Method Article
פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.
גרגירי עמילן (SGs) מציגים מורפולוגיות שונות בהתאם למין הצמח, במיוחד באנוספרם של משפחת Poaceae. פנוטיפינג אנדוספרם יכול לשמש לסיווג גנוטיפים המבוססים על מורפוטיפ SG באמצעות סריקת ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים (SEM). ניתן לדמיין SGs באמצעות SEM על ידי חיתוך דרך הליבה (pericarp, שכבות אלורון ואנוספרם) וחשיפת התוכן האורגני. השיטות הנוכחיות דורשות את ליבת האורז להיות מוטבעת בשרף פלסטיק ומדורקת באמצעות מיקרוטום או מוטבעת בקצה פיפטה קטועה ומקטעת ביד באמצעות סכין גילוח. השיטה הקודמת דורשת ציוד מיוחד והיא גוזלת זמן רב, בעוד האחרונה מציגה שורה חדשה של בעיות בהתאם לגנוטיפ אורז. זני אורז גיר, במיוחד, מהווים בעיה עבור סוג זה של חתך בשל האופי הפריך של רקמת האנוספרם שלהם. מוצג כאן טכניקה להכנת קטעי גרעיני אורז שקופים וגיריים למיקרוסקופיה, הדורשת רק טיפים פיפטה ולהב אזמל. הכנת החלקים בתוך גבולות טיפ פיפטה מונעת מאנדופרם גרעיני אורז להתנפץ (עבור פנוטיפים שקופים או 'זגועים') ולהתפורר (עבור פנוטיפים גיר). באמצעות טכניקה זו, דפוס תא אנדוספרם ואת המבנה של SGs שלם ניתן לראות.
גרגירי עמילן (SGs) מציגים מורפולוגיות שונות בהתאם למין הצמחים, במיוחד באנוספרם של משפחת פואצ'אי 1,2. פנוטיפינג אנדוספרם יכול לשמש לסווג גנוטיפים המבוססים על פנוטיפ SG באמצעות סריקת ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים. ניתן לדמיין SGs באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) על ידי חיתוך הקרנל וחטטנות קירות תא אנדוספרם2.
מטרת טכניקה זו היא להכין בקלות מקטעי גרעיני אורז רוחביים אך ורק לניתוח SEM המהיר. הפיתוח של טכניקה זו הונע על ידי הצורך בגישה מהירה של חתך מהיר לפיה דגימות מוכנות למיקרוסקופיית SEM מיד לפני הדמיה באמצעות ציוד מינימלי.
טכניקה זו כוללת החדרת גרעין האורז הקלוף לתוך קצה הפיפטה לשתק מוחלט. זה חשוב במיוחד בעת חתך פנוטיפים גרעיני אורז גיר, אשר פריך בקלות להתפורר תחת לחץ3. גיר הוא איכות לא רצויה באורז שכן היא משפיעה על המראה של הקרנל וגורמת לליבה להישבר בקלות במהלך ליטוש וכרסום3. גיר מציג כאזור אטום בחתך של הקרנל שניתן לראות בעין בלתי מזוינת; ברמה המיקרוסקופית, הגיר מאופיין בגרגרי עמילן קטנים ארוזים באופן רופף. גורמים לגיר יכול להיות גנטי4,5 או סביבתי6,7.
חתך זרעי דגנים הוכנו באופן מסורתי בשיטות תיקון כימיות וחתך בעקבות דגימה הטמעה שעוות פרפין או מטריצה מוצקה אחרת4,8,9,10. בשנת 2010, שיטת Matsushima הוצגה כדרך להימנע מהכנת מדגם גרעיני אורז מסובך וגוזל זמן4. שיטה זו כללה החדרת גרעין האורז הקלוף לקצה פיפטה קטוע. הקצה מוחזק נייח על ידי גוזם בלוקים, וחלקים דקים וחלקיים של אנדופרם נקצרים באמצעות סכין גילוח ידני. טכניקה מהירה נוספת שפותחה בשנת 2016 אפשרה חתך שלם דק של מגוון רחב של זרעים יבשים, כולל זניםגיר 10. שיטות אלה הניעה את התפתחות הטכניקה המהירה המוצגת כאן.
טכניקה חדשה זו מתאימה לחוקרים שרוצים להשיג חתך רוחבי שלם של גרעיני אורז עבור פנוטיפינג אנדוספרם וניתוח מורפולוגיה עמילן באמצעות SEM.
פרוטוקול זה מייצג התאמה של שיטת קצה פיפטה חתוכה Matsushima4, עם כמה שינויים בולטים: (1) גרעינים אינם imbibed בכל שלב של הטכניקה; (2) לא גוזם בלוק ולא ultramicrotome נדרשים להכין את המקטעים. סוג פראי 'שקוף' cultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) וקו 'גיר' מוטגני של Nipponbare (ssg1, גרגר עמילן לא תקני1)4 נבדקו במחקר זה. שני הכתות האלה נבחרו לניתוח כאן כדי להדגים את ההבדלים הטכניים והוויזואליים בעיבוד מקטעי אורז שקופים וגיריים.
1. הכנת קטע אורז רוחבי
2. מיקרוסקופיה אור משתקף של מקטעי אורז רוחביים
3. סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של מקטעי אורז רוחביים
חלקים מסוג פראי Nipponbare (איור 2A) ו- ssg1 (איור 2B) נבדקו תחת שלוש הגדלות: 260x, 920x ו- 4200x. טכניקה זו מאפשרת הכנת חלקים באיכות מספקת כדי להתבונן בתא האנוספרם כולו (איור 3A),גרגירי עמילן מורכבים (איור 3B)ותת-granules בודדים (איור 3C). גרעיני קליפה לוקח יותר זמן לעבד מאשר גרעינים מלוטשים כמו קליפות יבשות צריך להיות מוסר על ידי שחיקה לפני החתך. גרעיני גיר גם לקחת יותר זמן לעבד מאשר גרעינים שקופים מלוטשים, כמו יש לנקוט בזהירות לא לנפץ את הקרנל במהלך חתך. קטע אורז מוכן כראוי צריך להיות בעובי של כ-0.9 מ"מ(טבלה 1)עם מינימום עד ללא ניפוץ של האנדוספרם(איור 1N)ושכבות פריקארפ ואלורון שלמות(איור 1O). מיקום לא תקין של האזמל על קצה הפיפטה כאשר החתך יכול להוביל לחלקים 'סדוקים'(איור 1P). באופן דומה, תמונות שדה בהירות של מקטעים רוחביים אופטימליים של ssg1 (איור 1Q) הדגימו שכבות אנדוספרם, פריקרפ ואלורון שלמות וזמינות להדמיה (איור 1R). מקטע ליבה גירית שבור (איור 1S) עדיין עשוי להיות שמיש להדמיה אם המטרה היחידה היא לצפות ב- SGs, אך תבנית תא אנדוספרם לא תהיה גלויה. ייתכן שיהיה קשה לטפל בסעיף מנותק לצורך ניתוח. יותר גיזה של קירות תא אנדוספרם נצפתה בסוג פראי Nipponbare, כמו התאים ארוזים יותר חזק פחות פריך מאשר גרעיני ssg1. לא נצפתה גיזת תאי אנדוספרמה בחלקי ssg1 וגרגרי עמילן מורכבים ללא פגע.
איור S1 מדגים את אמינות התוצאות בטכניקת 'הטלסקופ' לקטע גרעיני אורז. קווי אורז שזוהו כמפיקי ליבה שקופים – סוג פראי עמילן עמיד (RS) קו היברידי Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 ( איורS1A) ומוטנט שנוצר קובלט RS11113,15 ( איורS1B) יצרו קטעים שדרכם האור נראה באמצעות סטריאומיקוסקופ. תמונות SEM המתאימות חשפו כי קווים אלה מייצרים את פנוטיפ אנדוספרם האורז 'הרגיל': גרגירי עמילן רב-התדרלי ארוזים היטב. יצרני גרעין גיר, מגוון מסחרי Yi-Tang16 (איור S1C)ו RS413,מוטציה של RS11115 (איור S1D),הציגו קטעי ליבה לבנים ואטום. תמונות ה- SEM המתאימות הציגו מורפולוגיה שונה במידה ניכרת בהשוואה לקו הרקע של RS שקוף סוג הבר: גרגירי עמילן היו עגולים ונארזו באופן רופף. סוג פראי Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (איור S1E)והמוטציה שלו, KMD1 (Kemingdao1), המבטאים את הגן Cry1Ab לעיכוב טרפת חרקים17,18,19 ( איורS1F) הציגו קטעים ומורפוטיפים אנדוספרם הדומים לקווי ה- RS השקוף.
הטכניקה המוצגת כאן היא אופטימלית להכנת דגימות של גרעיני אורז מסוג גיר לניתוח פנוטיפי, אך גם מספקת יתרונות לפיצוח פנוטיפים של גרעיני אורז שקופים20: חיתוך הדגימות באמצעות לחץ מלמעלה מפחית את הסיכון לניפוץ האנדוספרם ונקע. ניתן להכין דוגמאות בקלות תוך שניות(טבלה 2). גנוטיפים מרובים נותחו באמצעות טכניקה זו כדי לבדוק את יעילותה (טבלה 3). כפי שמוצג באיור S2, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על זרעים של מינים אחרים. דגם מונוקוט Brachypodium distachyon מייצר זרעים קשים מאוד המכילים רק עמילן B-גרגר21, אשר חסר puroindoline A, חלבון המעניק רכות גרגרי עמילן22. עדיין ניתן היה להשיג מקטע רוחבי שלם(איור S2A). קבלת קטע רוחבי שלם מחיטה חורפית לבנה רכה (SWWW) הייתה מאתגרת אך ניתן לבצע אותה(איור S2B). זרעי SWWW עשירים בפורואינדולינה A וגדולים בהשוואה לזרעי B. distachyon וגרעיני אורז. זרעים אלה מתפוררים לעתים קרובות בעת חתך באמצעות הרכב הטלסקופ.
גנוטיפ | רוחב מקטע ממוצע (מיקרומטר) באמצעות הרכבה של טלסקופ | רוחב מקטע ממוצע (מיקרומטר) חתך ביד חופשית |
ניפונברה (קליפה) | 971.7 ± 152.4ab | 1059.571 ± 394.2ab |
שיו 7954 | 825.1 ± 128.3b | 1306.187 ± 179.1a |
RS4 | 910.6 ± 165.0ab | 1126.694 ± 395.3ab |
אמצעים ואחריו אותן אותיות אינם שונים באופן משמעותי ב- P < 0.01 באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ומבחן טוקי (n = 10). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת JMP 15. |
טבלה 1: עובי מקטע ליבה ממוצע.
גנוטיפ | זמן ממוצע (ים)* |
ניפונברה (קליפה) | 14.7 ± 1.36a |
שיו 7954 | 9.81 ± 0.98b |
RS4 | 11.9 ± 1.28c |
*באמצעות הרכב הטלסקופ. | |
אמצעים ואחריו אותן אותיות אינם שונים באופן משמעותי ב- P < 0.01 באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ומבחן טוקי (n = 10). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת JMP 15. |
טבלה 2: זמן הכנה לדוגמה ממוצע.
גנוטיפ | רקע | איכות |
ניפונברה | סוג פראי | שקוף |
גרגר עמילן לא תקני1 (ssg1) | ניפונברה | צ'וקי |
עמילן עמיד (RS) Xieyou 7954 | סוג פראי | שקוף |
RS111 | שיו 7954 | שקוף |
RS4 | RS111 | צ'וקי |
יי-טאנג, 'חיים חדשים', מותג לוג'ורן | שיו 7954 | צ'וקי |
שיושי 11 | סוג פראי | שקוף |
קמינגדאו1 (KMD1) | שיושי 11 | שקוף |
טבלה 3: גנוטיפי אורז שנבדקו במחקר זה.
איור 1: הכנת מקטעי אורז רוחביים. (A)גרעין ניפונברה מסוג פראי עם קליפה שלמה. (B). הקרנל מונח על פקק גומי שטוח בקוטר 4 אינץ '. (ג)קליפות הוסרו על ידי שחיקת הקרנל בין שני פקקי גומי מעוררי תיאבון. (ד)קליפה הופרדו מגרעין האורז. (ה)תקריב של גרעיני אורז קליפה. קצה העובר מצוין. (ו)החדרת ליבה לטיפ פיפטה באמצעות מלקחיים עדינים. (G)הקרנל נתקע בקצה הדיסטלי של קצה הפיפטה. (H)החדרת קצה הפיפטה השני כדי לשתק את הקרנל לחתך (הרכבה 'טלסקופית'). (אני)גרעין האורז הותקן בצורה נוחה בקצה הדיסטלי של קצה הפיפטה. (J)חתך של גרעין האורז בתוך המכלול. (K)תקריב של קטע לחתוך. (L)חלק מהגרעין מוקף אנולוס הפלסטיק. (M)תקריב של החלק הרוחב. (N)קטע רוחבי מסוג פראי ניפונברה. (O)תקריב של האנוספרם בתוך קטע ניפונברה מסוג הפראי. (P)חלק מסכן, תת-אופטימלי של גרעין ניפונברה מסוג פראי. (Q)קטע רוחבי של מוטציה ניפונברה ssg14. (R)תקריב של אנדוספרם בתוך מקטע ssg1. (S)חלק מסכן, תת-אופטימלי של ssg1. בר (לוחות A, N-S) = 1 מ"מ. גרעין אורז מלא וחלקים צולמו באמצעות סטריאומיקוסקופ עם מצלמת זום דיגיטלית ואורות עור ברווז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות SEM של מקטעי ליבה רוחביים. (א)ניפונברה מסוג פראי, כת שקופה. גרגירי העמילן המורכבים התחזקו בחוזקה זה לזה; (B)מוטציה ניפונברה ssg14,פנוטיפ גיר. גרגירי העמילן המורכבים היו ארוזים באופן רופף וחסרים את האופי המצחיני של מורפוטיפ עמילן מסוג בר ניפונברה. הגדלה משמאל לימין: 260x, 920x ו- 4200x. אורך הסרגל מצוין בחלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אנטומיה מיקרוסקופית SEM של מקטע ליבה רוחבי של Xiushui 11. (A)תא אנדוספרם יחיד מסומן באדום. הגדלה פי 260. (B)גרגר עמילן מורכב מתואר באדום. הגדלה פי 920. (C)תת-granules עמילן מרובים מסומנים באדום. הגדלה פי 2250. אורכי פס מסומנים בחלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור S1: קטעים רוחביים של גנוטיפי אורז אחרים שהוכנו עבור SEM בטכניקה זו. (A)עמילן עמיד (RS) Xieyou 795412. (B)RS111, מוטציה שקופה ברמה גבוהה של 795413. (C) RS4, מוטציה גירית של RS11115. (D)יי-טאנג, מגוון מסחרי של אורז עמילוז גבוה16. (ה)שיושי 11. (ו) KMD1 (קמינגדאו1)17,18,19. הגדלה פי 10 לתמונות שדה בהירות. פס לבן = הגדלה של 1 מ"מ. 2250x עבור תמונות SEM. אורכי פס מסומנים בחלוניות. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
איור S2: טכניקה שימושית לזרעים אחרים. (א)קטע רוחבי של ברום סגול כוזב (ברכיפודיום דיסטכיון ל. גישה Bd21) זרע. (ב)קטע רוחבי של חיטה חורפית לבנה רכה (טריטיקום אסטיבום ל. ג. אוגוסטה) זרעים. שדה בהיר, הגדלה פי 20. בר = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזאת.
הטכניקה המוצגת כאן מייצגת גישה מהירה, פשוטה וחדה לקראת הכנת חתך אורז רוחבי להדמיית SEM שולחנית. טכניקת חתך זו מאפשרת תצפית מהירה של מבנה אנדוספרם, צורת תא אנדוספרם, גודל ותבנית, גרגירים מורכבים ומורפולוגיה של עמילן. לצורך סינון פנוטיפינג אנדוספרם ונבטים, חיוני להשיג חתך שלם של גרעין האורז4,23,24. חשוב ביותר להכניס את הקרנל כולו בתוך קצה הפיפטה כדי למנוע את הלחץ של להב האזמל מלאלץ את האנוספרם להתפורר או להתנפץ. בתנאי שהרכבת 'הטלסקופ' בנויה כראוי, ניתן להכין דגימות להדמיה תוך 15 שניות(טבלה 2)תוך שימוש בחומרים שכבר נמצאים ביד בסביבת מעבדה טיפוסית. טכניקה זו חלה על חתך רוחב של כל זרע אליפסואידי כארבעה מילימטרים בקוטר בנקודה הרחבה ביותר שלה. זרעי דגם הדשא Brachypodium distachyon (איור S2A) ניתן לחלק באופן דומה אך אינם נשארים סגורים בתוך אנולוס. זרעים גדולים יותר, כמו חיטה, שבר בקלות ודורשים טיפול בעת חתך(איור S2B).
עם זאת, ישנן מספר מגבלות לטכניקה המוצגת כאן. חלקים שהושגו בטכניקה זו אינם דקים מספיק כדי שהאור יעבור דרכה אוסר על שימוש בטכניקה זו לגישות מיקרוסקופיות מבוססות אור משודר כמו שדה בהיר (עובי מדגם מרבי של 500 מיקרומטר עבור חלקי ליבת אורז25) ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) (500 ננומטר עובי מדגם מרבי26 ). השימוש בקצה פיפטה כ'מטריצה ' של חתך מגביל גם את גודל הזרע שניתן לחלק באמצעות טכניקה זו. פתרון בעיות נוסף יידרש כדי להתאים טכניקה זו עבור מינים שונים מאוד מאורז, ואת הגודל של "מטריצה" מוגבל על ידי גודל טיפים pipette זמין לרכישה.
יתרון מובהק נוסף שטכניקה זו מספקת הוא איכות הדגימות שניתן להפיק מגרעיני אורז פנוטיפ גיר. ראוי לציין כי אפילו מחקר Matsushima הודה כי היה קשה להשיג חתך בשיטה מסוימת זו עבור פנוטיפיםגיר 4, כפי ששוכפל במחקר זה לצורך השוואה (איור 1S). במקרה שלהם, היה צורך לתקן כימית דגימות אורז גיר שלהם ולהטביע אותם שרף לחתך. הטכניקה החדשה, בשילוב עם הדמיית SEM שולחנית, מאפשרת לחוקר להכין בקלות חלקים רוחביים של גרעיני אורז למיקרוסקופיה עם עקביות רבה יותר מאשר ללא תמיכה בלי תנועה (טבלה 3).
בעידן החדש של פנומיקה ומטבולומיה, חשוב לפקח על קווים מוטגניים וספריות מתויגות טרנספוסון כדי להבין טוב יותר את הפונקציה והחשיבות של עמילן בזרעים. בנוסף, ג'נבנק רייס הבינלאומי מחזיק מעל 130,000 גישות אורז27. טכניקת פנוטיפינג זרעים מהירה כמו זו המוצגת כאן תזרז סיווג ודגימה לאיכות תזונתית28. לבסוף, טכניקה זו עשויה להיות שימושית לאור השפעות שינוי האקלים פולש. מתח עונתי בטמפרטורה גבוהה במהלך מילוי תבואה כבר זוהה כגורם העיקרי לגיר6, אבל מחקרים אחרונים סיבכו את עליית הטמפרטורות העולמיות בהגדלת הגיר של תשואות אורז7,29. פנוטיפינג אנדוספרם מזורז כזה עשוי לעזור לספק תמונה חקלאית רחבה של ההשפעה של עליית הטמפרטורות העולמיות.
למחברים אין מה לחשוף.
המחברים אסירי תודה למערכות למחקר (SFR Corp.) על השימוש במכשיר הפנומן ProX Desktop SEM שלהם, כמו גם על הסיוע הטכני המסופק על ידי מריה פילרינוס (מערכות למחקר (SFR) קורפ) ו Chloë van Oostende-Triplet (ביולוגיה של התא ומתקן הליבה לרכישת תמונה, הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת אוטווה). המימון ניתן על ידי קרן החדשנות דלת הפחמן (LCIF) ממשרד הפיתוח הכלכלי של אונטריו, יצירת מקומות עבודה וסחר, וחלבונים קלים קורפ.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved