3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

요약

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

초록

많은 수의 암이 치료에 저항하는 남아 있지만 면역 요법으로 암 치료에 상당한 진전이 있었습니다. 제한된 수의 아세약은 종양과 면역 세포 사이의 상호 작용에 대한 직접적인 모니터링 및 기계론적 통찰력을 허용하며, 그 중 T 세포는 적응형 면역 계통의 세포 독성 반응을 암세포에 실행하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 아세약은 상대적으로 사용이 용이하기 때문에 세포의 2차원(2D) 공동 배양을 기반으로 하지만 암세포의 특징 중 하나인 침습적인 성장 표현형의 제한된 표현으로 인해. 현재 3차원(3D) 공동 배양 시스템은 공동 배양 된 암세포의 침입과 T 세포 상호 작용에 대한 특수 장비 또는 별도의 모니터링이 필요합니다.

여기서 우리는 공동 배양에서 암 세포 스페로이드 및 T 세포 중독의 3D에서 침습적 행동을 동시에 모니터링하는 접근법을 설명합니다. 스페로이드 형성은 U자형 바닥으로 비계가 없는 아가로즈 마이크로웰 캐스트에서 향상된 세포 세포 상호 작용에 의해 구동됩니다. T세포 공동배양및 암세포 침입을 모두 타입 I 콜라겐 매트릭스로 하여 세포를 전송할 필요 없이 아가로즈 캐스트의 마이크로웰 내에서 수행되므로 분석 전반에 걸쳐 온전한 3D 공동 배양 시스템을 유지한다. 콜라겐 매트릭스는 아가로즈 주조에서 분리될 수 있어 면역형광(IF) 염색 및 세포의 공초점 이미징을 허용한다. 또한, 세포는 유전자 발현 또는 형광 활성화 세포 선별(FACS)과 같은 추가 성장을 위해 격리되거나 분석될 수 있다. 마지막으로, 3D 공동배양은 면역히토화학(IHC)을 포함시키고 단면화한 후에 분석될 수 있다. 분석의 가능한 변형은 암세포를 가진 상이한 기질 또는 면역 세포의 포함뿐만 아니라 세포외 매트릭스 (ECM)의 변경 된 조성물을 포함한다.

서문

지난 10 년간 암 면역 요법에 있는 중요한 개선에도 불구하고, 처리에 감도 그리고 저항의 우리의 기계적인 이해는 아직도 상당히 가난한^1입니다. 종양이 상당한 이질성을 표시하고, 면역 세포뿐만 아니라 자신의 마이크로 환경과 종양 세포의 동적 상호 작용이 종양 세포 사멸에 영향을 미치고, 침습적 행동및 면역 요법^1,,2,3을3포함하는 치료에 대한 반응이 잘 확립된다. 적응형 면역 계통의 한 팔로, T 세포는 세포 특정 세포 독성을 실행합니다. T 세포 인식 및 암세포에 대한 반응의 분석은 면역 변조 치료에 대한 저항과 민감성에 대한 기계적 통찰력을 제공합니다.

적절한 환경에서 암과 T 세포 사이의 체외 모델링 및 모니터링 상호 작용은 도전적이고 지금까지 제한된 기계론적 통찰력을 초래했습니다. 대부분의 세포 기반 아세약은 2차원(2D) 환경에 의존하며, 생체 내^{생리학 4,5,6,6}공간 세포 상호 작용, 세포 외 매트릭스(ECM)와의^접촉,세포 외 세포⁷세포 상호 작용, 세포 외 세포(ECM)와의 접촉, 동적 대사 수요, 대량^성장(TME)및 마이크로환경(TME)의 효과로 인한 저산소증(TME) 및 마이크로환경(TME)의 효과에 따라 3차원(3D)을 재구성하는 데 중요한 주요 특징이 부족하다.⁹ 한편, 현재 사용되고 있는 3차원(3D) 공동배양 및 침입 분석 시스템과는 여전히 많은 단점이 있다: (1) 스페로이드 생성및^수확5,,10,(2) 스페로이드 크기에 대한 제어부족, 형상 및 세포^{밀도(11)12,}(3) 저처리량 형 어설약, (4)^{특수장비(13)14,14}(5) 상이한 형상을 위한 뚜렷한 환경으로 공동배양을 전송할 필요가 있다^15,,16,,17. 특히, 공동 문화 분석의 전송은 종종 스페로이드의 붕괴와 공동 문화 무결성의 손실로 이어진다. 이것은 감소된 세포 세포 접착을 가진 "느슨한" 스페로이드에 특히 적용됩니다. 예를 들어, 대부분의 3D 침입 소법은 스페로이드가 초기 형성 후 수확한 다음 ECM^14,,15,,16에서 다시 중단될 것을^{요구한다.} 이 재서스펜션 단계는 스페로이드 사이의 거리를 제어하지 않습니다. 종양 스페로이드 사이의 거리가 침습적 행동에 영향을 미치기 때문에, 이러한 통제 상실은 높은 간 분석 차이를 유발하고 재현성을 감소시킵니다. 더욱이, 세포 분획 의 적용은 면역 세포에 침투하는 말초 및 종양 스페로이드의 평가를 위한 연속원심분리 단계에 의해 보다 안정적인 스페로이드를 생성하는 종양 세포 집단으로^{제한된다(17).}

개념 및 접근 방식

우리의 접근 방식은 후속 에세이를 위해 스페로이드의 전송을 요구하지 않는 "All-in-One"-3D 스페로이드 공동 배양 모델을 사용하여 위에서 언급 한 결함을 해결합니다. 우리는 결합된 T 세포의 암세포의 침습적 행동과 세포 독성을 동시에 모니터링하기 위한 분석서를 생성하기 위해 스페로이드 형성 장치(재료표참조)를 조정했습니다. 이 방법은 사용자 친화적이고 저렴하며 비교적 높은 처리량 3D 설정에서 빠르고 쉽게 처리 할 수 있습니다. 사용되는 장치의 유형에 따라, 최대 81개의 큰 균일한 크기의 스페로이드는 시드된 셀 수를 수정하여 개별 스페로이드 크기를 제어하여 단일 파이펫팅 단계에서 생성될 수 있다. 스페로이드 형성은 U자형 바닥으로 비계가 없는 아가로즈 멀티웰 캐스트에서 향상된 세포 세포 상호 작용에 의해 강요됩니다. 당사는 형광 활성 세포 선별(FACS), 면역형광(IF) 또는 면역히스토케(IHC) 염색뿐만 아니라 그대로 3D 공동 배양의 유전자 발현 분석을 포함하는 종점 분자 및 생화학적 분석을 위한 이 3D 시스템을 조정했습니다.

기능적 연구를위해, 아가로즈 캐스트 내에 제1형 콜라겐에 스페로이드를 삽입하면 등평성 스페로이드로부터 암세포를 침범시키고 단일 세포 대 집단세포^{이동(18,19)과}같은 필수 세포주 별 특징을 모니터링할 수 있다.^, 더욱이, 콜라겐 매트릭스는 아가로즈 주조에서 쉽게 분리되어, 다중 스페로이드를 포함하는 1\u20122 mm 두께 패치가 생성되어, 이는 공초점 현미경검사에 의해 IF 염색 및 이미징을 위해 추가로 처리될 수 있다. 이것은 높은 처리량 검열에 있는 명백한 세포 침략 및 세포 매트릭스 상호 작용을 드러낼 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스내의 세포는 후속 세포 재배 또는 분석을 위해 콜라겐 소화 및 단일 세포 해리 후 분리될 수 있다.

스페로이드의 IHC 분석을위해, 아가로즈 주조의 고정 및 단면 후, 단백질 또는 관심의 다른 분자는 스페로이드의 지리적 위치를 유지하면서 검출할 수 있다. 여기서 설명된 접근법에서, 스페로이드는 아가로즈 주조 내의 하이드록스테틸 아가로즈 가공 젤에 직접 내장되어 있으며, 겔은 마이크로웰의 바닥에 스페로이드를 유지하기 위한 "뚜껑"의 역할을 한다. 아가로즈^{캐스트(20)의}파라핀 포함 후, 직렬 수평 단면은 캐스트의 바닥으로 시작점으로 수행된다.

이 접근법은 Hydroxyethyl 아가로즈 처리^젤(21)에 포함되기 전에 세포를 수확해야 하는 기존의 IHC 단면과 대조되며 스페로이드의 붕괴가 세포의 공간 적 배열을 잃을 위험이 있습니다. 또한, 면역 세포가 종양^{스페로이드(17)에} 침투하거나 말초로 남아 있는지 여부를 평가하기 위한 원심분리에 의한 세포 분획은 직접 적인 포함에 의해 피된다.

더욱이, 3D 공동배양은 종양, 기질 또는 면역세포를 혼합하여 수행될 수 있고, 따라서 종양 세포 상호작용을 연구하거나 내피세포와 공동 배양을 포함하는 세포 세포 상호 작용을 분석하기 위한 상이한 종양 마이크로환경을 재수량하여^16.

이러한 3D 스페로이드 공동 배양 설정은 종양 미세 환경에 존재하는 상이한 세포 유형의 공동 배양을 수행하고 변경된 ECM 요소의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있다. 제형 I 콜라겐 외에 다른 ECM 성분(예를 들어, 마트리겔, 마트리겔/콜라겐 혼합물, fibronectin) 종양 세포 침전이 상이한^{기판(22)의}풍부에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 사용될 수 있다. 또한, 아가로즈 주조의 마이크로웰은 1차 세포주 및 세포 세포 접착력이 낮은 세포에 적합한다.

프로토콜

프로토콜 전체에서 자주 사용되는 일부 단어에 대한 목록 및 설명은 보충 파일 1에서찾을 수 있습니다.

1. 스페로이드 생성

1. 준비 및 오토클레이브 2% 아가로즈 1x PBS(예: 1x PBS의 50mL에서 아가로즈 1g) 및 오토클레이브 35- 및 81 마이크로웰 고무 금형.
   주의: IHC 처리를 위한 아가로즈 캐스트를 생성하기 위해 저용 아가로즈를 사용하지 마십시오.
2. 아가로즈 캐스트 준비
   참고: 35 마이크로웰 캐스트는 침략, 면역 형광 (IF) 및 세포 격리 분석에 사용됩니다. 81 마이크로웰 캐스트는 세포 독성, 면역 조직 화학 (IHC), 세포 격리 및 RNA 추출 분석에 사용됩니다.
   1. 아가로즈가 오토클레이브된 후, 용융 아가로즈를 약 60\u201270°C로 식힙니다. 세포 배양 후드에서, 무균 기술과 파이펫 500 μL의 용융 아가로즈를 웰 당 81 마이크로웰 고무 몰드 또는 330 μL에 잘 당 35 마이크로웰 고무 금형에 사용합니다.
      주의: 아가로즈를 혼합하거나 파이펫팅하는 동안 거품을 만들지 마십시오. 부드럽게 파이펫팅하여 거품을 제거합니다.
   2. 아가로즈가 고화된 후 고무 몰드를 조심스럽게 구부려 아가로즈를 제거합니다. 이에 따라, 적절한 웰 플레이트 위에 손을 놓고 아가로즈 캐스트가 바로 잘 플레이트의 한 우물에 떨어지게하십시오.
      참고: 고무 금형을 다양한 위치에서 구부리면 굴곡이 과도하게 방지됩니다. 고무 금형을 구부리고 동시에 바닥에서 부드럽게 밀어 올리는 것이 도움이 될 수 있습니다.
   3. 아가로즈 캐스트를 평형화하기 위해, 10%의 태아 소 혈청(2.5mL/웰 12웰 플레이트용 2.5mL/웰,24웰 플레이트용 1mL/웰)으로 보충된 DMEM으로 구성된 세포 배양 배지를 추가한다. 잘 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에넣고 1h에 대해 배양한다.
3. 한편, 종향을 위한 세포 배양을 준비한다.
   참고: 아가로즈 캐스트당 총 셀 파종 수는 조사관에 의해 결정되어야 합니다. 뮤린 원발성 췌장암 세포주를 위해, 35,000개의 세포/35-마이크로웰 주조 및 81,000세포/81-마이크로웰 캐스트(평균 1000세포/스페로이드)는 모든 다음 분석서에 대해 시드된다. 스페로이드의 평균 직경은 48h 이후 약 150\u2012200 μm이다.
4. P1000 파이펫으로 먼저 잘 플레이트를 기울여 아가로즈 주조를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거한다. 그런 다음 조심스럽게 시드 챔버에서 매체를 제거합니다.
5. 준비된 종양 세포 현탁액을 세포 시납챔버에 조심스럽게 종자하였다. 15분 동안 잘 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에조심스럽게 넣습니다.
   참고 : 이 단계 동안 세포는 아가로즈 캐스트의 마이크로 웰에 정착합니다.
6. 아가로즈 캐스트의 외부에 추가 배지를 추가합니다 (12 웰 플레이트의 경우 2.5 mL / 잘, 24 웰 플레이트의 경우 1 mL / 웰).
7. 48h용 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에웰 플레이트를 다시 넣습니다.
   참고: 일반적으로 세포가 마이크로웰에 스페로이드를 형성하는 데 최대 몇 시간이 걸립니다. 일반적으로, 고형 종양 세포 스페로이드는 24 시간 후에 형성되고 48 시간 후에 안정적입니다. 그러나, 이것은 다른 세포주 사이에서 다를 수 있습니다. 필요한 경우, 아가로즈 캐스트로 웰 플레이트를 조심스럽게 기울이고 P1000 파이펫으로 주변 세포 배양 배지를 제거하여 세포 배양 배지를 변경한다. 그런 다음 웰의 벽을 따라 파이프를 통해 신선한 매체를 조심스럽게 추가하십시오. 일반적으로 작은 볼륨과 스페로이드를 제거할 위험으로 인해 캐스트 내에서 미디어를 변경할 필요가 없습니다.

2. T 세포와의 공동 배양

1. 75 μL(35-마이크로웰 캐스트) 또는 190 μL(81-마이크로웰 캐스트)에서 필요한 T세포 수를 적절한 T세포 배양 배지(RPMI는 10% 태아 소 혈청 및 100단위/mL 페니실린/연쇄절제술)로 재연한다.
2. P1000 파이펫으로 먼저 잘 플레이트를 기울여 아가로즈 주조를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거한다. 그런 다음 P200 파이펫으로 파종 챔버의 한 쪽 모서리를 부드럽게 타겟팅하여 다른 손으로 기울어진 잘 플레이트를 유지하여 캐스트 내의 매체를 천천히 조심스럽게 제거합니다.
3. (중요 단계 1) 스페로이드를 제거할 위험이 있기 때문에, 10배배율로 현미경으로 배지를 제거하기 전과 후에 마이크로웰 내의 스페로이드 수를 비교하여 스페로이드의 손실을 제어한다.
4. 조심스럽게 T 셀 서스펜션 드롭 -현명한 캐스트 위의 P200 파이펫을 잡고 캐스팅 아가로즈의 파종 챔버에 드롭.
5. (중요 단계 2) T 세포를 추가하는 동안 스페로이드를 플러시의 위험이 있다. 따라서, T 세포를 매우 느리게 그리고 파종 챔버 위에 약 0.5 cm를 추가하는 것이 중요하다.
   참고: 스페로이드를 플러시하는 수를 줄이는 한 가지 가능성은 T 세포를 추가하는 동안 파종 챔버의 한 구석으로 파이펫을 가리키는 것으로, 따라서 이 모서리에 있는 스페로이드만 플러시될 위험이 있습니다.
6. 15분 동안 잘 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에조심스럽게 배치합니다.
7. 인큐베이터에서 잘 플레이트를 꺼내 신선한 세포 배양 배지(RPMI는 10% 태아 소 혈청과 100단위/mL 페니실린/연쇄절제술)를 우물의 벽을 따라 천천히 배관하여 주조하여 주조합니다.
8. 48 h에 대한세포 배양 인큐베이터에 다시 잘 플레이트를 넣어.

3. 3D 공동 배양을 I형 콜라겐 매트릭스에 포함

1. 중화 타입 I 콜라겐 준비
   1. 혈청 프리 베이스 매체(RPMI)로 스톡 콜라겐을 3 mg/mL의 최종 작동 농도로 희석합니다. 희석 된 콜라겐의 100 μL마다 10 x PBS의 11 μL과 1.2 μL 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)을 추가하십시오.
   2. 얼음을 유지하고 1 시간 동안 인큐베이션 (중화)하십시오.
2. P1000 파이펫으로 먼저 잘 플레이트를 기울여 아가로즈 주조를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거한다. 그런 다음, P200 파이펫으로 파종 챔버의 한 쪽 모서리를 부드럽게 타겟팅하여 주조 내의 매체를 천천히 조심스럽게 제거하면서, 다른 손으로 기울어진 잘 플레이트를 유지한다.
   참고: 여기서, 아가로즈 캐스트를 둘러싼 세포 배양 배지를 완전히 제거하는 것이 중요하다.
3. 중화 콜라겐을 조심스럽게 피펫하여 주조된 아가로즈의 파종 챔버에 드롭 와이즈를 혼합하여 P200 파이펫을 주조하여 주조시 보다 약 0.5cm 높이로 유지한다.
4. 잘 플레이트를 즉시 세포 배양 인큐베이터에 넣고 4분(35마이크로웰 캐스트) 또는 5분(81마이크로웰 캐스트)을 한다.
   주의: (중요한 단계 3) 주어진 잠복시간을 엄격하게 유지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 침습적 동작이 재현되지 않을 수 있습니다.
5. 잘 플레이트를 반전하고 1 시간 동안 인큐베이터에서 뒤집혀 둡니다.
   참고: 주조는 표면 장력으로 인해 음판 의 바닥에 부착된 상태를 유지합니다. 혈청 농도가 높은 특수 세포 배양 배지(예: 20%의 태아 소 세럼으로 보충된 RPMI)가 사용되는 경우, 우물에서 배지를 제거한 후 1x PBS를 이용한 추가 세척 단계가 표면 장력을 높여야 할 수도 있다.
6. 인큐베이터에서 잘 접시를 꺼내 서 다시 반전. 신선한 세포 배양 배지(RPMI는 10% 태아 소 혈청과 100단위/mL 페니실린/연쇄절제술)를 우물의 벽을 따라 천천히 배관하여 주조하여 주조합니다.
7. 48h에 대한 세포 배양 인큐베이터에 다시 잘 플레이트를 넣어.

4. 세포 독성 분석

1. 아가로즈 캐스트 당 2 % 태아 소 세럼으로 1 x PBS의 3 mL을 준비합니다.
2. 4d에 대한 공동 배양 후, P1000 파이펫으로 주조된 아가로즈를 둘러싼 세포 배양 배지를 약간 기울여 다른 손으로 잘 기울어낸다.
   참고: 공동 문화의 총 기간은 조사관에 의해 결정되어야 합니다.
3. 1x PBS + 2% FBS를 파종 챔버에 P1000 파이펫으로 나누어 마이크로웰에서 스페로이드를 빼내십시오.
4. 우물의 부피와 함께 4.3 단계를 반복하고 15 mL 튜브로 옮김합니다.
5. 실온(RT)에서 10s동안 300 x g의 튜브원심분리기.
6. P1000 파이펫으로 상체를 조심스럽게 제거합니다.
7. 1x PBS 1mL에 2% FBS, 원심분리기를 300 x g에서 1분 동안 추가하여 세포를 세척합니다.
8. 세탁 단계(4.7 단계)를 반복합니다.
9. 상체를 제거하고 세포 해리 효소 용액 1mL을 추가하십시오(재료표참조).
10. P200 파이펫과 파이펫을 위아래로 사용하여 셀 클러스터를 분해합니다.
11. 세포 배양인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서20분 동안 세포를 배양한다.
12. 4.10 단계를 반복합니다.
    참고: ~10 μL을 꺼내 세포 배양 접시에 씨를 뿌리고 세포 배양 접시에 씨앗을 달아 (10배 배율로 현미경으로) 스페로이드가 단일 세포에서 얼마나 잘 해리되었는지 관찰하십시오. 필요한 경우 5분 더 추가 인큐베이션을 추가합니다.
13. 풀 세포 배양 배지 4mL(10% 태아소 혈청 및 100단위/mL 페니실린/연쇄절제술)을 넣고 튜브 3\u20124시간을 반전시켜 혼합합니다.
14. RT에서 4 분 동안 400 x g의 원심 분리기.
15. 상체를 제거하고 FACS 버퍼에서 세포를 다시 일시 중단하여 세포 세포의 부속서 V 염색을 합니다.
    참고: 여기에서 모든 FACS 염색 및 세포 분석을 수행할 수 있습니다.

5. IHC 단면에 대한 하이드록세틸 아가로즈 프로세싱 젤 포함

참고: 여기서는 아가로즈 캐스트를 생성하기 위해 저용 아가로즈를 사용하지 않는 것이 중요합니다.

1. 공동 배양의 끝에서, 잘 플레이트를 기울여 먼저 P1000 파이펫으로 주조된 아가로즈를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거한다. 그런 다음 P200 파이펫으로 파종 챔버의 한 쪽 모서리를 부드럽게 타겟팅하여 다른 손으로 기울어진 잘 플레이트를 유지하여 캐스트 내의 매체를 천천히 조심스럽게 제거합니다.
2. P200 파이펫으로 파종 챔버의 한 모서리를 부드럽게 타겟팅하여 파종 챔버에서 먼저 10% 포어틴을 천천히 피펫합니다. 그런 다음 아가로즈 캐스트의 외부에 10 % 포르말린을 완전히 덮을 때까지 추가합니다. 아가로즈 캐스트를 1d로 10% 포르말린으로 수정합니다.
3. 다음 날 포르말린을 제거합니다.
4. 조심스럽게 피펫 210 μL (81 마이크로 웰 캐스트) 또는 100 μL (35 마이크로 웰 캐스트) 미리 따뜻하고 액화 하이드록산수예틸 아가로스 처리 젤 (재료의 표참조) 약 0.5 cm 주조 P200 파이펫을 잡고 캐스팅 된 아가로즈의 시딩 챔버로 드롭 와이즈.
5. 하이드록세틸 아가로즈 프로세싱 젤을 RT에서 10분 동안 고형화시키십시오.
6. 아가로즈 캐스트를 1x PBS로 전송합니다.
   참고: 더 긴 보관을 위해, 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올에 캐스트를 포함.
7. 에탄올 계열을 통해 젤 섹션을 탈수(각각 1회: 에탄올 70%, 에탄올 80%, 에탄올 95%, 에탄올 100% 변화[각 3배 변경]). 그런 다음 클리어링 용액에서 각각 1h(예: 알리파틱 탄화수소[예: Clearite]또는 자일렌)에 대해 3배 클리어링하고, 용융 파라핀(각각 1시간 당 3배)으로 침투하여 수동 또는 조직 공정에서 제거합니다. 파라핀 왁스에 캐스팅을 포함하여 섹션당 5μm에서 후속 단면화합니다.
8. 크일렌에 슬라이드를 넣고 왁스를 제거한 다음, 각각 3분 동안 3배씩 티슈 섹션을 재수화한 다음, 등급이 매겨진 알코올 시리즈를 통해 조직 섹션을 재수화합니다: 100% 에탄올 2분, 에탄올 은 1분 95%, 에탄올 은 30초, 에탄올 70%는 30초동안 물에 넣습니다.
9. 식물성 증기선에서 100°C에서 20분 동안 열 유도 된 에피토프 검색을 수행하고, 10mM 나트륨 구연산 pH 6.0 용액에서 냉각 20 분, H₂O_2로내인성 과산화증을 차단하십시오.
10. 정상적인 골 혈청으로 섹션을 차단하고 하룻밤 동안 항 CD8 항체 (희석 1/25)에 노출하십시오.
11. 항토끼-HRP 공액이 있는 이차 항체(재료표참조)를 적용하고 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 크로마겐을 사용하여 염색을 개발한다. 11% 해리스 헤마톡슬린 용액을 가진 카운터스테인 핵(재료표참조).

6. 공동 문화에서 스페로이드 침공을 모니터링하고 분석

참고 : 콜라겐 I 매트릭스에 이미징 스페로이드 침입의 시간 지점은 조사자가 결정해야합니다. 10배 배율로 반전된 현미경을 사용하여 세포 배양 영상을 획득한다. 이상적인 시간점은 테스트중인 세포주뿐만 아니라 ECM 성분에 따라 달라집니다. 더 침략적인 세포주 콜라겐을 추가한 후에 몇 시간 안에 콜라겐으로 퍼지기 시작할 것입니다. 공동 배양에 있는 T 세포는 아주 초기 시간 점에 스페로이드에서 송신에 대한 전체 보기를 방지 할 수 있기 때문에, 일반적으로 이미지는 콜라겐을 추가 한 후 0 h (참조로), 24 h 및 48 h로 촬영됩니다.

1. 스페로이드에서 나오는 "스파이크"의 수를 수동으로 계산하고 이미지 분석 소프트웨어(예: Image J)를 사용하여 침습성을 수량화합니다.
   1. 스페로이드의 "스파이크"의 수를 수동으로 계산하여 스페로이드에서 "스파이크"의 수로 침략을 분석합니다.
      참고 : 그것은 구체에서 돌출이 "스파이크"로 간주되는 조사자에 의해 결정되어야한다. 결정 기준은 스페로이드의 가장자리에서 측정된 "스파이크"의 길이일 수 있습니다.
   2. 스페로이드의 크기에 비해 침략 영역으로 침략을 분석한다.
      1. 프리핸드 드로우 도구(이미지 J)를 사용하여 전체 영역(침략 + 스페로이드 영역)의 테두리를 추적합니다.
      2. 상단 메뉴분석을 클릭한 다음 측정값을 클릭하여 영역 측정값을 표시합니다.
      3. 총 스페로이드 영역의 테두리를 추적합니다.
      4. 상단 메뉴분석을 클릭한 다음 측정값을 클릭하여 영역 측정값을 표시합니다.
      5. 측정된 결과 목록을 스프레드시트에 복사하고 총 침략 = 총 면적/스페로이드 영역을 사용하여 총 침략/스페로이드를 계산합니다.

7. 면역 형광 염색

1. 다음을 준비합니다.
   1. 1x PBS2.3mL, 10% 포르말린 2.7mL를 사용하여 5.4%의 포르말린(5mL)을 준비한다.
   2. 1x PBS 50mL, 10% 옥옥시놀 2.5mL(RT 매장)를 사용하여 0.5% 옥옥시놀(50mL)을 준비한다.
   3. IF 버퍼(200mL)를 사용하여 1x PBS, 200 mg 소 세럼 알부민(BSA), 10% 옥옥시놀의 4mL, 10% 폴리소르바테 20의 1mL(사용하기 전에 RT까지 워밍업, 필터 및 저장)을 사용하여 IF 버퍼(200mL)를 준비하십시오.
   4. 5mL IF 버퍼와 염소 세럼 500 μL(사용하기 전에 RT까지 워밍업)을 사용하여 블로킹 솔루션(5mL)을 준비합니다.
   5. 8웰 챔버 슬라이드, 유리 커버립 및 장착 미디어를 준비하십시오.
2. 0일차
   1. 가습 챔버에서 RT에서 하룻밤 5.4 % 포르말린에서 스페로이드를 포함한 전체 아가로즈 캐스트를 수정합니다.
3. 1일차
   1. 잘 플레이트를 기울여 P1000 파이펫으로 아가로즈 주조를 둘러싼 세포 배양 배지를 제거한다.
   2. 콜라겐 패치를 매끄러운 뾰족한 팁 핀셋으로 캐스팅한 아가로즈 의 파종 챔버 내에서 콜라겐 매트릭스의 모서리를 잡고 자신감 있는 단일 운동으로 아가로즈 캐스팅을 벗겨 8웰 챔버 슬라이드로 옮깁니다.
      참고: 콜라겐 패치는 아가로즈 캐스트에서 쉽게 분리되어야 합니다. 그렇지 않으면 P1000 파이펫을 사용하여 파종 챔버 의 영역에서 배양 배지를 조심스럽게 추가하거나 아가로즈 캐스트를 반전시키고 웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 콜라겐 매트릭스를 제거합니다.
   3. 우물당 0.5% 옥옥시놀의 250 μL을 추가합니다(재료표참조). RT에서 1시간 동안 인큐베이션을 합니다.
   4. 옥옥시놀을 흡인하고 우물당 250 μL의 블로킹 용액을 추가합니다. RT에서 1h에 대한 블록.
   5. 한편, 1차 항체를 희석(항케라틴 8용 희석: 1/500; 판로이드 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) 블로킹 용액에서, 잘 당 250 μL에 대해 계산.
   6. 차단 용액에 1 차 항체를 추가하고 RT에서 하룻밤 배양을 위해 가습 챔버에 챔버 슬라이드를 배치합니다.
4. 2일차
   1. 흡입하여 용액을 차단하는 1차 항체를 제거합니다.
   2. IF 버퍼 300 μL을 추가하여 3번 세척하고 RT에서 5분 동안 앉게 하십시오.
      참고 : 그냥 앉아서, 셰이커에 넣을 필요가 없습니다.
   3. 차단 용액에서 이차 항체를 희석시 (항 케라틴 8: 항 쥐, 희석 1/500).
   4. 각 우물에 용액을 차단하고 RT에서 1 h에 대한 배양에 이차 항체의 250 μL을 추가합니다. 여기에서, 빛으로부터 샘플을 보호합니다.
   5. 흡입하여 차단 용액에서 이차 항체를 제거합니다.
   6. 추가하여 IF 버퍼 300 μL로 3번 세척하여 RT에서 5분 동안 앉게 하십시오.
   7. 1x PBS로 샘플을 헹구고 흡인합니다.
   8. 챔버 슬라이드의 벽을 조심스럽게 제거하여 하단의 유리 슬라이드만 유지되도록 합니다.
   9. 적어도 200μL의 장착 매체를 유리 커버슬립에 넣고 천천히 커버슬립을 샘플 위에 떨어뜨립니다.
      참고: 이미지 품질에 영향을 줄 수 있기 때문에 거품을 만들지 마십시오. 버블은 커버 슬립을 슬라이드의 긴 가장자리에 45° 각도로 부드럽게 배치하거나 슬라이드의 커버 슬립을 천천히 낮추면 방지할 수 있습니다.
   10. 마운트 된 샘플을 어둡고 건조한 장소에 넣고 하룻밤 사이에 앉게하십시오. 이미징은 다음 날에 수행될 수 있습니다.
       참고: 커버슬립은 처음에 콜라겐 패치 위에 놓인 후 조금 씩 바뀔 수 있습니다. 유리 슬라이드가 몇 분 동안 짝수 영역에 앉게하십시오. 커버슬립은 시간이 지남에 따라 유리 슬라이드와 커버슬립 사이에 틈이 남지 않도록 샘플을 평평하게 합니다.

8. 콜라겐 매트릭스로부터 세포의 분리

1. 다음을 준비합니다.
   1. 혈청 함유 세포 배양 배지에서 mg/mL 콜라게나아제 4개 준비(-20°C에서 알리인용 콜라게나아제 4 희석제 저장)
   2. 1x PBS로 2.5% BSA를 준비하고 모든 튜브와 파이펫 팁을 코팅합니다(사용하기 전에 BSA 용액을 필터링하십시오).
   3. 사용하기 전에 BSA 용액 및 세포 배양 배지를 미리 따뜻하게 하십시오.
2. 콜라게나아제 4 솔루션(1 mg/mL)의 2mL를 준비하여 35마이크로웰 아가로즈 캐스트에서 최대 3개의 콜라겐 행렬을 소화합니다.
3. 35마이크로웰 아가로즈 캐스트에서 최대 3개의 75μL 콜라겐 행렬을 2.5% BSA 프리 코팅 15mL 튜브로 옮기. 매끄러운 뾰족한 팁 핀셋으로 캐스팅 된 아가로즈의 파종 챔버 내에서 콜라겐 매트릭스의 모서리를 잡고 자신감있는 단일 운동으로 가이로를 벗겨냅니다.
4. 가위로 P1000 팁의 끝을 베벨 컷. 나머지 팁을 2.5% BSA로 미리 코팅하고 콜라겐 매트릭스를 위아래로 피펫하여 가능한 한 분해합니다. 37°C에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.
5. (중요 단계 4) 매 5분마다 콜라겐 매트릭스가 용해되었는지 확인합니다. 피펫은 시료의 10 μL을 복용하기 전에 다시 위아래로 내려가 10배배율로 현미경하에서 관찰하기 위해 세포 배양 접시에 시드한다. 필요한 경우 추가 5 분.
6. 전온 세포 배양 배지의 10mL로 튜브를 채우십시오 (DMEM은 10 % 태아 소 혈청으로 보충). 튜브를 3\u20124번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
7. RT에서 4 분 동안 400 x g의 튜브원심분리기.
8. 상체를 조심스럽게 제거하고 2mL의 부피를 둡니다.
9. (중요 단계 5) 그(것)들을 따라 세포를 운반하는 관의 바닥에 아직도 용해되지 않은 콜라겐이 있을 지도 모르다 첫번째 원심분리 단계 후에 2 mL를 둡니다.
10. 매번 혈청 함유 세포 배양 배지 10mL를 추가하여 2개의 세척 단계를 수행한다. RT에서 4 분 동안 400 x g에서 매번 원심 분리기.
11. 마지막 세척 단계 후 가능한 한 많은 매체를 제거하고 셀 펠릿만 둡니다.
12. 세포 해리 효소 용액의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단 (재료의 표참조).
13. P200 파이펫과 파이펫을 위아래로 사용하여 셀 클러스터를 분해합니다.
14. 세포 배양인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서20분 동안 세포를 배양한다.
15. 반복 단계 8.13.
    참고: ~10 μL을 꺼내 세포 배양 접시에 씨를 뿌리고 10배 배율로 현미경으로 관찰하여 스페로이드가 단일 세포로 얼마나 잘 해리되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 5분 더 추가 인큐베이션을 추가합니다.
16. 세포 배양 배지 4mL(10% 태아소 세럼으로 보충된 DMEM)를 넣고 튜브 3\u20124배를 반전시켜 섞는다.
17. RT에서 4 분 동안 400 x g의 원심 분리기.
18. 상부체를 제거합니다. 여기에서부터 FACS 염색 또는 세포 배양을 수행할 수 있습니다.

9. 콜라겐 매트릭스에서 RNA 추출

1. 페놀(재료표참조), 100% 클로로폼, 70% RNase-free 에탄올, RNA 추출 키트(재료표참조), RNase 프리 1.5mL 튜브, RNase-free 15mL 튜브 및 RNase-free dDH_2O로구니디늄 티오야네이트를 준비합니다.
2. 81 마이크로웰 아가로즈에서 최대 12개의 190μL 콜라겐 행렬을 15mL 튜브로 옮기다. 매끄러운 뾰족한 팁 핀셋으로 캐스팅 된 아가로즈의 파종 챔버 내에서 콜라겐 매트릭스의 모서리를 잡고 자신감있는 단일 운동으로 가이로를 벗겨냅니다.
   참고: 행렬은 RNA 추출이 준비될 때까지 -80°C에서 냉동할 수도 있습니다.
3. 15mL 튜브의콜라겐 행렬에 페놀(재료 표 참조)이 있는 1mL 구니디늄 티오시야네이트를 넣습니다.
   참고: 페놀을 곁들인 구니디늄 티오시야네이트는 콜라겐 행렬을 완전히 덮어야 합니다.
4. 10\u201220 s에 대한 튜브를 소용돌이.
5. 20G 바늘과 5mL 주사기로 행렬을 균질화하여 완전히 용해될 때까지 합니다.
6. 행렬은 RT에서 5 분 동안 앉게하십시오.
7. 200 μL의 순수 클로로폼을 행렬에 넣고 튜브를 15s로 힘차게 흔들어 줍니다.
8. 즉시 1.5mL 튜브로 믹스를 전송합니다.
9. 위상이 분리될 때까지 RT에서 최소 5분 동안 믹스를 놓습니다.
10. 원심 분리기 1.5 mL 튜브에서 12,000 x g에서 4 °C에서 15 분 동안.
11. 70%의 500 μL로 새로운 1.5mL 튜브를 채웁니다.
    참고: 원심 분리 후 수성 상의 부피에 따라 달라집니다(9.12단계 참조) 500 μL이 아닐 수 있습니다. 70%의 에탄올양은 수성상부와 같아야 한다.
12. 원심분리된 시료의 상부 수성 상을 70% 에탄올이 채워진 튜브로 조심스럽게 옮기고 위아래로 배관하여 철저히 섞는다.
13. (임계 단계 6) 이는 RNA를 오염시킬 수 있기 때문에 상판을 제거하면서 페놀 분리로 구아니디늄 티오티아네이트의 바닥에 있는 층을 방해하지 않도록 주의하십시오.
14. RNA 추출 컬럼에 샘플을 추가합니다(RNA 추출 키트에 포함됨, 재료 표참조). 여기에서, 세포에서 RNA 정화를 위한 제조자의 프로토콜을 따르십시오.

결과

3D 공동 배양 모델은 그림 1A에도시된 다른 어필을 허용하며, 필요에 따라 결합하거나 수정할 수 있습니다. 우리의 확립된 실험 설정에서, 종양 및 T 세포는 침략및/또는 내성 종양 세포의 선택을 위한 침략 분석의 개시에 선행된 2 일 동안 공동 배양됩니다(도 1B). 4일째에 침략의 양은 콜라겐 매트릭스로부터 분리되거나 RNA²³ 또는 매트?...

토론

여기에 제시된 방법은 T 세포, 세포 기지를 둔 기능 및 분자 분석과 공동 배양을 허용하는 3D 종양 스페로이드 생성뿐만 아니라 단일 장치를 사용하여 다양한 모니터링 및 분석 가능성을 설명합니다. 우리의 접근 방식의 주요 장점은 3D 문화를 별도의 분석으로 이전할 필요가 없으며 분석 전반에 걸쳐 3D 문화의 무결성을 유지한다는 것입니다.

여기에 제시된 워크플로는 필요에 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols