 4 в сывороткесодержащей клеточной культуры среды (магазин aliquoted коллагеназы 4 разбавления при -20 градусов по Цельсию)
2. Подготовка 2,5% BSA в 1x PBS и пальто все трубки и пипетки советы с ним (фильтр BSA решение перед использованием).
3. Предварительное решение BSA и среда клеточной культуры перед использованием.
Приготовьте 2 мл раствора коллагеназы 4 (1 мг/мл), чтобы переварить максимум три коллагеновых матрицы из 35-микроуэлловых отливок агарозы.
Передача до трех матриц коллагена 75 МКЛ из 35-микроуэлл агарозы бросает в 2,5% BSA предварительно покрытием 15 мл трубки. Возьмитесь за угол коллагеновой матрицы в камере посева агарозы, отлитой гладким заостренным кончиком пинцета, и снимите его с агарозы, отлитой одним, уверенным движением.
Bevel-вырезать кончик P1000 отзыв с ножницами. Предварительно пальто оставшийся кончик с 2,5% BSA и сломать коллагеновой матрицы как можно больше, трубя вверх и вниз. Инкубировать трубку в течение 15 мин при 37 градусов по Цельсию.
(Критический шаг 4) Каждые 5 минут проверяйте, растворилась ли коллагеновая матрица. Pipette вверх и вниз снова, прежде чем принимать 10 йл образца и семян его на блюдо клеточной культуры для наблюдения под микроскопом в 10x увеличение. Добавьте еще 5 минут, если это необходимо.
Заполните трубку 10 мл довоенной клеточной культуры среды (DMEM дополняется 10% сыворотки крупного рогатого скота плода). Аккуратно перемешайте трубку 3'u20124 раз.
Центрифуга трубки на 400 х г в течение 4 мин на RT.
Аккуратно снимите супернатант и оставьте 2 мл объема.
(Критический шаг 5) Оставьте 2 мл после первого шага центрифугации, так как в нижней части трубки все еще может быть неразрешеный коллаген, несущий клетки вдоль них.
Выполните два шага мытья, добавляя 10 мл сыворотки, содержащей клеточной культуры среды каждый раз. Центрифуга каждый раз на 400 х г в течение 4 мин на RT.
После последнего шага стирки, удалить как можно больше среды, как это возможно, и оставить только ячейки гранулы.
Повторное разрешение клеточной гранулы в 1 мл раствора ферментов диссоциации клеток (см. таблицу материалов).
Используйте P200 пипетки и пипетки вверх и вниз, чтобы сломать ячейки кластеров.
Инкубировать клетки в течение 20 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 градусов по Цельсию, 5% CO_2).
Повторите шаг 8.13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 10 фунтов стерлингов и семян на блюдо клеточной культуры наблюдать под микроскопом в 10x увеличение, чтобы посмотреть, насколько хорошо сфероиды разобщены в одиночные клетки. При необходимости добавьте 5 минут дальнейшей инкубации.
Добавьте 4 мл клеточной культуры среды (DMEM дополнено 10% сыворотки крупного рогатого скота плода) и перемешайте трубку 3'u20124 раз.
Центрифуга при 400 x g в течение 4 мин на RT.
Удалите супернатант. Отсюда и далее, FACS окрашивания или клеточной культуры могут быть выполнены.

9. Извлечение РНК из коллагеновой матрицы

Подготовка гуанидиния тиоцианата с фенолом (см. Таблица материалов ),100% хлороформ, 70% RNase без этанола, РНК-экстракции комплект (см. Таблица материалов ),RNase-бесплатно 1,5 мл труб, RNase-бесплатно 15 мл труб и RNase-бесплатно ddH₂O.
Передача до двенадцати матриц коллагена 190 йл из 81-микроуэлла агарозы бросает в 15 мл трубки. Возьмитесь за угол коллагеновой матрицы в камере посева агарозы, отлитой гладким заостренным кончиком пинцета, и снимите его с агарозы, отлитой одним, уверенным движением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрицы также могут быть заморожены при -80 градусов по Цельсию до готовности к экстракции РНК.
Добавьте 1 мл гуанидиния тиоцианата с фенолом (см. Таблицуматериалов) в коллагеновые матрицы в 15 мл трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гуанидиний тиоцианат с фенолом должен полностью покрывать коллагеновые матрицы.
Вихрь труб для 10'u201220 s.
Гомогенизировать матрицы с 20 G иглы и 5 мл шприцев, пока они полностью не растворяются.
Пусть матрицы сидят в течение 5 минут на RT.
Добавьте 200 мкл чистого хлороформа в матрицы и встряхните трубку энергично в течение 15 с.
Немедленно перенесите смесь на трубы 1,5 мл.
Пусть смесь сидеть, по крайней мере 5 мин на RT, пока фазы разделены.
Центрифуга 1,5 мл труб при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию.
Заполните новую трубку 1,5 мл с 500 л 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема aqueous фазы после центрифугации (см. шаг 9.12. это не может быть 500 МЛ. Количество этанола 70% должно быть равно объему аквеозной фазы.
Тщательно перенесите верхнюю aqueous фазу центрифугированных образцов к 70% этанол-заполненной пробке и перемешайте тщательно pipetting вверх и вниз.
(Критический шаг 6) Будьте осторожны, чтобы не нарушить слои в нижней части гуанидиния тиоцианата с фенол разделения при удалении верхней фазы, так как это будет загрязнять РНК.
Добавьте образец в столбец извлечения РНК (включен в комплект извлечения РНК, см. Таблицу материалов). С этого же далее следуйте протоколу производителя по очистке РНК от клеток.

Результаты

Модель 3D совместной культуры позволяет проводить различные анализы, показанные на рисунке 1A,которые могут быть объединены или изменены по мере необходимости. В нашей установленной экспериментальной установки, опухоли и Т-клетки совместно культуры в течение 2 дней с по?...

Обсуждение

Представленный здесь метод описывает 3D-генерацию сфероидов опухоли, которая позволяет совместно культурироваться с Т-клетками, функциональными и молекулярными анализами на основе клеток, а также различными возможностями мониторинга и анализа с помощью одного устройства. Основным пр...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Виржини Ой, доктора философии, за полезные дискуссии и советы по подходу к 3D-модели совместной культуры. Мы также благодарим Элизабет Джонс за отличную техническую помощь в разделе IHC. Это исследование было поддержано грантами от DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) для YL (LI 2547/4-1) и Национальных институтов здравоохранения AW (R01 CA23 1291), ATR (R01 CA205632), GWP (R01 CA218670) и основной грант онкологического центра (P30 CA51008).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols