成熟水稻的横向切片（米 苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

摘要

该协议允许制备谷物种子（例如，大米）的横截面，以使用扫描电子显微镜分析胚乳和淀粉颗粒形态。

摘要

淀粉颗粒（SGs）根据植物物种表现出不同的形态，特别是在 Poaceae 家族的胚乳中。胚乳表型可用于使用扫描电子显微镜（SEM）分析基于SG形态型对基因型进行分类。使用SEM可以通过切片内核（果核，aleurone层和胚乳）并暴露器官内容物来可视化SG。目前的方法要求将米粒嵌入塑料树脂中，并使用切片机切片，或嵌入截断的移液器尖端，并使用剃须刀片手工切片。前一种方法需要专门的设备，而且耗时，而后者根据水稻基因型引入了一系列新的问题。特别是白垩米品种，由于其胚乳组织的易碎性，对这种类型的切片构成了问题。这里介绍的是一种用于制备用于显微镜检查的半透明和白垩米仁切片的技术，只需要移液器尖端和手术刀刀片。在移液器吸头的范围内准备切片可防止米粒胚乳破碎（对于半透明或"玻璃体"表型）和破碎（对于白垩表型）。使用这种技术，可以观察到胚乳细胞的图案化和完整SG的结构。

引言

淀粉颗粒（SG）根据植物物种表现出不同的形态，特别是在Poaceae家族^1，2的胚乳中。胚乳表型可用于使用扫描电子显微镜分析基于SG表型对基因型进行分类。SVG可以使用扫描电子显微镜（SEM）通过切片内核并撬走胚乳细胞壁^{来可视化2。}

该技术的目的是轻松制备仅用于快速SEM分析的横向稻仁切片。该技术的发展是由于需要快速横截面方法，即在使用最少的设备进行可视化之前立即为SEM显微镜准备样品。

该技术涉及将去壳的米粒插入移液器尖端以完全固定。这在横截面白垩米仁表型时尤其重要，这些表型易碎，在压力下容易破碎^3。白垩是大米中不受欢迎的质量，因为它会影响内核的外观，并导致内核在抛光和碾磨过程中容易破裂³。白垩度表现为可以用肉眼观察到的内核横截面中的不透明区域;在微观层面上，白垩的特征是小的，松散的淀粉颗粒。白垩的原因可以是遗传^4，5或环境^6，7。

谷物种子横截面传统上是使用化学固定方法制备的，并在样品嵌入石蜡或其他固体基质^{4，8，9，10}之后切片。2010年，松岛法被引入，作为避免复杂和耗时的稻仁样品制备方法⁴。该方法涉及将去壳的米粒插入截断的移液器尖端。尖端由块修剪器固定，并使用手持剃须刀片收获薄的局部胚乳部分。2016年开发的另一项快速技术允许对各种干燥种子进行薄整切片，包括白垩品种¹⁰。这些方法推动了这里介绍的快速技术的发展。

这种新技术适用于希望获得完整的水稻籽粒横向横截面的研究人员，以便使用SEM进行胚乳表型和淀粉形态分析。

该协议代表了松岛截断移液器吸头方法⁴的改编，并进行了一些值得注意的修改:（1）在该技术的任何一点都不吸收内核;（2）既不需要块修剪器，也不需要超微量切片机来准备切片。本研究考察了野生型"半透明"品种（Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare）和日本4的突变"白垩"品系（ssg1，不合格的淀粉粒1）。选择这两个品种进行分析，以展示加工半透明和白垩型水稻切片的技术和视觉差异。

研究方案

1. 横米切片的制备

1. 去壳干燥，完整的内核 如图1A所示。
   1. 松开谷壳，在两个扁平的橡胶塞之间研磨米粒。如有必要，从穗中取出去去壳的米粒。
   2. 将单个内核放在工作台上的扁平橡胶塞上（图1B）。确保此塞子保持静止。
   3. 使用第二个扁平的橡胶塞（图1C）通过用足够的压力将内核拧入第一个橡胶塞来磨损内核（图1D）。从内核中取出外壳，注意不要破坏胚乳。使用精细的镊子去除任何剩余的外壳。去壳的内核如图 1E 所示。
2. 使用细镊子，将单个去壳的内核插入塑料移液器尖端（250μL大小，一个种子/尖端）（图1F）。确保胚核的末端朝向移液器吸头的（锥形）端（图1G）。
   注意:以这种方式插入内核可确保内核尽可能紧密地插入移液器吸头，因为内核在其近端较窄。
3. 插入第二个250μL移液器吸头，以迫使移液器吸头进入移液器吸头，并在切片过程中保持内核不动，注意不要损坏内核或弯曲第二个移液器吸头（图1H）。正确的"望远镜"组合如图 1I所示。
4. 将移液器吸头组件平放在工作台上，并用手固定到位（图1J）。另一方面，使用锋利的手术刀刀片（20号）切开果仁的中心，并将移液器尖端的末端切掉（图1K）。使用手术刀切下1毫米厚的米粒部分（图1L）。
   注:内核部分紧紧封闭在塑料环内（图1M）。三种示例基因型的平均截面厚度见 表1。明显薄于1毫米的切片会破碎或破碎。重要的是要注意，如果对几个品种的水稻进行比较，则每个部分起源于内核的哪个部分进行比较，因为淀粉形态在整个胚乳¹¹中确实有所不同。

2. 横米切片的反射光显微镜

1. 使用细镊子将横向米片（在第1节中制备）放在一张黑色的重型黑色纸上。
2. 使用带有安装的鹅颈管的立体显微镜获得Nipponbare横向部分的光图像，如图 1N-S所示。
3. 在至少10倍放大镜下观察胚乳形态。
   注意:任何光源都比明场显微镜更可取，因为使用这种技术获得的切片不够薄，无法使光线通过。

3. 横向米切片扫描电子显微镜

1. 将样品放在粘在铝短截线上的碳盘上，然后放在减少电荷的样品架上。使用精细镊子从移液器吸头安装座上取下塑料环，以防止塑料进入SEM的真空装置。
   注:胚乳细胞、SG和亚颗粒的图像是使用不需要溅射包被样品的台式SEM机获得的。
2. 使用高灵敏度多模反向散射电子（BSE）探测器在10 kV下获取图像。

结果

野生型日本（图2A）和 ssg1 部分（图2B）在三种放大倍率下进行了检查:260x，920x和4200x。该技术允许制备足够质量的切片以观察整个胚乳细胞（图3A），复合淀粉颗粒（图3B）和单个亚颗粒（图3C）。去壳的果仁比抛光的核需要更长的时间来处理，因为在切片之前需要通过磨损去除干燥的壳。白垩核的加工时间也比抛光的半透明内核更长，因为在切片过程中必须注意不要破坏内核。适当制备的稻块应约0.9毫米厚（表1），胚乳（图1N）和完整的果皮和芦荟层（图1O）的破碎最小或没有破碎。切片时手术刀在移液器吸头上放置不当会导致"碎裂"切片（图1P）。类似地 ，ssg1 最佳横向截面的明场图像（图1Q）显示完整的胚乳，果层和aleurone层完好无损，可用于可视化（图1R）。如果唯一的目的是观察SG，则破碎的白垩核部分（图1S）可能仍可用于可视化，但胚乳细胞模式将不可见。损坏的部分可能难以处理以进行分析。在野生型日本人中观察到更多的胚乳细胞壁剪切，因为细胞比 ssg1 内核更紧密地包装并且更不易碎。在 ssg1 切片中没有观察到胚乳细胞的剪切，并且复合淀粉颗粒完好无损。

图S1显示了使用"望远镜"技术切片稻仁的结果的可靠性。水稻品系被确定为半透明籽粒生产者 - 野生型抗性淀粉（RS）杂交品系Xieyou 7954（稻苜蓿）12，13，14（图S1A）和钴生成的突变体RS111^13，15（图S1B）产生使用立体显微镜可见光的部分。相应的SEM图像显示，这些品系产生"正常"的水稻胚乳表型:紧密包装的多面体淀粉颗粒。白垩籽粒生产者，商业品种Yi-Tang^16（图S1C）和RS4^{13，RS11115（}图S1D）的突变体，表现出白色，不透明的内核部分。与野生型半透明RS背景线相比，相应的SEM图像显示出明显不同的形态:淀粉颗粒是圆形的，松散包装。野生型秀水11（米苜蓿）（图S1E）及其突变体KMD1（Kemingdao1），表达Cry1Ab基因以抑制昆虫捕食17，18，19（图S1F）表现出与半透明RS系相似的切片和胚乳形态。

这里介绍的技术是制备用于表型分析的白垩型水稻粒样品的最佳选择，但也为切片半透明稻仁表型^{提供了优势20:}使用来自上面的压力切割样品可降低胚乳破碎和脱位的风险。样品可以在几秒钟内轻松制备（表2）。使用该技术分析了多种基因型以测试其功效（表3）。如图 S2所示，这种技术可以应用于其他物种的种子。模型单子叶 植物Brachypodium distachyon 产生非常坚硬的种子，仅含有B颗粒淀粉^21，其缺乏嘌呤吲哚啉A，这是一种赋予淀粉颗粒²²柔软性的蛋白质。仍然有可能获得完整的横向截面（图S2A）。从软白冬小麦（SWWW）获得完整的横向截面具有挑战性，但可以进行（图S2B）。SWWW种子在嘌呤吲哚啉A中含量高，与 B. distachyon 种子和水稻籽粒相比较大。这些种子在使用望远镜组合切片时经常碎裂。

基因型	使用望远镜组合的平均截面宽度（μm）	平均截面宽度 （μm） 徒手剖面
日本（去壳）	971.7 ± 152.4阿布	1059.571 ± 394.2ab
协佑 7954	825.1 ± 128.3b	1306.187 ± 179.1a
RS4	910.6 ± 165.0ab	1126.694 ± 395.3ab
使用方差分析 （ANOVA） 和 Tukey 检验 （n = 10） 的单向分析 ，P < 0.01 时，相同字母后跟的均值没有显著差异。使用JMP 15软件进行统计分析。

表 1:平均内核截面厚度。

基因型	平均时间*
日本（去壳）	14.7 ± 1.36a
协佑 7954	9.81 ± 0.98b
RS4	11.9 ± 1.28c
*使用望远镜组合。
使用方差分析 （ANOVA） 和 Tukey 检验 （n = 10） 的单向分析 ，P < 0.01 时，相同字母后跟的均值没有显著差异。使用JMP 15软件进行统计分析。

表2:平均样品制备时间。

基因型	背景	质量
日本	野生型	半透明
不合格的淀粉粒1 （ssg1）	日本	白垩
抗性淀粉（RS） 解优 7954	野生型	半透明
RS111系列	协佑 7954	半透明
RS4	RS111系列	白垩
益堂，"新生活"，鲁久伦品牌	协佑 7954	白垩
秀水 11	野生型	半透明
科明岛1 （KMD1）	秀水 11	半透明

表3: 本研究中检查的水稻基因型。

图1:横向水稻切片的制备。（A） 野生型日本核，壳完整。（B）。将内核放在直径为四英寸的扁平橡胶塞上。（C） 通过在两个橡胶塞之间研磨内核来去除外壳。（D） 谷壳已从稻仁中分离出来。（E） 去壳米粒特写。胚胎末端是指示的。（F） 使用细镊子将果仁插入移液器吸头。（G）将果核固定在移液器吸头的远端。（H） 插入第二个移液器吸头以固定内核以进行切片（"望远镜"组合）。（I）将米粒紧贴在移液器吸头的远端。（J） 在组合内切片米粒。（K） 截面切口的特写。（L）由塑料环包围的内核的一部分。（M） 横截面的特写。（N） 野生型日本的横截面。（O） 野生型日本剖面内胚乳的特写。（P） 野生型日本核的较差、次优部分。（Q） 日本突变体 ssg1⁴的横截面。（R） ssg1 部分内胚乳的特写。（S） ssg1的较差、次优部分。棒材（面板 A ，N-S） = 1 mm。使用带有数码变焦相机和鹅颈灯的立体显微镜对全米粒和切片进行成像。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2:横向内核部分的扫描电镜图像。（A） 野生型日本，半透明品种。复合淀粉颗粒彼此紧密粘合;（B） 日本突变体 ssg1^4，白垩表型。复合淀粉颗粒包装松散，缺乏野生型日本淀粉形态型的胶凝性。从左到右放大倍率:260x、920x 和 4200x。条形长度在面板中指示。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3:秀水11横向核部分的扫描电镜显微解剖。（A）单个胚乳细胞以红色勾勒轮廓。260倍放大倍率。（B）复合淀粉颗粒以红色勾勒。920倍放大倍率。（C） 多个淀粉亚颗粒以红色勾勒。2250倍放大倍率。条形长度在面板中指示。请点击此处查看此图的放大版本。

图S1:使用该技术制备用于SEM的其他水稻基因型的横截面。（A） 抗性淀粉 （RS） 谢友 7954¹².（B）RS111，高RS透明突变体7954^13。（C）RS4，RS111¹⁵的白垩突变体。（D）益唐，高直链淀粉水稻的一种商业品种¹⁶种。（E） 秀水 11.（F） KMD1 （Kemingdao1）^17，18，19.10 倍放大倍率，用于明场图像。白条 = 1 mm.2250x放大倍率，用于扫描电镜图像。条形长度在面板中指示。请点击此处下载此图。

图 S2:技术对其他种子很有用。 （A） 假紫凤梨（短尾紫凤仙 L. 加入 Bd21） 种子的横截面。（B）软白冬小麦（小麦 ）种子的横截面。明场，20倍放大倍率。条形 = 1 毫米。 请单击此处下载此图。

讨论

这里介绍的技术代表了一种快速，简单和敏锐的方法，用于准备横向水稻横截面以进行桌面SEM可视化。这种切片技术可以快速观察胚乳结构，胚乳细胞形状，大小和模式，复合颗粒和淀粉形态。为了进行胚乳表型和种质筛选，获得水稻籽粒^4、23、24的整个横截面至关重要。将果核完全插入移液器吸头内至关重要，以防止手术刀刀片的压力迫使胚乳破碎或破碎。如果"望远镜"组合结构正确，样品可以在15秒内准备好进行可视化（表2），使用典型实验室环境中已经掌握的材料。该技术适用于任何椭球体种子在其最宽处直径约四毫米的横截面。模型草短荞（图S2A）的种子可以类似地被分割，但不会保持在环空内。较大的种子，如小麦，容易断裂，在切片时需要小心（图S2B）。

但是，此处介绍的技术存在一些限制。使用该技术获得的切片不够薄，无法使光线通过，这禁止将该技术用于基于透射光的显微方法，如明场（米粒切片²⁵的最大样品厚度为500μm）和透射电子显微镜（TEM）（500nm最大样品厚度²⁶).使用移液器吸头作为切片"基质"也限制了可以使用这种技术切片的种子的大小。需要进一步的故障排除，以使该技术适用于与水稻高度不同的物种，并且"基质"的大小受到可供购买的移液器吸头尺寸的限制。

该技术提供的另一个明显优势是可以从白垩表型米粒中生产的样品的质量。值得注意的是，即使是松岛的研究也承认，使用这种特定方法很难获得白垩表型⁴的横截面，正如本研究中为了进行比较而复制的那样（图1S）。在他们的情况下，有必要化学固定他们的白垩米样品并将其嵌入树脂中进行切片。这项新技术与桌面SEM成像相结合，使研究人员能够轻松制备用于显微镜检查的米粒的横向切片，并且比没有固定支持时具有更高的一致性（表3）。

在表型组学和代谢组学的新时代，监测诱变系和转座子标记的文库以更好地了解种子中淀粉的功能和重要性非常重要。此外，国际水稻基因库拥有超过13万个水稻种质²⁷.像这里介绍的那样的快速种子表型技术将加快营养质量的分类和采样²⁸。最后，鉴于气候变化的影响日益严重，这种技术可能是有用的。谷物灌浆过程中的季节性高温胁迫已被确定为白垩^{度的主要原因6，}但最近的研究显示，全球气温上升与水稻产量白垩度增加有关^7，29。这种加速的胚乳表型可能有助于为全球气温上升的影响提供广泛的农业形象。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP 15	SAS	N/A	N/A
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100)	Agar Scientific	AGG3347N	N/A
Phenom Pro Desktop SEM	Thermo Scientific	PHENOM-PRO	N/A
Pipette Tips RC UNV 250 µL	Rainin	17001116	N/A
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium	Micro to Nano	10-002012-50	N/A
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm	Thermo Scientific	3120019	N/A
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm	Thermo Scientific	28618256	N/A
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle	Thermo Scientific	5334	N/A
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope	Zeiss	N/A	N/A