JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

Abstract

התקדמות משמעותית נעשתה בטיפול בסרטן עם אימונותרפיה, למרות מספר רב של סוגי סרטן להישאר עמידים לטיפול. מספר מוגבל של אסות מאפשרות ניטור ישיר ותובנות מכניות על האינטראקציות בין תאים סרטניים ותאי מערכת החיסון, ביניהם, T-תאים לשחק תפקיד משמעותי בביצוע התגובה cytotoxic של המערכת החיסונית אדפטיבית לתאים סרטניים. רוב ההתאסות מבוססות על דו מימדי (2D) שיתוף תרבות של תאים בשל קלות השימוש היחסית, אבל עם ייצוג מוגבל של פנוטיפ צמיחה פולשנית, אחד סימני ההיכר של תאים סרטניים. מערכות שיתוף תרבויות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נוכחיות דורשות ציוד מיוחד או ניטור נפרד לפלישה לתאים סרטניים בעלי תרבות שיתופית ולאינטראקציה עם תאי T.

כאן אנו מתארים גישה כדי לפקח בו זמנית על התנהגות פולשנית ב3D של כדורי תאים סרטניים וcytotoxicity T-cell בתרבות השותפות. היווצרות ספרואיד מונעת על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בדגומים ללא אגרוז microwell יצוקות עם תחתיות בצורת U. הן T-cell שיתוף-תרבות ופלישה לתאים סרטניים לסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך microwells של יציקות agarose ללא צורך להעביר את התאים, ובכך שמירה על מערכת 3D שלם שיתוף תרבות לאורך כל ההסכם. ניתן להפריד את מטריצת הקולגן מהיצוק של אגרוז, המאפשר הכתמת אימונו-לוד (IF) והדמיה קונפוקולית של תאים. כמו כן, תאים יכולים להיות מבודדים לצמיחה נוספת או נתון לניתוחים כגון עבור ביטוי גנים או פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS). לבסוף, ניתן לנתח את התרבות ההפוכה תלת-מיוד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) לאחר הטבעה וקוריה. שינויים אפשריים של ההסדה כוללים קומפוזיציות שונות של מטריצה חוץ תאית (ECM) כמו גם הכללה של תאים סטרומה או חיסוניים שונים עם התאים הסרטניים.

Introduction

למרות שיפורים משמעותיים אימונותרפיה סרטן בעשור האחרון, ההבנה המכנית שלנו של רגישות והתנגדות לטיפולים הם עדיין עניים למדי1. זה מבוסס היטב כי גידולים להציג הטרוגניות משמעותית, כי האינטראקציות הדינמיות של התאים הסרטניים עם microenvironment שלהם, כמו גם עם התאים החיסוניים, השפעה על מוות תאי הגידול, התנהגות פולשנית ותגובה לטיפולים הכוללים אימונותרפיה1,,2,,3. כזרוע אחת של המערכת החיסונית הסתגלנית, תאי T מבצעים ציטוקסיות ספציפית לתא. הניתוח של זיהוי T-תא ותגובה לתאים סרטניים מספק תובנות מכניות להתנגדות ורגישות לטיפולים אפנון חיסוני.

במבחנה מידול וניטור אינטראקציות בין סרטן ותאי T בסביבה המתאימה היה מאתגר ועד כה, הביא תובנות מכניות מוגבלות. רוב ההתאסות המבוססות על תאים מסתמכות על סביבה דו-ממדית (דו-ממדית), כי חסר תכונות מפתח כי הם קריטיים עבור סיכום תלת מימדי (3D) בפיזיולוגיה vivo4,5,6,כל כךאינטראקציות תא מרחבי, מגע עם מטריצה חוץ תאית (ECM)7, ביקושחילוף חומרים דינמי, היפוקסיהמוגברת בשל צמיחה המונית 8, והשפעות של microenvironment הגידול (TME)9. מצד שני, יש עדיין מספר חסרונות עם כיום בשימוש תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות ומערכות אסה פלישה: (1) את הזמן גוזל אופי של דורספרואידים וקציר 5,10, (2) חוסר שליטה על גודל spheroid,צפיפות צורה ותא 11,12, (3) סוג תפוקה נמוכה תפוקה אומר, (4) הדרישה עבורציוד מיוחד 13,14, (5) הצורך להעביר את התרבות ההתוכית לסביבותנפרדות עבור 15, 16,16,17. בפרט, העברת תרבות שיתוף סד לעתים קרובות מוביל לשיבוש של spheroids ואובדן שלמות התרבות ההתופת. זה חל במיוחד על ספרואידים "רופפים" עם הדבקה מופחתת תא. לדוגמה, רוב המקרים של פלישה תלת-מית'ר דורשים שספרואידים נקצרים לאחר היווצרותם הראשונית ולאחר מכן יתפרסו מחדש ב- ECM14,15,16. שלב זה של התחדשות פעולה כתוצאה מאובדן שליטה על המרחק בין spheroids. מאז המרחק בין spheroids הגידול משפיע על ההתנהגות הפולשנית שלהם, אובדן זה של שליטה מציג סטייה בין-אסראי גבוהה ומפחית את הרבייה. יתר על כן, היישום של שברים תאים אומר על ידי צעדי צנטריפוגציה עוקבים להערכת היקפית וגודול spheroid חדירה תאים חיסוניים מוגבלת לאוכלוסיות תאים סרטניים המייצרים spheroidsיציב יותר 17.

קונספט וגישה

הגישה שלנו מטפלת בליקויים הנ"ל באמצעות מודל "All-in-One" – מודל תרבות שיתופית של ספרואיד תלת-מימד, שאינו דורש העברת ספרואידים עבור האמורות הבאות. התאמנו מכשיר היווצרות spheroid (ראה טבלת חומרים)כדי ליצור תס"א לניטור בו זמנית התנהגות פולשנית של תאים סרטניים וcytotoxicity של תאי T תרבויות. שיטה זו ידידותית למשתמש, זולה ומאפשרת טיפול מהיר וקל בהגדרה תלת-מית-מית-מית-תפוקה גבוהה יחסית. בהתאם לסוג ההתקן המשמש, ניתן ליצור עד 81 כדורי spheroid גדולים בגודל אחיד בשלב pipetting יחיד עם שליטה על גודל spheroid בודד על ידי שינוי מספר התאים שנזרעו. היווצרות ספרואיד נכפתה על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בפיגומים ללא agarose יצוק מרובה היטב עם תחתיות בצורת U. התאמנו את מערכת תלת-מיD זו עבור מחקרים פונקציונליים דינמיים מבוססי תאים, כמו גם נקודות קצה מולקולרי וביוכימי ים הכוללים פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS), immunofluorescence (IF) או אימונוהיסטוכימיה (IHC) הכתמה, כמו גם ניתוח ביטוי גנים של התרבות השותפות 3D שלם.

עבור מחקריםפונקציונליים , הטבעת spheroids בסוג אני קולגן בתוך agarose מטיל תוצאות פלישה של תאים סרטניים מspheroids equidistant ומאפשר ניטור תכונות חיוניות קו תאים ספציפיים, כגון תא יחיד לעומת הגירה תא קולקטיבי18,,19. יתר על כן, מטריצת קולגן מופרדת בקלות מן יצוק agarose, וכתוצאה מכך תיקון עבה 1\u20122 מ"מ המכיל spheroids מרובים, אשר ניתן לעבד עוד יותר עבור IF-כתמים והדמיה על ידי מיקרוסקופית confocal. זה יכול לחשוף פלישה תאים ברורים ואינטראקציות מטריצת תא בהקרנה בתפוקה גבוהה. כמו כן, תאים במטריצת הקולגן ניתן לבודד לאחר עיכול קולגן ותנתק תא יחיד עבור טיפוח תאים הבאים או ניתוח.

לניתוח IHC של spheroids, לאחר קיבעון וקטוס של יצוק agarose, חלבונים או מולקולות אחרות של עניין ניתנים לזיהוי תוך שמירה על העמדות הגיאוגרפיות של spheroids. בגישה המתוארת כאן, spheroids מוטבעים ישירות Hydroxyethyl agarose עיבוד ג'ל בתוך יצוק agarose ואת הג'ל משמש "מכסה" כדי לשמור על spheroids בתחתית microwells. לאחר הטמימת הפרפין של יציקת agarose20, קטע אופקי סדרתי מבוצע עם החלק התחתון של הגבס משמש כנקודת ההתחלה.

גישה זו מנוגדת לניתוח IHC קונבנציונלי של spheroids הדורש קצירת תאים לפני הטבעה בג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose21 וסיכונים הפרעה של spheroids ובכך לאבד את הסידור המרחבי של תאים. כמו כן, שברת תאים על ידי צנטריפוגציה להערכה אם תאים חיסוניים חדרו או נשארו היקפיים לספרואידיםגידול 17 נמנע על ידי הטבעה ישירה.

יתר על כן, 3D שיתוף תרבות יכול להתבצע על ידי גידול admixing, סטרומה או תאים חיסוניים, ובכך ללמוד crosstalk תא סרטני או סיכום microenvironments גידול שונים לניתוח אינטראקציות תא-תאים כולל תרבויות מצטלבות עם תאים אנדותל16.

הגדרה זו 3D spheroid שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לבצע שיתוף תרבות של סוגי תאים שונים הנוכחי microenvironment הגידול כדי להעריך את ההשפעות של אלמנטים ECM שונה. מלבד סוג אני קולגן, רכיבים אחרים ECM (למשל, מטריג'ל, תערובת מטריג'ל / קולגן, פיברונקטין), ניתן להשתמש מאז פלישת תאים סרטניים מושפעת השפע של מצעיםשונים 22. כמו כן, microwells של יצוק agarose מתאימים להיווצרות spheroid של קווי תא ראשיים עבור תאים עם הדבקה תא נמוך.

Protocol

רשימה והסבר של כמה מילים הנמצאות בשימוש תכוף לאורך הפרוטוקול ניתן למצוא בקובץ משלים 1.

1. דור של כדוריות

  1. הכנה ו autoclave 2% agarose ב 1x PBS (למשל, 1 גרם agarose ב 50 מ"ל של 1x PBS) ו autoclave 35- ו 81 מיקרווול גומי תבניות.
    התראה: הימנע משימוש באגהרוז עם התכה נמוכה ליצירת יצוק agarose לעיבוד IHC.
  2. הכן גבס אגרוז
    הערה: 35 יציקות מיקרווול משמשות לפלישה, אימונו-לודיזם (IF) ובידוד תאים. 81-microwell יצוק משמשים cytotoxicity, אימונוהיסטוכימיה (IHC), בידוד תאים ואסמים מיצוי RNA.
    1. לאחר agarose כבר autoclaved, לתת agarose מותך מגניב על 60\u201270 °C. בשכונה תרבות תא, להשתמש בטכניקה aseptic פיפטה 500 μL של agarose מותך לתוך תבנית גומי 81 מיקרווול לכל באר או 330 μL לתוך תבנית גומי 35 מיקרווול לכל באר.
      התראה: הימנע מיצירת בועות תוך ערבוב או צנרת agarose. הסר את כל הבועות על ידי התפתות בעדינות.
    2. לאחר התגבשות ההתגבשות, התכווץ בזהירות את תבנית הגומי כדי להסיר ממנה את הגבסה. בזאת, מניחים את הידיים מעל צלחת הבאר המתאימה ותנו ליצוק היגרוז ליפול ישר לתוך באר אחת של הצלחת.
      הערה: כופף את תבנית הגומי בתנוחות שונות כדי להימנע מגמישות יתר. זה יכול להיות מועיל כדי להגמיש את תבנית גומי ולדחוף בעדינות מלמטה באותו הזמן.
    3. כדי לצייד את יצוק agarose, להוסיף מדיום תרבות התא, המורכב DMEM בתוספת 10% סרום של 10% קנקן עוברי (2.5 מ"ל / גם עבור צלחת 12-באר ו 1 מ"ל / גם עבור צלחת 24-well). מכניסים את הצלחת היטב לדגירה של תא (37°C, 5% CO2)ותדגירה למשך שעה אחת.
  3. בינתיים, להכין את תרבות התא לזרעה.
    הערה: מספר זריעת התא הכולל לכל יצוק agarose הוא להיקבע על ידי החוקר. עבור קווי תאים סרטניים בלבלב הראשי murine, 35,000 תאים/35-microwell יצוק ו 81,000 תאים / 81-microwell יצוק (בממוצע 1000 תאים / spheroids) הם זרעים עבור כל האמורות הבאות. הקוטר הממוצע של ספרואיד הוא כ 150\u2012200 μm לאחר 48 שעות.
  4. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose עם פיפטה P1000 הראשון על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן הסירו בזהירות את המדיום בתא ההזרעה.
  5. בזהירות זרע את המתלה תא הגידול מוכן טיפה-חכם לתוך תא זריעה תא. בזהירות לשים את הצלחת היטב בחזרה לתוך אינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2)במשך 15 דקות.
    הערה: במהלך שלב זה התאים יתמקמו לתוך microwells של יצוק agarose.
  6. הוסף מדיום נוסף אל החלק החיצוני של יצוק agarose (2.5 מ"ל / גם עבור צלחת 12-באר ו 1 מ"ל / גם עבור צלחת 24-באר).
  7. להחזיר את צלחת הבאר לאקובטור של תרבית התאים (37°C, 5% CO2)למשך 48 שעות.
    הערה: בדרך כלל זה לוקח עד כמה שעות עבור התאים ליצור spheroids במיקרווול. באופן כללי, spheroids תא סרטני מוצק נוצרים לאחר 24 שעות והם יציבים לאחר 48 שעות. עם זאת, הדבר עשוי להשתנות בין קווי תא שונים. במידת הצורך, לשנות את רמת תא בינוני על ידי הטיה בזהירות את הצלחת היטב עם יצוק agarose והסרת מדיום תרבות התא שמסביב עם P1000 pipette. לאחר מכן להוסיף בזהירות מדיום טרי על ידי pipetting אותו לאורך הקיר של הבאר. בדרך כלל אין צורך לשנות את המדיה בתוך השחקנים בשל נפח קטן שלה ואת הסיכון של הסרת spheroids.

2. שיתוף תרבות עם תאי T

  1. תפנס מחדש את המספר הנדרש של תאי T ב 75 μL (35-microwell יצוק) או ב 190 μL (81-microwell יצוק) של אמצעי תרבות T-cell המתאים (RPMI בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי ו 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין).
  2. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose עם פיפטה P1000 הראשון על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן, לאט ובזהירות, הסר את המדיום בתוך הגבס על-ידי מיקוד עדין של פינה אחת של תא ההזרעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על צלחת היטב מוטה ביד השנייה.
  3. (שלב קריטי 1) כפי שיש סיכון של הסרת spheroids, שליטה על אובדן של spheroids על ידי השוואת מספר spheroids בתוך microwells לפני ואחרי הסרת המדיום על ידי צפייה תחת המיקרוסקופ ב 10x הגדלה.
  4. בזהירות זרעו את המתלים T-תא טיפה חכם לתוך תא זריעה של agarose יצוק על ידי החזקת פיפטה P200 על 0.5 ס"מ מעל הגבס.
  5. (שלב קריטי 2) נכון גם לשטוף את כדורי המידע תוך הוספת תאי ה-T. לכן, זה קריטי להוסיף את תאי T לאט מאוד על 0.5 ס"מ מעל תא הזרעה.
    הערה: אפשרות אחת כדי להקטין את מספר spheroids החוצה שטף היא על ידי הצבעת פיפטה לפינה אחת של תא זריעה תוך הוספת תאי T, ובכך רק לסכן את spheroids בפינה זו כדי להיות שטוף החוצה.
  6. בזהירות למקם את צלחת היטב בחזרה לתוך אינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2)במשך 15 דקות.
  7. להוציא את צלחת היטב מן האינקובטור ולהוסיף מדיום תרבות תא טרי (RPMI בתוספת עם 10% סרום בשר עוברי ו 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין) סביב agarose יצוק על ידי לאט pipetting אותו לאורך הקיר של הבאר.
  8. תחזיר את צלחת הבאר לאקובטור של תא למשך 48 שעות.

3. הטבעת תרבות תלת-מית-ית-ת-ית-עורית למטריצת קולגן מסוג I

  1. הכן קולגן מסוג I מנוטרל
    1. לדלל את קולגן המניות עם סרום חינם בסיס בינוני (RPMI) לריכוז עבודה סופי של 3 מ"ג/ מ"ל. עבור כל 100 μL של קולגן מדולל, להוסיף 11 μL של PBS 10x ו 1.2 μL 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH).
    2. לשמור על קרח דגירה (לנטרל) במשך 1 שעה.
  2. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose עם פיפטה P1000 הראשון על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן, לאט ובזהירות להסיר את המדיום בתוך הגבס על ידי מיקוד בעדינות פינה אחת של תא זריעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על צלחת היטב מוטה ביד השנייה.
    הערה: כאן, זה קריטי להסיר לחלוטין את מדיום תרבות התא המקיף את יצוק agarose.
  3. בזהירות פיפטה הקולגן מנוטרל אני מערבב טיפה חכם לתוך תא זריעה של agarose יצוק על ידי החזקת פיפטת P200 על 0.5 ס"מ מעל הגבס.
  4. מכניסים את הצלחת היטב מיד לתוך אינקובטור תרבות התא במשך 4 דקות (35 מיקרווול יצוק) או 5 דקות (81 מיקרווול יצוק).
    התראה: (שלב קריטי 3) חשוב לשמור בקפדנות על זמן הדגירה הנתון. אחרת, ייתכן שההתנהגות הפולשנית לא תהיה ניתן לשחזור.
  5. להפוך את צלחת הבאר ולהשאיר אותו התהפך באינקובטור במשך 1 שעה.
    הערה: הגבס יישאר מחובר לתחתית לוחית הבאר בשל מתח פני השטח. במקרה של תרבות תאים מיוחדת בינונית עם ריכוז סרום גבוה (למשל, RPMI בתוספת 20% סרום שורי עובר) משמש, צעד כביסה נוסף עם PBS 1x לאחר הסרת המדיום בבאר עשוי להיות נחוץ כדי להגביר את מתח פני השטח.
  6. תוציא את הצלחת מהאינקובטור ותהפוך אותה בחזרה. להוסיף מדיום תרבות תא טרי (RPMI בתוספת עם 10% סרום בשר עוברי ו 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין) סביב agarose יצוק על ידי לאט pipetting אותו לאורך הקיר של הבאר.
  7. תחזיר את צלחת הבאר לאקובטור של תא במשך 48 שעות.

4. סיטוקסיסיטי

  1. הכן 3 מ"ל של PBS 1x עם 2% סרום של 2% קנקן קנקן agarose.
  2. לאחר שיתוף תרבות עבור 4 d, להסיר את מדיום תרבות התא סביב יצוק agarose עם פיפטה P1000 על ידי הטיה קלה את צלחת היטב עם היד השנייה.
    הערה: תקופת הזמן הכוללת של שיתוף התרבות היא להיקבע על ידי החוקר.
  3. להפיץ 1 מ"ל של 1x PBS + 2% FBS עם P1000 pipette לתוך תא זריעה כדי לנתק את spheroids מן microwells.
  4. חזור על שלב 4.3 פעמיים עם עוצמת הקול בבאר ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 10 s בטמפרטורת החדר (RT).
  6. הסר בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה P1000.
  7. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS 1x עם 2% FBS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 1 דקות ב RT.
  8. חזור על שלב הכביסה (שלב 4.7).
  9. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון אנזימי דיסוציאציה תא (ראה טבלת חומרים).
  10. השתמש בפיפטה P200 ופיפטה למעלה ו למטה כדי לשבור את אשכולות התאים.
  11. דגירה התאים במשך 20 דקות באינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2).
  12. חזור על שלב 4.10.
    הערה: קח ~ 10 μL החוצה זרע על צלחת תרבות תא להתבונן (תחת המיקרוסקופ בהגדלה 10x) כמה טוב spheroids יש ניתוק בתאים בודדים. במידת הצורך, להוסיף 5 דקות של דגירה נוספת.
  13. להוסיף 4 מ"ל של תא מלא תרבות בינונית (RPMI בתוספת עם 10% סרום נקניק עוברי 100 יחידות / mL פניצילין / סטרפטומיצין) ולערבב על ידי היפוך הצינור 3\u20124 פעמים.
  14. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  15. הסר את supernatant וssuspent את התאים במאגר FACS עבור התכתמות Annexin V של תאים אפופטוטיים.
    הערה: מכאן ניתן לבצע כל כתמים וניתוח תאים של FACS.

5. הידרוקסיאתיל agarose עיבוד ג'ל הטבעה עבור IHC מקטע

הערה: כאן זה קריטי כדי להימנע משימוש agarose נמס נמוך ליצירת יצוק agarose.

  1. בסוף התרבות ההגמרית, הסר את מדיום תרבות התא המקיף את היצוק agarose עם P1000 פיפטה הראשונה על ידי הטיית צלחת היטב. לאחר מכן, לאט ובזהירות, הסר את המדיום בתוך הגבס על-ידי מיקוד עדין של פינה אחת של תא ההזרעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על צלחת היטב מוטה ביד השנייה.
  2. לאט פיפט 10% פורמלין הראשון בתא הזרעה על ידי מיקוד בעדינות פינה אחת של תא הזרעה עם פיפטה P200. לאחר מכן להוסיף 10% פורמלין אל החלק החיצוני של הגבס agarose עד שהוא מכוסה לחלוטין. לתקן את הגבס agarose ב 10% פורמלין עבור 1 d.
  3. הסר את הפורמלין ביום שלמחרת.
  4. בזהירות פיפטה 210 μL (81-microwell יצוק) או 100 μL (35-microwell יצוק) של ג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose חימום מראש (ראהטבלת חומרים) ירידה חכם לתוך תא זריעה של agarose יצוק על ידי החזקת P200 פיפטה על 0.5 ס"מ מעל הגבס.
  5. תן ג'ל עיבוד agarose הידרוקסיאתיל לגבש במשך 10 דקות ב RT.
  6. העבר את גבס agarose ל- PBS 1x.
    הערה: לאחסון ארוך יותר, הטבע את הגבס ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום.
  7. מייבשים את מקטעי הג'ל באמצעות סדרת אתנול (שעה אחת כל אחד: 70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול [3x משתנה כל אחד]). לאחר מכן ברור בתמיסת סליקה 3x עבור 1 שעה כל אחד (למשל, פחמימנים aliphatic [למשל, Clearite], או קסילן), ולחדור עם פרפין מותך (3x עבור 1 שעה כל אחד), או באופן ידני או בעיבוד רקמות. הטבע את הגבס בשעוות פרפין למקטעים הבאים ב 5 μm לכל קטע.
  8. להסיר שעווה על ידי לשים שקופיות xylenes, 3x עבור 3 דקות כל אחד, לאחר מכן rehydrate רקמות קטעים באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת: 100% אתנול עבור 2 דקות, 95% אתנול עבור 1 דקות, 80% אתנול עבור 30 s ו 70% אתנול עבור 30 s, ואז מקום במים.
  9. לבצע אחזור אפיטופ המושרה חום באפיטור ירקות ב 100 ° C במשך 20 דקות, ואחריו 20 דקות של קירור ב10 mM נתרן ציטראט pH 6.0 פתרון ולחסום peroxidases אנדוגני עם H2O2.
  10. חסמו את המקטעים עם סרום מטרה רגיל ולחשוף אותם נוגדן נגד CD8 (דילול 1/25) בן לילה.
  11. החל נוגדנים משניים נגד ארנב-HRP (ראה טבלת חומרים)ולפתח את הכתמים באמצעות כרומגן 3,3'-Diaminobenzidine (DAB). גרעין נגדי עם תמיסת המטוקסילין של האריס ב-11% (ראה טבלת חומרים).

6. ניטור וניתוח של פלישת ספרואידים בתרבות ההשתתפת

הערה: נקודת הזמן של פלישת כדורי הדמיה לתוך מטריצת הקולגן אני הוא להיקבע על ידי החוקר. לרכוש תמונות תרבות התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה 10x. נקודת הזמן האידיאלית תלויה בקו התא שנבחן, כמו גם ברכיב ECM. קווי תאים פולשניים יותר יתחילו להתפשט לתוך הקולגן בתוך כמה שעות לאחר הוספת הקולגן. מאז T-תאים בתרבות ההפעולה עשוי למנוע תצוגה מלאה על הנסיגה מן spheroids בנקודות זמן מוקדמות מאוד, בדרך כלל תמונות נלקחות ב 0 h (כפי סימוכין), 24 שעות ו 48 שעות לאחר הוספת הקולגן.

  1. פולשניות כמותית על ידי ספירה ידנית של מספר "קוצים" יוצא spheroid ו / או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, למשל, תמונה J.
    1. נתח את הפלישה כמספר "קוצים" מהספרואיד על-ידי ספירה ידנית של מספר "הקוצים" של ספרואיד.
      הערה: זה יוחלט על ידי החוקר אילו בלטים מן spheroids נחשבים "קוצים". קריטריון החלטה יכול להיות אורך ה"ספייק" הנמדד מקצה הספירואיד.
    2. לנתח את הפלישה כאזור הפלישה יחסית לגודל של spheroid.
      1. השתמש בכלי ציור יד חופשית (תמונה J) כדי לעקוב אחר הגבול של האזור הכולל (פלישה + אזור spheroid).
      2. לחץ על נתח בתפריט העליון ולאחר מכן לחץ על מדידה כדי להציג את מדידת האזור.
      3. עקוב אחר הגבול של אזור הספירואיד הכולל.
      4. לחץ על נתח בתפריט העליון ולאחר מכן לחץ על מדידה כדי להציג את מדידת האזור.
      5. העתק את רשימת התוצאות שנמדדו לתוך גיליון אלקטרוני וחשב את הפלישה/spheroid הכולל באמצעות הנוסחה: הפלישה הכוללת = שטח/ספרואיד סה"כ.

7. מכתמי חיסון

  1. הכן את הפעולות הבאות.
    1. הכן 5.4% פורמלין (5 מ"ל) באמצעות 2.3 מ"ל של PBS 1x ו 2.7 מ"ל של 10% פורמלין.
    2. להכין 0.5% Octoxynol (50 מ"ל) באמצעות 50 מ"ל של 1x PBS ו 2.5 מ"ל של 10% אוקטוקסינול (חנות ב RT).
    3. להכין אם Buffer (200 מ"ל) באמצעות 200 מ"ל של 1x PBS, 200 מ"ג סרום סרום של צות (BSA), 4 מ"ל של 10% Octoxynol, 1 מ"ל של 10% polysorbate 20 (להתחמם RT לפני השימוש; לסנן ולאחסן ב 4 ° C).
    4. להכין פתרון חסימה (5 מ"ל) באמצעות 5 מ"ל IF Buffer ו 500 μL של סרום עז (להתחמם RT לפני השימוש).
    5. שמור שקופיות תאיות עם 8 בארות, כיסויי זכוכית והמדיה להרכבה מוכנים.
  2. היום ה-0
    1. לתקן את כל גבס agarose, כולל spheroids, לילה ב 5.4% פורמלין ב RT בתא לח.
  3. היום הראשון
    1. הסר את מדיום תרבות התא המקיף את היצוק agarose עם פיפטה P1000 על ידי הטיית צלחת היטב.
    2. מעבירים את תיקון הקולגן לשקופית של 8 בארות על-ידי תפיסת פינה של מטריצת הקולגן בתוך תא ההזריעה של גבס היגרוז עם פינצטה מלוטשת ומחודדת ומקלף אותה מהיציק של ה"א-רוז" בתנועה אחת ובטוחה בעצמה.
      הערה: יש להפריד בקלות את מדבקת הקולגן מהיצק של agarose. אחרת, השתמש בפיפטה P1000 כדי להוסיף בזהירות את מדיום התרבות באזור תא הזרעה או להפוך את יציקת agarose ולנער בעדינות את צלחת היטב כדי לנתק את מטריצת הקולגן.
    3. להוסיף 250 μL של 0.5% אוקטוקסינול (ראה טבלת חומרים)לכל באר. דגירה לשעה אחת בRT.
    4. לשאוף את Octoxynol ולהוסיף 250 μL של חסימת פתרון לכל באר. בלוק לשעה אחת בRT.
    5. בינתיים, לדלל את הנוגדן העיקרי (דילול אנטי קרטין 8: 1/500; פאלודין 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) בפתרון חסימה, חישוב עבור 250 μL לכל באר.
    6. הוסף את הנוגדן העיקרי בחסימת פתרון והניח את שקופית התא בתא לח לצורך דגירה לילית ב-RT.
  4. היום השני
    1. הסר את הנוגדן הראשי בחסימת פתרון על-ידי שאף.
    2. לשטוף 3 פעמים על ידי הוספת 300 μL של IF Buffer ולתת לו לשבת במשך 5 דקות ב RT.
      הערה: פשוט תן לו לשבת, אין צורך לשים אותו על שייקר.
    3. לדלל את הנוגדן המשני בתמיסת חסימה (עבור אנטי קרטין 8: נגד חולדה, דילול 1/500).
    4. להוסיף 250 μL של נוגדן משני בחסימת פתרון לכל באר דגירה במשך 1 שעה ב RT. ממכאן מכאן, להגן על הדגימות מפני אור.
    5. הסר את הנוגדן המשני בחסימת פתרון על-ידי שאף.
    6. לשטוף 3 פעמים עם 300 μL של אם מאגר על ידי הוספה ולתת לו לשבת במשך 5 דקות ב RT.
    7. לשטוף את הדגימות עם PBS 1x ולאסוף אותו.
    8. הסר בזהירות את קירות מגלשת התא כך שרק החלקת הזכוכית בתחתית נשארה.
    9. הוסף לפחות 200 μL של מדיה הרכבה לכיסוי זכוכית ושחרר לאט את כיסוי מעל המדגם.
      הערה: הימנע מיצירת בועות מכיוון שזה ישפיע על איכות התמונה. ניתן למנוע בועות על-ידי הצבת פתק הכיסוי בעדינות בקצה הארוך של השקופית בזווית של 45° או הורדה איטית של החלקת הכיסוי בשקופית.
    10. מניחים את הדגימות הרכובות במקום חשוך ויבש ותנו להן לשבת למשך הלילה. ניתן לבצע הדמיה ביום שלמחרת.
      הערה: כיסוי עשוי בתחילה להזיז קצת פעם אחת הניח מעל תיקון קולגן. תנו לשקופית הזכוכית לשבת על אזור שווה לכמה דקות. כיסוי יהיה לשטח את הדגימה כך שלא יהיה רווח עזב בין מגלשת הזכוכית וכיסוי לאורך זמן.

8. בידוד תאים מטריצת הקולגן

  1. הכן את הפעולות הבאות.
    1. להכין 1 מ"ג/ מ"ל קולגנאז 4 במדיום תרבות תא המכיל סרום (לאחסן aliquoted קולגנאז 4 דילול ב -20 °C)
    2. להכין 2.5% BSA ב 1x PBS ולציפוי כל הצינורות וטיפים פיפטה עם זה (פתרון BSA מסנן לפני השימוש).
    3. לפני חום פתרון BSA ותרבות התא בינוני לפני השימוש.
  2. להכין 2 מ"ל של קולגנאז 4 פתרון (1 מ"ג / מ"ל) לעכל מקסימום של שלוש מטריצות קולגן מ 35-microwell agarose יצוק.
  3. להעביר עד שלושה מטריצות קולגן 75 μL מ 35-microwell agarose מטיל לתוך 2.5% BSA מראש מצופה צינור 15 מ"ל. אחז בפינה של מטריצת הקולגן בתוך תא ההזריעה של היגרוז עם פינצטה מלוטשת מחודדת וקלף אותה מהיצק של ה"אגרוז" בתנועה אחת ובטוחה בעצמה.
  4. לחתוך את הקצה של קצה P1000 עם מספריים. לפני מעיל הקצה הנותר עם 2.5% BSA ולשבור את מטריצת הקולגן ככל האפשר על ידי pipetting למעלה למטה. דגירה הצינור במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  5. (שלב קריטי 4) בכל 5 דקות, בדוק אם מטריצת הקולגן התמוססה. פיפטה למעלה ומטה שוב לפני לוקח 10 μL של הדגימה החוצה ולזרע אותו על צלחת תרבות תא להתבוננות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה 10x. להוסיף עוד 5 דקות במידת הצורך.
  6. מלא את הצינור עם 10 מ"ל של חום מראש תא תרבות בינוני (DMEM בתוספת עם 10% סרום שוור עוברי). מערבבים בעדינות על-ידי היפוך הצינור 3\u20124 פעמים.
  7. צנטריפוגה הצינור ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  8. בזהירות להסיר את supernatant ולהשאיר 2 מ"ל של נפח.
  9. (שלב קריטי 5) השאר 2 מ"ל לאחר צעד הצנטריפוגה הראשון כפי שעדיין יכול להיות קולגן לא פתור בתחתית הצינור נושא תאים לאורך אותם.
  10. בצע שני שלבי כביסה על-ידי הוספת 10 מ"ל של תא המכיל סרום בינוני בכל פעם. צנטריפוגה בכל פעם ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  11. לאחר שלב הכביסה האחרון, הסר בינוני ככל האפשר ולהשאיר רק את גלולת התא.
  12. תולה מחדש את גלולת התא ב- 1 מ"ל של תמיסת אנזימי דיסוציאציה של תאים (ראה טבלת חומרים).
  13. השתמש בפיפטה P200 ופיפטה למעלה ו למטה כדי לשבור את אשכולות התאים.
  14. דגירה התאים במשך 20 דקות באינקובטור תרבות התא (37 ° C, 5% CO2).
  15. חזור על שלב 8.13.
    הערה: לקחת ~ 10 μL החוצה זרע על צלחת תרבות תא להתבונן תחת המיקרוסקופ בהגדלה 10x כדי לראות כמה טוב spheroids יש ניתוק לתאים בודדים. במידת הצורך, להוסיף 5 דקות של דגירה נוספת.
  16. להוסיף 4 מ"ל של תא תרבות בינונית (DMEM בתוספת עם 10% סרום שור עוברי) ולערבב על ידי היפוך הצינור 3\u20124 פעמים.
  17. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 4 דקות ב RT.
  18. הסר את הסופרנטנט. מכאן ואילך, ניתן לבצע כתמימת FACS או תרבות תאים.

9. חילוץ RNA מטריצת הקולגן

  1. להכין guanidinium thiocyanate עם פנול (ראה טבלת חומרים),100% כלורופורם, 70% אתנול ללא RNase, ערכת מיצוי RNA (ראהטבלת חומרים), RNase חינם 1.5 מ"ל צינורות, RNase חינם 15 mL צינורות RNase ו RNase חינם ddH2O.
  2. להעביר עד 12 190 מטריצות קולגן μL מ 81-microwell agarose יצוק לתוך צינור 15 מ"ל. אחז בפינה של מטריצת הקולגן בתוך תא ההזריעה של היגרוז עם פינצטה מלוטשת מחודדת וקלף אותה מהיצק של ה"אגרוז" בתנועה אחת ובטוחה בעצמה.
    הערה: ניתן גם להקפיא את המטריס ב-80°C עד להכנות לחילוץ RNA.
  3. להוסיף 1 מ"ל guanidinium thiocyanate עם פנול (ראה טבלת חומרים)למטריצות קולגן בצינור 15 מ"ל.
    הערה: הגואנידיניום טיוציאניאט עם פנול חייב לכסות לחלוטין את מטריצות הקולגן.
  4. מערבולת הצינורות עבור 10\u201220 s.
  5. המגן את מטריצות עם מחטי 20 G ו 5 מזרקים מ"ל עד שהם מומסים לחלוטין.
  6. תנו למטריות לשבת 5 דקות ב-RT.
  7. להוסיף 200 μL של כלורופורם טהור מטריצות לנער את הצינור במרץ במשך 15 s.
  8. מעבירים מיד את התערובת לצינורות של 1.5 מ"ל.
  9. תן לתערובת לשבת לפחות 5 דקות ב-RT עד שהשלבים מופרדים.
  10. צנטריפוגה צינורות 1.5 מ"ל ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° C.
  11. מלא שפופרת חדשה של 1.5 מ"ל עם 500 μL של 70% אתנול.
    הערה: תלוי בנפח של השלב המים לאחר צנטריפוגה (ראה שלב 9.12. זה לא יכול להיות 500 μL. הכמות של 70% אתנול צריך להיות שווה לנפח של שלב המים.
  12. העבר בזהירות את השלב המים העליון של הדגימות הצנטריפוגיות לצינור מלא אתנול 70% ולערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה למטה.
  13. (שלב קריטי 6) היזהרו לא להפריע לשכבות בתחתית הגואנידיניום תיוציאניאט עם הפרדת פנול תוך הסרת השלב העליון, כמו זה יהיה לזהם את RNA.
  14. הוסף את הדגימה לעמודת חילוץ RNA (כלולה בערכת החילוץ RNA, ראה טבלת חומרים). מכאן מכאן, בצע את פרוטוקול היצרן לטיהור RNA מתאי.

תוצאות

מודל התרבות התת-ת-ית-ית-ית-ית-ית-יתור מאפשר תסה שונה המוצגת באות 1A, שניתן לשלב או לשנותה במידת הצורך. בהגדרה ניסיונית הוקמה שלנו, גידול ותאי T הם שיתוף תרבות במשך 2 ימים ואחריו חניכה של אסא הפלישה לבחירה של תאים סרטניים פולשניים ו / או עמידים(איור 1B). ביום 4 מבוצע...

Discussion

השיטה המוצגת כאן מתארת דור ספרואידי גידול 3D, המאפשר שיתוף תרבות עם תאי T, תאים מבוססי פונקציונליות ומולקולריים, כמו גם מגוון רחב של אפשרויות ניטור וניתוח באמצעות מכשיר יחיד. היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהיא אינה מחייבת העברת תרבות תלת-מימד לתסה נפרדת ושומרת על שלמות תרבות ה-3D לאורך כל ה?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לוירג'יני אורי, PhD על דיונים מועילים וייעוץ על הגישה של מודל 3D שיתוף תרבות. אנו מודים גם לאליזבת ג'ונס על סיוע טכני מצוין עם המחלקה IHC. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מDFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft) כדי YL (LI 2547/4-1) ואת המכונים הלאומיים לבריאות AW (R01 CA23 1291), ל-ATR (R01 CA205632), ל-GWP (R01 CA218670) ולמענק הליבה של המרכז לסרטן (P30 CA51008).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3D Petri DishesMicrotissues IncZ764019 & Z764051referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber SlidesLab-Tek154534
Agarose Type I, low EEOSigma-AldrichA6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibodyAgilentK4003ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mgMillipore08-115
Collagenase Type 4, 1 gWorthingtonLS004188
DMEM, fetal bovine serumThermoFisher11965092, 16000044referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylinThermoFisherSH30-500D
HistoGelThermoFisherHG-4000-012referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
HoechstLife TechnologiesH13991/1000 dilution
Phalloidin 546Invitrogen4866241/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibodyCell Signaling989411/25 dilution
rat anti-keratin 8DSHBTROMA-I AB_5318261/500 dilution
RNeasy Mini KitQiagen74104referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMIThermoFisher11875093for T-cell culture medium
Triton X-100BioRad1610407referred to as "Octoxynol" in the protocols
TrizolThermoFisher15596026referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20Sigma-AldrichP1379referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLEThermoFisher12604013referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  22. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, (2019).
  23. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved