Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Zusammenfassung

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Zusammenfassung

Bei der Behandlung von Krebs mit Immuntherapie wurden erhebliche Fortschritte erzielt, obwohl eine große Anzahl von Krebsarten weiterhin resistent gegen die Behandlung ist. Eine begrenzte Anzahl von Assays ermöglicht eine direkte Überwachung und mechanistische Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Tumor- und Immunzellen, unter denen T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Durchführung der zytotoxischen Reaktion des adaptiven Immunsystems auf Krebszellen spielen. Die meisten Assays basieren auf einer zweidimensionalen (2D) Kokultur von Zellen aufgrund der relativen Benutzerfreundlichkeit, aber mit begrenzter Darstellung des invasiven Wachstumsphänotyps, einem der Kennzeichen von Krebszellen. Aktuelle dreidimensionale (3D) Co-Kultursysteme erfordern entweder spezielle Ausrüstung oder separate Überwachung für die Invasion von ko-kultivierten Krebszellen und interagierenden T-Zellen.

Hier beschreiben wir einen Ansatz zur gleichzeitigen Überwachung des invasiven Verhaltens von Krebszellsphäroiden und T-Zell-Zytotoxizität in der Co-Kultur in 3D. Die Sphäroidbildung wird durch verbesserte Zell-Zell-Wechselwirkungen in gerüstfreien Agarose-Mikrowell-Gussteilen mit U-förmigen Böden angetrieben. Sowohl die T-Zell-Kokultur als auch die Krebszellinvasion in die Kollagenmatrix Typ I werden in den Mikrobrunnen der Agarose-Gussteile durchgeführt, ohne dass die Zellen übertragen werden müssen, wodurch ein intaktes 3D-Kokultursystem während des gesamten Assays erhalten bleibt. Die Kollagenmatrix kann von der Agarose-Umwandlung getrennt werden, was eine Immunfluoreszenz (IF) Färbung und eine konfokale Bildgebung von Zellen ermöglicht. Außerdem können Zellen für weiteres Wachstum isoliert oder Analysen wie Genexpression oder Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unterzogen werden. Schließlich kann die 3D-Kokultur durch Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung und Schnitt analysiert werden. Mögliche Modifikationen des Assays sind veränderte Zusammensetzungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie die Einbeziehung verschiedener stromaler oder Immunzellen in die Krebszellen.

Einleitung

Trotz signifikanter Verbesserungen in der Krebsimmuntherapie in den letzten zehn Jahren ist unser mechanistisches Verständnis von Empfindlichkeit und Resistenz gegen Behandlungen immer noch ziemlich schlecht¹. Es ist allgemein bekannt, dass Tumoren eine erhebliche Heterogenität aufweisen und dass die dynamischen Wechselwirkungen der Tumorzellen mit ihrer Mikroumgebung sowie mit den Immunzellen den Tod von Tumorzellen, das invasive Verhalten und die Reaktion auf Behandlungen beeinflussen, die immuntherapeutische^1,2,3umfassen. Als ein Arm des adaptiven Immunsystems führen T-Zellen eine zellspezifische Zytotoxizität aus. Die Analyse der T-Zell-Erkennung und -Reaktion auf Krebszellen liefert mechanistische Einblicke in Resistenz und Empfindlichkeit gegenüber immunmodulatorischen Behandlungen.

Die In-vitro-Modellierung und Überwachung von Wechselwirkungen zwischen Krebs und T-Zellen in einer geeigneten Umgebung war eine Herausforderung und führte bisher zu begrenzten mechanistischen Erkenntnissen. Die meisten zellbasierten Assays basieren auf einer zweidimensionalen (2D) Umgebung, der es an Schlüsselmerkmalen mangelt, die für die Rekapitulation der dreidimensionalen (3D) in vivo Physiologie^4,5,6, nämlich räumlichezell-zell-Interaktionen, Kontakt mit der extrazellulären Matrix (ECM)⁷, dynamischer metabolischer Nachfrage, erhöhter Hypoxie aufgrund des Massenwachstums⁸, und Auswirkungen der Tumormikroumgebung (TME)⁹sind. Auf der anderen Seite gibt es immer noch eine Reihe von Mängeln mit den derzeit verwendeten dreidimensionalen (3D) Kokultur- und Invasions-Assay-Systemen: (1) die zeitaufwändige Natur der Sphäroiderzeugung und -ernte^5,10, (2) die fehlende Kontrolle über die Sphäroidgröße, Form und Zelldichte^11,12, (3) die Low-Throughput-Typ-Assays, (4) die Anforderung für spezielle Ausrüstung^13,14, (5) die Notwendigkeit, die Co-Kultur in verschiedene Umgebungen für verschiedene Assays übertragen^15,16,17. Insbesondere die Übertragung eines Co-Kultur-Assays führt oft zu einer Störung der Sphäroide und zum Verlust der Integrität der Kokultur. Dies gilt insbesondere für "lockere" Sphäroide mit reduzierter Zellzellhaftung. Zum Beispiel erfordern die meisten 3D-Invasionstests, dass Sphäroide nach ihrer Erstausbildung geerntet und dann in ECM^14,,15,16wieder ausgesetzt werden. Dieser Resuspensionsschritt führt zu einem Verlust der Kontrolle über den Abstand zwischen Sphäroiden. Da die Entfernung zwischen Tumorsphäroiden ihr invasives Verhalten beeinflusst, führt dieser Kontrollverlust zu einer hohen Inter-Assay-Varianz und reduziert die Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist die Anwendung von Zellfraktionierungstests durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte zur Beurteilung der peripheren und Tumorsphäroid-infiltrierenden Immunzellen auf Tumorzellpopulationen beschränkt, die stabilere Sphäroiden erzeugen¹⁷.

Konzept und Ansatz

Unser Ansatz behebt die oben genannten Mängel mit einem "All-in-One"-3D-Sphäroid-Cokulturmodell, das die Übertragung von Sphäroiden für nachfolgende Assays nicht erfordert. Wir haben ein Sphäroid-Bildungsgerät (siehe Tabelle der Materialien) angepasst, um einen Assay zur gleichzeitigen Überwachung des invasiven Verhaltens von Krebszellen und der Zytotoxizität von ko-kultivierten T-Zellen zu generieren. Diese Methode ist benutzerfreundlich, kostengünstig und ermöglicht eine schnelle und einfache Handhabung in einer relativ hohen 3D-Einstellung. Je nach Art der verwendeten Vorrichtung können bis zu 81 große sphärische Sphäroide in einem einzigen Pipettierschritt mit Kontrolle über die individuelle Sphäroidgröße erzeugt werden, indem die Anzahl der ausgesäten Zellen geändert wird. Die Sphäroidbildung wird durch verbesserte Zell-Zell-Wechselwirkungen in gerüstfreien Agarose-Multi-Well-Gussteilen mit U-förmigen Böden erzwungen. Wir haben dieses 3D-System für dynamische zellbasierte Funktionsstudien sowie Endpunktmolekular- und biochemische Assays adaptiert, die fluoreszisaktivierte Zellsortierung (FACS), Immunfluoreszenz (IF) oder Immunhistochemie (IHC) Färbe sowie Genexpressionsanalyse der intakten 3D-Kokultur umfassen.

Für funktionelle Studienführt das Einbetten von Sphäroiden in Kollagen Typ I in die Agarose-Abgüsse zur Invasion von Krebszellen aus äquidistanten Sphäroiden und ermöglicht die Überwachung wesentlicher zelllinienspezifischer Merkmale, wie Z. I. kollektive Zellmigration^18,19. Darüber hinaus lässt sich die Kollagenmatrix leicht vom Agaroseguss trennen, was zu einem 1,2222 mm dicken Pflaster mit mehreren Sphäroiden führt, das durch konfokale Mikroskopie für IF-Färbung und Bildgebung weiterverarbeitet werden kann. Dies kann deutliche Zellinvasion und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in einem High-Throughput-Screening offenbaren. Auch Zellen in der Kollagenmatrix können nach Kollagenverdauung und Einzelzelldissoziation für die nachfolgende Zellkultivierung oder -analyse isoliert werden.

Für die IHC-Analyse von Sphäroidensind nach Fixierung und Schnitt der Agarose-Gussteile Proteine oder andere Moleküle von Interesse nachweisbar, während die geographischen Positionen der Sphäroide erhalten bleiben. In dem hier beschriebenen Ansatz werden Sphäroide direkt in Hydroxyethyl-Agarorose-Verarbeitungsgel in den Agaroseguss eingebettet und das Gel dient als "Deckel", um die Sphäroide an der Unterseite der Mikrowells zu behalten. Nach der Paraffineinbettung der Agarose²⁰wird eine serielle horizontale Schnitte mit der Unterseite des Gusses als Ausgangspunkt durchgeführt.

Dieser Ansatz steht im Gegensatz zu herkömmlichen IHC-Sektionen von Sphäroiden, die die Entnahme von Zellen vor der Einbettung in Hydroxyethyl-Agarose-Verarbeitungsgel²¹ erfordern und Gefahr läuft, Sphäroide zu stören, wodurch die räumliche Anordnung der Zellen verloren geht. Auch die Zellfraktionierung durch Zentrifugation zur Beurteilung, ob Immunzellen infiltriert oder peripher zu Tumorsphäroiden¹⁷ bleiben, wird durch direkte Einbettung vermieden.

Darüber hinaus kann die 3D-Kokultur durch Beimischung von Tumor-, Strom- oder Immunzellen durchgeführt werden und so Tumorzell-Übersprechen untersucht oder verschiedene Tumormikroumgebungen zur Analyse von Zell-Zell-Wechselwirkungen einschließlich Kokulturen mit Endothelzellen¹⁶rekapituliert.

Diese 3D-Sphäroid-Cokultur-Einstellung kann verwendet werden, um Co-Kultur verschiedener Zelltypen in der Tumormikroumgebung durchzuführen und die Auswirkungen veränderter ECM-Elemente zu bewerten. Neben Kollagen Typ I können auch andere ECM-Komponenten (z.B. Matrigel, Matrigel/Kollagen-Mischungen, Fibronectin) verwendet werden, da die Tumorzellinvasion durch die Fülle verschiedener Substrate beeinträchtigt wird²². Auch die Mikrobrunnen des Agarosegusses eignen sich für die Sphäroidbildung von Primärzelllinien und für Zellen mit geringer Zellzelladhäsion.

Protokoll

Eine Liste und Erläuterung einiger häufig verwendeter Wörter im gesamten Protokoll finden Sie in Der Zusatzdatei 1.

1. Erzeugung von Sphäroiden

1. Vorbereiten und Autoklaven 2% Agarose in 1x PBS (z.B. 1 g Agarose in 50 ml 1x PBS) und Autoklav 35- und 81-Mikrowell-Gummiformen.
   VORSICHT: Vermeiden Sie die Verwendung von niedrigschmelzender Agarose zur Erzeugung der Agarosegussteile für die IHC-Verarbeitung.
2. Bereiten Agarose-Gussteile vor
   HINWEIS: 35-Mikrowell-Abgüsse werden für Invasions-, Immunfluoreszenz- (IF) und Zellisolations-Assays verwendet. 81-Mikrowell-Gussteile werden für Zytotoxizität, Immunhistochemie (IHC), Zellisolation und RNA-Extraktionstests eingesetzt.
   1. Nachdem die Agarose autoklaviert wurde, lassen Sie geschmolzene Agarose auf ca. 60-u201270 °C abkühlen. Verwenden Sie in einer Zellkulturhaube aseptische Technik und Pipetten 500 l geschmolzene Agarose in eine 81-Mikrowell-Gummiform pro Brunnen oder 330 l in eine 35-Mikrowell-Gummiform pro Brunnen.
      VORSICHT: Vermeiden Sie blasen beim Mischen oder Pipetieren von Agarose. Entfernen Sie alle Blasen durch sanftepipetting.
   2. Nachdem die Agarose verfestigt ist, beugen Sie vorsichtig die Gummiform, um den daraus gegossenen Agarose zu entfernen. Hierdurch die Hände über die entsprechende Wellplatte legen und die Agarose direkt in einen Brunnen der Wellplatte fallen lassen.
      HINWEIS: Flex die Gummiform an verschiedenen Positionen, um über Beugen zu vermeiden. Es kann hilfreich sein, die Gummiform zu biegen und gleichzeitig sanft von unten zu drücken.
   3. Um die Agarose-Abgüsse zu ausdemieren, fügen Sie zellkulturmittel hinzu, bestehend aus DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (2,5 ml/gut für 12-Well-Platte und 1 ml/Well für 24-Well-Platte). Die Well-Platte in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5%_CO2)geben und 1 h inkubieren.
3. In der Zwischenzeit bereiten Zellkultur für die Aussaat vorzubereiten.
   HINWEIS: Die Gesamtzahl der Zellensäungen pro Agaroseguss ist vom Prüfer zu bestimmen. Bei murinen primären Pankreaskrebszelllinien werden 35.000 Zellen/35-Mikrowell-Gegossenes und 81.000 Zellen/81-Mikrowell-Gegossenes (im Durchschnitt 1000 Zellen/Sphäroide) für alle folgenden Assays ausgesät. Der durchschnittliche Durchmesser eines Sphäroids beträgt nach 48 h etwa 150.2012200 m.
4. Entfernen Sie zuerst das Zellkulturmedium um die Agarose, die mit einer P1000 Pipette gegossen wird, indem Sie die Wellplatte kippen. Dann das Medium in der Säkammer vorsichtig entfernen.
5. Sätdie vorbereitete Tumorzellsuspension tropfenweise in die Zellsäkammer. Die Well-Platte 15 min vorsichtig wieder in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5%_CO2)geben.
   HINWEIS: Während dieses Schritts setzen sich die Zellen in den Mikrobrunnen des Agarosegusses ab.
6. Fügen Sie zusätzliches Medium an der Außenseite des Agarosegusses hinzu (2,5 ml/Gut für 12-Well-Platte und 1 ml/Well für 24-Well-Platte).
7. Legen Sie die Well-Platte 48 h lang wieder in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂) ein.
   HINWEIS: Normalerweise dauert es bis zu ein paar Stunden, bis die Zellen Sphäroide in den Mikrobrunnen bilden. Im Allgemeinen bilden sich nach 24 h feste Tumorzellsphäroide und sind nach 48 h stabil. Dies kann jedoch zwischen verschiedenen Zelllinien variieren. Bei Bedarf das Zellkulturmedium ändern, indem Sie die Wellplatte mit den Agarose-Abgüssen vorsichtig kippen und das umgebende Zellkulturmedium mit einer P1000 Pipette entfernen. Dann fügen Sie sorgfältig frisches Medium, indem Sie es entlang der Wand des Brunnens. In der Regel ist es aufgrund des geringen Volumens und des Risikos, die Sphäroide zu entfernen, nicht notwendig, die Medien innerhalb der Gussteile zu wechseln.

2. Co-Kultur mit T-Zellen

1. Setzen Sie die erforderliche Anzahl von T-Zellen in 75 l (35-Mikrowell-Guss) oder in 190 l (81-Mikrowell-Guss) des entsprechenden T-Zell-Kulturmediums (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin) wieder auf.
2. Entfernen Sie zuerst das Zellkulturmedium um die Agarose, die mit einer P1000 Pipette gegossen wird, indem Sie die Wellplatte kippen. Entfernen Sie dann langsam und vorsichtig das Medium innerhalb des Gusses, indem Sie vorsichtig eine Ecke der Säkammer mit einer P200 Pipette zielen, während die well-Platte mit der anderen Hand gekippt bleibt.
3. (Kritischer Schritt 1) Da die Gefahr besteht, Sphäroide zu entfernen, steuern Sie den Verlust von Sphäroiden, indem Sie die Anzahl der Sphäroide innerhalb der Mikrowells vor und nach dem Entfernen des Mediums vergleichen, indem Sie unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung betrachten.
4. Sättdien Sie die T-Zell-Suspension vorsichtig tropfenweise in die Säkammer der Agarose, indem Sie die P200 Pipette etwa 0,5 cm über dem Guss halten.
5. (Kritischer Schritt 2) Es besteht die Gefahr, dass die Sphäroide beim Hinzufügen der T-Zellen ausgespült werden. Daher ist es wichtig, die T-Zellen sehr langsam und etwa 0,5 cm über der Säkammer hinzuzufügen.
   HINWEIS: Eine Möglichkeit, die Anzahl der ausgespülten Sphäroide zu verringern, besteht darin, die Pipette auf eine Ecke der Säkammer zu zeigen, während die T-Zellen hinzugefügt werden, wodurch nur das Risiko besteht, dass die Sphäroide in dieser Ecke ausgespült werden.
6. Legen Sie die Well-Platte 15 min vorsichtig wieder in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5%_CO2) ein.
7. Nehmen Sie die Well-Platte aus dem Inkubator und fügen Sie frische Zellkultur Medium (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin) um die Agarose gegossen durch langsampipettieren es entlang der Wand des Brunnens.
8. Legen Sie die Well-Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator für 48 h.

3. Einbettung von 3D-Kokultur in Kollagenmatrix Typ I

1. Vorbereiten neutralisierter Art I Kollagen
   1. Das Lagerkollagen mit serumfreiem Basismedium (RPMI) auf eine endg.de-Menge von 3 mg/ml verdünnen. Geben Sie für jede 100 l verdünnte Kollagen 11 l 10x PBS und 1,2 l 1 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzu.
   2. Auf Eis halten und 1 h inkubieren (neutralisieren).
2. Entfernen Sie zuerst das Zellkulturmedium um die Agarose, die mit einer P1000 Pipette gegossen wird, indem Sie die Wellplatte kippen. Dann, langsam und vorsichtig entfernen Sie das Medium innerhalb des Gusses, indem Sie sanft eine Ecke der Säkammer mit einer P200 Pipette zielen, während die well-Platte mit der anderen Hand gekippt.
   HINWEIS: Hier ist es wichtig, das Zellkulturmedium um die Agarose-Besetzung vollständig zu entfernen.
3. Das neutralisierte Kollagen, das ich tropfenweise in die Säkammer der Agarose gieße, durch Halten der P200 Pipette etwa 0,5 cm über dem Guss, sorgfältig pipette.
4. Legen Sie die Well-Platte sofort in den Zellkultur-Inkubator für 4 min (35-Mikrowell-Gegossen) oder 5 min (81-Mikrowell-Guss).
   VORSICHT: (Kritischer Schritt 3) Es ist wichtig, die angegebene Inkubationszeit strikt einzuhalten. Andernfalls ist das invasive Verhalten möglicherweise nicht reproduzierbar.
5. Invertieren Sie die Well-Platte und lassen Sie es im Inkubator für 1 h gekippt.
   HINWEIS: Die Gussteile bleiben aufgrund der Oberflächenspannung an der Unterseite der Wellplatte befestigt. Wird ein spezielles Zellkulturmedium mit hoher Serumkonzentration (z.B. RPMI ergänzt durch 20% fetales Rinderserum) verwendet, könnte ein zusätzlicher Waschschritt mit 1x PBS nach Entfernung des Mediums im Brunnen notwendig sein, um die Oberflächenspannung zu erhöhen.
6. Nehmen Sie die Well-Platte aus dem Inkubator und kehren Sie sie zurück. Fügen Sie frische Zellkultur Medium (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin) um die Agarose gegossen durch langsampipettieren es entlang der Wand des Brunnens.
7. Legen Sie die Well-Platte für 48 h wieder in den Zellkultur-Inkubator.

4. Zytotoxizitätstest

1. Bereiten Sie 3 ml 1x PBS mit 2% fetalem Rinderserum pro Agaroseguss vor.
2. Nach der Co-Kultur für 4 d, entfernen Sie das Zellkulturmedium um die Agarose gegossen mit einer P1000 Pipette durch leichtes Kippen der Well-Platte mit der anderen Hand.
   HINWEIS: Der gesamte Zeitraum der Kokultur ist vom Prüfer zu bestimmen.
3. Verteilen Sie 1 ml 1x PBS + 2% FBS mit einer P1000 Pipette in die Säkammer, um die Sphäroide aus den Mikrobrunnen zu lösen.
4. Wiederholen Sie Schritt 4.3 zweimal mit dem Volumen im Brunnen und übertragen Sie ihn in ein 15 ml Rohr.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 10 s bei Raumtemperatur (RT).
6. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000 Pipette.
7. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 1x PBS mit 2% FBS und Zentrifuge bei 300 x g für 1 min bei RT hinzufügen.
8. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 4.7).
9. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Zelldissoziationsenzymlösung hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
10. Verwenden Sie eine P200 Pipette und Pipette nach oben und unten, um die Zellcluster zu brechen.
11. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min im Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂).
12. Wiederholen Sie Schritt 4.10.
    ANMERKUNG: Nehmen Sie auf einer Zellkulturschale 10 L heraus und säen Sie sie aus ( unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung), wie gut sich die Sphäroide in einzelnen Zellen dissoziiert haben. Falls erforderlich, fügen Sie 5 min weitere Inkubation hinzu.
13. Fügen Sie 4 ml vollzellige Kulturmedium (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin) und mischen, indem Sie die Röhre 3-u20124 mal invertieren.
14. Zentrifuge bei 400 x g für 4 min bei RT.
15. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im FACS-Puffer für die Annexin-V-Färbung von apoptotischen Zellen wieder aus.
    HINWEIS: Von hier aus kann jede FACS-Färbung und Zellanalyse durchgeführt werden.

5. Hydroxyethyl-Agarose-Verarbeitung Geleinbettung für IHC-Sektion

HINWEIS: Hier ist es wichtig, die Verwendung von niedrigschmelzender Agarose zur Erzeugung der Agarose-Abgüsse zu vermeiden.

1. Entfernen Sie am Ende der Co-Kultur zunächst das Zellkulturmedium um die Agarose, die mit einer P1000 Pipette gegossen wird, indem Sie die Wellplatte kippen. Entfernen Sie dann langsam und vorsichtig das Medium innerhalb des Gusses, indem Sie vorsichtig eine Ecke der Säkammer mit einer P200 Pipette zielen, während die well-Platte mit der anderen Hand gekippt bleibt.
2. Langsam Pipette 10% formalin zuerst in der Säkammer durch sanft targeting eine Ecke der Säkammer mit einer P200 Pipette. Dann 10% Formalin an die Außenseite der Agarose gegossen, bis es vollständig bedeckt ist. Fixieren Sie die Agarose in 10% Formalin für 1 d.
3. Entfernen Sie das Formalin am nächsten Tag.
4. Sorgfältig Pipette 210 l (81-Mikrowell-Gegossen) oder 100 l (35-Mikrowell-Guss) aus vorgewärmten und verflüssigten Hydroxyethyl-Agarose-Verarbeitungsgel (siehe Materialtabelle) tropfenweise in die Säkammer der Agarose gegossen, indem die P200 Pipette etwa 0,5 cm über dem Guss gehalten wird.
5. Lassen Sie das Hydroxyethyl-Agarose-Verarbeitungsgel 10 min bei RT erstarren.
6. Übertragen Sie den Agaroseguss auf 1x PBS.
   HINWEIS: Für eine längere Lagerung, betten Sie den Guss in 70% Ethanol, um eine Kontamination zu verhindern.
7. Dehydrieren Sie die Gelabschnitte durch eine Ethanolserie (jeweils 1 h: 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 95 % Ethanol, 100 % Ethanol [3x Änderungen pro]). Dann in einer Clearinglösung 3x für je 1 h (z.B. aliphatische Kohlenwasserstoffe [z.B. Clearite] oder Xylole) löschen und mit geschmolzenem Paraffin (3x für jeweils 1 h) infiltrieren, entweder manuell oder in einem Gewebeverarbeiter. Einbetten Sie den Guss in Paraffinwachs für die nachfolgende Schnitte mit 5 m pro Abschnitt.
8. Entfernen Sie Wachs, indem Sie Dias in Xylole, 3x für je 3 min, dann rehydrieren Gewebeabschnitte durch eine abgestufte Alkoholserie: 100% Ethanol für 2 min, 95% Ethanol für 1 min, 80% Ethanol für 30 s und 70% Ethanol für 30 s, dann in Wasser geben.
9. Durchführung wärmeinduzierter Epitop-Retrieval in einem Gemüsedampfer bei 100 °C für 20 min, gefolgt von 20 min Abkühlung in einer 10 mM Natriumcitrat-pH 6.0-Lösung und Block endogene Peroxidasen mit H_2O2.
10. Blockieren Sie die Abschnitte mit normalem Zielserum und setzen Sie sie über Nacht anti-CD8-Antikörpern (Verdünnung 1/25) aus.
11. Anti-Kaninchen-HRP konjugierte Sekundärantikörper auftragen (siehe Materialtabelle) und die Färbung mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Chromagen entwickeln. Counterstain-Kerne mit einer 11% Harris Hämatoxylin-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).

6. Überwachung und Analyse der Sphäroid-Invasion in der Kokultur

HINWEIS: Der Zeitpunkt der bildgebenden Sphäroid-Invasion in die Kollagen-I-Matrix ist vom Prüfer zu bestimmen. Erfassen Sie Zellkulturbilder mit einem invertierten Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Der ideale Zeitpunkt hängt von der zu testenden Zelllinie sowie der ECM-Komponente ab. Invasivere Zelllinien beginnen sich innerhalb weniger Stunden nach Zugabe des Kollagens in das Kollagen auszubreiten. Da die T-Zellen in der Kokultur eine vollständige Sicht auf den Ausgang der Sphäroide zu sehr frühen Zeitpunkten verhindern können, werden in der Regel Bilder bei 0 h (als Referenz), 24 h und 48 h nach Zugabe des Kollagens aufgenommen.

1. Quantitieren Sie die Invasivität, indem Sie die Anzahl der "Spikes" aus dem Sphäroid und/oder die Verwendung von Bildanalysesoftware, z.B. Bild J, manuell zählen.
   1. Analysieren Sie die Invasion als die Anzahl der "Spikes" aus dem Sphäroid, indem Sie die Anzahl der "Spikes" eines Sphäroids manuell zählen.
      HINWEIS: Der Prüfer entscheidet, welche Vorsprünge aus den Sphäroiden als "Spikes" gelten. Ein Entscheidungskriterium könnte die Länge der "Spitze" sein, die vom Rand des Sphäroids gemessen wird.
   2. Analysieren Sie Invasion als Invasionsbereich relativ zur Größe des Sphäroids.
      1. Verwenden Sie das Freihand-Ziehwerkzeug (Bild J), um den Rand des gesamten Bereichs (Invasion + Sphäroidbereich) zu verfolgen.
      2. Klicken Sie im oberen Menü auf Analysieren und dann auf Messen, um die Flächenmessung anzuzeigen.
      3. Verfolgen Sie den Rahmen des gesamten Sphäroidbereichs.
      4. Klicken Sie im oberen Menü auf Analysieren und dann auf Messen, um die Flächenmessung anzuzeigen.
      5. Kopieren Sie die Liste der gemessenen Ergebnisse in eine Kalkulationstabelle und berechnen Sie die gesamte Invasion/Sphäroide mit der Formel: Gesamtinvasion = Gesamtfläche/Sphäroidfläche.

7. Immunfluoreszenzfärbung

1. Bereiten Sie Folgendes vor.
   1. Bereiten Sie 5,4% Formalin (5 ml) mit 2,3 ml 1x PBS und 2,7 ml 10% Formalin vor.
   2. Bereiten Sie 0,5% Octoxynol (50 ml) mit 50 ml 1x PBS und 2,5 ml 10% Octoxynol (bei RT speichern) vor.
   3. Bereiten Sie IF Buffer (200 ml) mit 200 ml 1x PBS, 200 mg Rinderserumalbumin (BSA), 4 ml 10% Octoxynol, 1 ml 10% Polysorbat 20 vor (vor Gebrauch bis RT aufwärmen; filtern und bei 4 °C lagern).
   4. Bereiten Sie die Blockierlösung (5 ml) mit 5 ml IF-Puffer und 500 l Ziegenserum vor (warm up to RT vor Gebrauch).
   5. Halten Sie 8-Well-Kammerschlitten, Glasabdeckungen und Montagemedien bereit.
2. Tag 0
   1. Fixieren Sie den gesamten Agaroseguss, einschließlich der Sphäroide, über Nacht in 5,4% Formalin bei RT in einer befeuchteten Kammer.
3. Tag 1
   1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium um die Agarose, die mit einer P1000 Pipette gegossen wird, indem Sie die Wellplatte kippen.
   2. Übertragen Sie das Kollagenpflaster in eine 8-Well-Kammerrutsche, indem Sie eine Ecke der Kollagenmatrix in der Saatkammer der Agarose mit schlanker Spitzenpinzette erfassen und in einer einzigen, selbstbewussten Bewegung von der Agarose abziehen.
      HINWEIS: Das Kollagen-Pflaster sollte leicht von der Agarose-Besetzung getrennt werden. Andernfalls verwenden Sie eine P1000 Pipette, um vorsichtig Kulturmedium im Bereich der Säkammer hinzuzufügen oder die Agarose gegossen umzukehren und sanft schütteln Sie die Well-Platte, um die Kollagenmatrix zu lösen.
   3. Fügen Sie 250 l von 0,5% Octoxynol (siehe Materialtabelle)pro Brunnen hinzu. 1 h bei RT inkubieren.
   4. Aspirieren Sie das Octoxynol und fügen Sie 250 L Blockierlösung pro Brunnen hinzu. Block für 1 h bei RT.
   5. In der Zwischenzeit den primären Antikörper verdünnen (Verdünnung für Antikeratin 8: 1/500; Phalloidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) in der Blockierlösung, berechnungsgemäß für 250 l pro Brunnen.
   6. Fügen Sie den primären Antikörper in Blockierlösung und legen Sie die Kammerrutsche in eine befeuchtete Kammer für die nächtliche Inkubation bei RT.
4. Tag 2
   1. Entfernen Sie den primären Antikörper in der Blockierlösung, indem Sie ihn anheben.
   2. Waschen Sie 3 mal, indem Sie 300 l IF Buffer hinzufügen und lassen Sie es für 5 min bei RT sitzen.
      HINWEIS: Lassen Sie es einfach sitzen, es gibt keine Notwendigkeit, es auf einen Shaker zu setzen.
   3. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper in einer Blockierenden Lösung (für Anti-Keratin 8: Antiratirat, Verdünnung 1/500).
   4. Fügen Sie jedem Brunnen 250 L sekundären Antikörper in blockierender Lösung hinzu und brüten sie für 1 h bei RT. Von hier aus schützen Sie die Proben vor Licht.
   5. Entfernen Sie den sekundären Antikörper in der Blockierlösung durch Ansaugung.
   6. Waschen Sie 3 mal mit 300 l IF-Puffer durch Hinzufügen und lassen Sie es für 5 min bei RT sitzen.
   7. Spülen Sie die Proben mit 1x PBS und aspirieren Sie sie.
   8. Entfernen Sie vorsichtig die Wände der Kammerrutsche, so dass nur die Glasrutsche an der Unterseite bleibt.
   9. Fügen Sie mindestens 200 L Montagemedien zu einem Glasdeckel hinzu und lassen Sie den Deckelüberschlag langsam über die Probe fallen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie blasen, da dies die Bildqualität beeinflusst. Blasen können verhindert werden, indem der Deckelschlupf vorsichtig auf der langen Kante des Schlittens in einem 45°-Winkel platziert wird oder der Deckelschlupf auf dem Schlitten langsam abgesenkt wird.
   10. Die montierten Proben an einen dunklen und trockenen Ort stellen und über Nacht sitzen lassen. Die Bildgebung kann am nächsten Tag durchgeführt werden.
       HINWEIS: Der Coverslip kann sich zunächst etwas verschieben, sobald er über dem Kollagen-Patch platziert wurde. Lassen Sie die Glasrutsche für ein paar Minuten auf einem ebenen Bereich sitzen. Der Deckelschlupf flacht die Probe ab, so dass im Laufe der Zeit keine Lücke zwischen Glasrutsche und Deckelrutsche besteht.

8. Isolierung von Zellen aus der Kollagenmatrix

1. Bereiten Sie Folgendes vor.
   1. 1 mg/ml Kollagenase 4 in serumhaltigem Zellkulturmedium vorbereiten (Aliquoted Kollagenase 4 Verdünnungen bei -20 °C speichern)
   2. 2,5% BSA in 1x PBS vorbereiten und alle Rohre und Pipettenspitzen damit beschichten (Filter BSA-Lösung vor Gebrauch).
   3. Vor gebrauchen Sie die BSA-Lösung und das Zellkulturmedium vorwärmen.
2. Bereiten Sie 2 ml Kollagennase 4 Lösung (1 mg/ml) vor, um maximal drei Kollagenmatrizen aus 35-Mikrowell-Agarose-Gussteilen zu verdauen.
3. Übertragen Sie bis zu drei 75-L-Kollagenmatrizen aus 35-Mikrowell-Agarose-Gussteilen in ein 2,5% BSA vorbeschichtetes 15 ml-Rohr. Greifen Sie eine Ecke der Kollagenmatrix in der Säkammer der Agarose mit schlanker Spitzenpinzette und schälen Sie sie von der Agarose, die in einer einzigen, selbstbewussten Bewegung gegossen wird.
4. Mit einer Schere die Spitze einer P1000-Spitze abschrägen. Die verbleibende Spitze mit 2,5% BSA vorlacken und die Kollagenmatrix so weit wie möglich durch Pipetieren nach oben und unten aufbrechen. Inkubieren Sie das Rohr für 15 min bei 37 °C.
5. (Kritischer Schritt 4) Prüfen Sie alle 5 min, ob sich die Kollagenmatrix aufgelöst hat. Pipette wieder nach oben und unten, bevor Sie 10 l der Probe herausnehmen und säen Sie sie auf einer Zellkulturschale zur Beobachtung unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Fügen Sie bei Bedarf weitere 5 min hinzu.
6. Füllen Sie die Röhre mit 10 ml vorgewärmten Zellkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum). Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Rohr 3-u20124 mal umkehren.
7. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 x g für 4 min bei RT.
8. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie 2 ml Volumen.
9. (Kritischer Schritt 5) Lassen Sie 2 ml nach dem ersten Zentrifugationsschritt, da es noch ungelöstes Kollagen an der Unterseite des Rohres geben könnte, das Zellen entlang trägt.
10. Führen Sie zwei Waschschritte durch, indem Sie jedes Mal 10 ml serumhaltiges Zellkulturmedium hinzufügen. Zentrifuge jedes Mal bei 400 x g für 4 min bei RT.
11. Nach dem letzten Waschschritt so viel Medium wie möglich entfernen und nur das Zellpellet lassen.
12. Das Zellpellet in 1 ml Zelldissoziationsenzymlösung wieder aufsetzen (siehe Materialtabelle).
13. Verwenden Sie eine P200 Pipette und Pipette nach oben und unten, um die Zellcluster zu brechen.
14. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min im Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO₂).
15. Wiederholen Sie Schritt 8.13.
    ANMERKUNG: Nehmen Sie eine Zellkulturschale heraus und säen Sie sie, um unter dem Mikroskop bei der 10-fachen Vergrößerung zu beobachten, wie gut sich die Sphäroide in einzelne Zellen aufgelöst haben. Falls erforderlich, fügen Sie 5 min weitere Inkubation hinzu.
16. Fügen Sie 4 ml Zellkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum) hinzu und mischen Sie, indem Sie das Rohr 3-u20124 mal umkehren.
17. Zentrifuge bei 400 x g für 4 min bei RT.
18. Entfernen Sie den Überstand. Von hier aus kann FACS Färbung oder Zellkultur durchgeführt werden.

9. RNA-Extraktion aus der Kollagenmatrix

1. Guanidiniumthiocyanat mit Phenol (siehe Materialtabelle), 100% Chloroform, 70% RNase-freies Ethanol, RNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle), RNase-freie 1,5 ml-Rohre, RNase-freie 15 ml-Rohre und RNase-freie ddH₂O vorbereiten.
2. Übertragen Sie bis zu zwölf 190 L Kollagenmatrizen aus 81-Mikrowell-Agarose-Gussgüssen in ein 15 ml-Rohr. Greifen Sie eine Ecke der Kollagenmatrix in der Säkammer der Agarose mit schlanker Spitzenpinzette und schälen Sie sie von der Agarose, die in einer einzigen, selbstbewussten Bewegung gegossen wird.
   HINWEIS: Die Matrizen können auch bei -80 °C eingefroren werden, bis sie für die RNA-Extraktion bereit sind.
3. 1 ml Guanidiniumthiocyanat mit Phenol (siehe Materialtabelle)zu den Kollagenmatrizen in der 15 ml-Röhre geben.
   HINWEIS: Das Guanidiniumthiocyanat mit Phenol muss die Kollagenmatrizen vollständig abdecken.
4. Wirbel die Rohre für 10-u201220 s.
5. Homogenisieren Sie die Matrizen mit 20 G Nadeln und 5 ml Spritzen, bis sie vollständig gelöst sind.
6. Lassen Sie die Matrizen für 5 min bei RT sitzen.
7. Fügen Sie den Matrizen 200 l reines Chloroform hinzu und schütteln Sie das Rohr 15 s kräftig.
8. Die Mischung sofort auf 1,5 ml-Rohre übertragen.
9. Lassen Sie die Mischung mindestens 5 min bei RT sitzen, bis die Phasen getrennt sind.
10. Zentrifugieren Sie die 1,5 ml-Rohre bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
11. Füllen Sie ein neues 1,5 ml-Rohr mit 500 l 70% Ethanol.
    HINWEIS: Abhängig vom Volumen der wässrigen Phase nach der Zentrifugation (siehe Schritt 9.12. dies darf nicht 500 l sein. Die Menge von 70% Ethanol sollte dem Volumen der wässrigen Phase entsprechen.
12. Die obere wässrige Phase der zentrifugierten Proben vorsichtig auf das 70% mit Ethanol gefüllte Rohr übertragen und durch Pipettieren nach oben und unten gründlich vermischen.
13. (Kritischer Schritt 6) Achten Sie darauf, die Schichten am Boden des Guanidiniumthiocyanats mit Phenoltrennung nicht zu stören, während Sie die obere Phase entfernen, da dies die RNA kontaminieren wird.
14. Fügen Sie die Probe einer RNA-Extraktionsspalte hinzu (im RNA-Extraktionskit enthalten, siehe Tabelle der Materialien). Von hier aus folgen Sie dem Herstellerprotokoll zur RNA-Reinigung aus Zellen.

Ergebnisse

Das 3D-Cokulturmodell ermöglicht verschiedene Assays, die in Abbildung 1Adargestellt sind und bei Bedarf kombiniert oder geändert werden können. In unserem etablierten Versuchsaufbau werden Tumor- und T-Zellen für 2 Tage ko-kultiviert, gefolgt von der Einleitung des Invasions-Assays zur Auswahl invasiver und/oder resistenter Tumorzellen (Abbildung 1B). Am 4. Tag wird die Quantifizierung der Invasion durchgeführt und "Überlebende" Zellen werden aus der Koll...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode beschreibt die 3D-Tumorsphäroid-Generierung, die eine Kokultur mit T-Zellen, zellbasierte funktionelle und molekulare Assays sowie eine Vielzahl von Überwachungs- und Analysemöglichkeiten mit einem einzigen Gerät ermöglicht. Der hauptvorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass er keine Übertragung der 3D-Kultur auf einen separaten Assay erfordert und die Integrität der 3D-Kultur während der gesamten Assays aufrechterhält.

Der hier vorgestellte Workflow k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Petri Dishes	Microtissues Inc	Z764019 & Z764051	referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides	Lab-Tek	154534
Agarose Type I, low EEO	Sigma-Aldrich	A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody	Agilent	K4003	ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
Collagenase Type 4, 1 g	Worthington	LS004188
DMEM, fetal bovine serum	ThermoFisher	11965092, 16000044	referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin	ThermoFisher	SH30-500D
HistoGel	ThermoFisher	HG-4000-012	referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst	Life Technologies	H1399	1/1000 dilution
Phalloidin 546	Invitrogen	486624	1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody	Cell Signaling	98941	1/25 dilution
rat anti-keratin 8	DSHB	TROMA-I AB_531826	1/500 dilution
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI	ThermoFisher	11875093	for T-cell culture medium
Triton X-100	BioRad	1610407	referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol	ThermoFisher	15596026	referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE	ThermoFisher	12604013	referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols