Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Özet

Bu protokol, taramalı elektron mikroskopisi kullanılarak endosperm ve nişaste granül morfolojisinin analizi için tahıl tohumlarının enine bölümlerinin (örneğin pirinç) hazırlanmasına izin verir.

Özet

Nişasta granülleri (SG'ler), özellikle Poaceae ailesinin endosperminde bitki türlerine bağlı olarak farklı morfolojiler sergiler. Endosperm fenotipleme, taramalı elektron mikroskobik (SEM) analizini kullanarak genotipleri SG morfotipine göre sınıflandırmak için kullanılabilir. SG'ler çekirdekten dilimlenerek (perikarp, aleuron katmanları ve endosperm) ve organeller içeriği açığa açığa alarak SEM kullanılarak görselleştirilebilir. Mevcut yöntemler, pirinç çekirdeğinin plastik reçineye gömülmesini ve bir mikrotom kullanılarak bölümlere ayrıştırılmasını veya kesilmiş bir pipet ucuna gömülmesini ve jilet kullanılarak elle bölümlerek kesilmesini gerektirir. Eski yöntem özel ekipman gerektirir ve zaman alıcıdır, ikincisi ise pirinç genotipine bağlı olarak yeni bir dizi sorun ortaya sunar. Tebeşirli pirinç çeşitleri, özellikle, endosperm dokularının kırılgan doğası nedeniyle bu tür kesitler için bir sorun teşkil ediyor. Burada sunulan, sadece pipet uçları ve neşter bıçağı gerektiren mikroskopi için yarı saydam ve tebeşirli pirinç çekirdeği bölümlerini hazırlamak için bir tekniktir. Pipet ucunun sınırları içindeki bölümlerin hazırlanması, pirinç çekirdeği endosperminin parçalanmasını (yarı saydam veya 'vitreus' fenotipler için) ve parçalanmasını (tebeşirli fenotipler için) önler. Bu teknik kullanılarak endosperm hücre deseni ve sağlam SG'lerin yapısı gözlenebilir.

Giriş

Nişasta granülleri (SG'ler), özellikle Poaceae ailesinin endosperminde bitki türlerine bağlı olarak farklı morfolojiler sergiler^1,2. Endosperm fenotipleme, taramalı elektron mikroskobik analizi kullanılarak SG fenotipine dayalı genotipleri sınıflandırmak için kullanılabilir. SG'ler, çekirdeği dilimleyerek ve endosperm hücre duvarlarını çıkararak taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılarak görselleştirilebilir^2.

Bu tekniğin amacı, enine pirinç çekirdeği bölümlerini sadece hızlı SEM analizi için kolayca hazırlamaktır. Bu tekniğin geliştirilmesi, minimal ekipman kullanılarak görselleştirmeden hemen önce SEM mikroskopisi için numunelerin hazırlandığı hızlı bir kesit yaklaşımının gerekliliği ile motive edildi.

Bu teknik, tamamen hareketsiz hale getirilmesi için kabuklu pirinç çekirdeğinin pipet ucuna yerleştirilmesini içerir. Bu, özellikle, kırılgan ve basınç altında kolayca ufalanan tebeşirli pirinç çekirdeği fenotiplerini kesişirken önemlidir³. Tebeşirleme, çekirdeğin görünümünü etkilediği ve parlatma ve frezeleme sırasında çekirdeğin kolayca kırılmasına neden olduğu için pirinçte istenmeyen bir kalitedir³. Tebeşirlik, çekirdeğin çıplak gözle gözlemlenebilen bir kesitinde opak bir alan olarak ortaya çıkan; mikroskobik düzeyde, tebeşirlik küçük, gevşek paketlenmiş nişasta granülleri ile karakterizedir. Tebeşirliliğin nedenleri genetik^4,5 veya çevresel^6,7olabilir.

Tahıl tohumu kesitleri geleneksel olarak kimyasal sabitleme yöntemleri kullanılarak ve parafin balmumuna veya başka bir katı matris 4 , 8^,9,10'akatı gömmeden sonra bölümleme kullanılarak hazırlanmıştır. 2010 yılında, Matsushima yöntemi karmaşık ve zaman alıcı pirinç çekirdeği numunesi hazırlanmasından kaçınmanın bir yolu olarak tanıtıldı⁴. Bu yöntem, kabuklu pirinç çekirdeğinin kesilmiş bir pipet ucuna yerleştirilmesini içeriyordu. Uç bir blok düzeltici tarafından sabit tutulur ve ince, kısmi endosperm bölümleri elde tutulan bir jilet kullanılarak toplanır. 2016 yılında geliştirilen başka bir hızlı teknik, tebeşirli çeşitler de dahil olmak üzere çok çeşitli kuru tohumların ince bütün kesitine izin verildi¹⁰. Bu yöntemler burada sunulan hızlı tekniğin gelişimini motive etti.

Bu yeni teknik, SEM kullanarak endosperm fenotipleme ve nişasta morfoloji analizi için pirinç çekirdeklerinin bozulmamış enine kesitlerini elde etmek isteyen araştırmacılar için uygundur.

Bu protokol, Matsushima kesilmiş pipet ucu yöntemi⁴'ün birkaç önemli değişiklikle bir uyarlamasını temsil eder: (1) çekirdekler tekniğin herhangi bir noktasında imbibed değildir; (2) bölümleri hazırlamak için ne bir blok düzeltici ne de bir ultramikrotom gereklidir. Bu çalışmada vahşi bir 'yarı saydam' kültivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) ve nipponbare mutajize edilmiş 'tebeşirli' bir çizgi (ssg1, standart altı nişasta tanesi1)⁴ incelenmiştir. Bu iki kültivar, yarı saydam ve tebeşir tipi pirinç bölümlerinin işlenmesindeki teknik ve görsel farklılıkları göstermek için buradaki analiz için seçildi.

Protokol

1. Enine pirinç bölümünün hazırlanması

1. Şekil 1A'dagösterildiği gibi kabuksuz kuru, bozulmamış çekirdekler.
   1. Çekirdekleri iki düz kauçuk durdurucu arasında öğüterek kabukları ve dehull pirinç çekirdeklerini gevşetin. Gerekirse kabuklu pirinç çekirdeklerini panikleden çıkarın.
   2. Bir çalışma tezgahındaki düz kauçuk stoperin üzerine tek bir çekirdek yerleştirin(Şekil 1B). Bu durdurucu sabit kaldığından emin olun.
   3. Çekirdeği ilk lastik durdurucuya doğru bükerek aşındırmak için yeterli basınç kullanarak ikinci bir düz kauçuk durdurucu ( Şekil1C) kullanın (Şekil 1D). Endosperm'i parçalamamaya dikkat ederek çekirdekteki kabukları çıkarın. İnce tokmaklar kullanarak kalan kabukları çıkarın. Kabuksuz bir çekirdek Şekil 1E'de gösterilmiştir.
2. İnce tokalar kullanarak, plastik bir pipet ucuna (250 μL boyut, bir tohum / uç) tek bir kabuklu çekirdek yerleştirin (Şekil 1F). Çekirdeğin embriyo ucunun pipet ucunun (Konik) ucuna doğru dönük olduğundan emin olun (Şekil 1G).
   NOT: Çekirdeğin bu şekilde takılması, çekirdek proksimal ucuna doğru daha dar olduğu için çekirdeğin pipet ucuna mümkün olduğunca sıkı oturmasını sağlar.
3. Çekirdeği pipet ucuna zorlamak ve bölümleme sırasında çekirdeği hareketsiz tutmak için ikinci bir 250 μL pipet ucu yerleştirin, çekirdeğe zarar vermemeye veya ikinci pipet ucunu bükmemeye dikkat edin (Şekil 1H). Uygun 'teleskop' montajı Şekil 1I'debelirtilmiştir.
4. Pipet ucu montajını bir çalışma tezgahına düz bir şekilde yerleştirin ve elle yerinde tutun (Şekil 1J). Öte yandan, çekirdeğin merkezini dilimlemek ve pipet ucunun ucunu kesmek için keskin bir neşter bıçağı (No. 20) kullanın (Şekil 1K). Neşteri kullanarak pirinç çekirdeğinin 1 mm kalınlığında bölümlerini kesin (Şekil 1L).
   NOT: Çekirdek bölümü bir plastik annulus içinde sıkıca kapatılmış (Şekil 1M). Üç örnek genotip için ortalama kesit kalınlığı Tablo 1'debulunur. 1 mm'den önemli ölçüde daha ince bölümler parçalanır veya parçalanır. Nişasta morfolojisi endosperm boyunca değiştiğinden, bu deney karşılaştırma için çeşitli pirinç çeşitleri üzerinde yapılıyorsa, her bölümün çekirdeğin hangi bölümünden kaynaklandığını not etmek^önemlidir.

2. Enine pirinç bölümlerinin yansıyan ışık mikroskopisi

1. Enine pirinç bölümlerini (bölüm 1'de hazırlanmış) siyah bir ağır gösterge siyah kağıda yerleştirmek için ince tokmaklar kullanın.
2. Şekil 1N-S'degösterildiği gibi, eğik aydınlatma için monte kaz tüyü ile bir stereomikroskop kullanarak Nipponbare'nin enine bölümlerinin ışık görüntülerini elde edin.
3. En az 10 kat büyütme altında endosperm morfolojisi gözlemleyin.
   NOT: Bu teknik kullanılarak elde edilen bölümler ışığın geçeceği kadar ince olmadığı için parlak alan mikroskopisine herhangi bir epilight kaynağı tercih edilir.

3. Enine pirinç bölümlerinin elektron mikroskopisinin taranır

1. Numuneleri alüminyum saplama yapışmış bir karbon diske yerleştirin ve şarj azaltma numune tutucusuna yerleştirin. Plastiğin SEM'in vakum aparatına girmesini önlemek için ince önklekler kullanarak plastik halkayı pipet ucu montajından çıkarın.
   NOT: Endosperm hücrelerinin, SG'lerin ve altgranules'in görüntüleri, numunelerin sputter kaplamalı olmasını gerektirmeyen bir masaüstü SEM makinesi kullanılarak elde edilir.
2. Görüntüleri 10 kV'da yüksek hassasiyetli çok modlu arka katman elektron (BSE) dedektörü kullanarak elde edin.

Sonuçlar

Yabani tip Nipponbare (Şekil 2A) ve ssg1 bölümleri (Şekil 2B) üç büyütme altında incelenmiştir: 260x, 920x ve 4200x. Bu teknik, tüm endosperm hücresini gözlemlemek için yeterli kalitede bölümlerin hazırlanmasını sağlar (Şekil 3A), bileşik nişaste granülleri (Şekil 3B) ve bireysel altgranüller (Şekil 3C). Kabuklu çekirdeklerin işlenmesi cilalı çekirdeklerden daha uzun sürer, çünkü kuru gövdelerin bölümlemeden önce aşınma ile çıkarılması gerekir. Tebeşirli çekirdeklerin işlenmesi de cilalı yarı saydam çekirdeklerden daha uzun sürer, çünkü bölümleme sırasında çekirdeğin parçalanmaması için dikkatli olunmalıdır. Düzgün hazırlanmış bir pirinç bölümü yaklaşık 0,9 mm kalınlığında olmalıdır (Tablo 1) endosperm(Şekil 1N)ve bozulmamış perikarp ve aleuron katmanlarının(Şekil 1O)en az veya hiç parçalanmaması ile. Kesitleme sırasında neşterin pipet ucuna yanlış yerleştirilmesi 'yontulmuş' bölümlere yol açabilir (Şekil 1P). Benzer şekilde, ssg1'in en uygun enine bölümlerinin parlak alan görüntüleri (Şekil 1Q) bozulmamış endosperm, perikarp ve aleuron katmanlarını bozulmamış ve görselleştirme için kullanılabilir göstermiştir (Şekil 1R). Kırık tebeşirli çekirdek bölümü (Şekil 1S) tek amaç SG'leri gözlemlemekse görselleştirme için hala kullanılabilir, ancak endosperm hücre deseni görünmez. Kırık bir bölümü analiz için işlemek zor olabilir. Endosperm hücre duvarlarında daha fazla kesme vahşi tip Nipponbare gözlendi, çünkü hücreler ssg1 çekirdeklerinden daha sıkı paketlenmiş ve daha az kırılgan. Ssg1 bölümlerinde endosperm hücrelerinde yamulma gözlenmedi ve bileşik nişasta granülleri sağlam.

Şekil S1, pirinç çekirdeklerini bölümlerek 'teleskop' tekniğini kullanarak sonuçların güvenilirliğini gösterir. Yarı saydam çekirdek üreticileri olarak tanımlanan pirinç hatları - vahşi tip Dirençli Nişasta (RS) hibrid hattı Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)^12,13,14 (Şekil S1A) ve kobalt tarafından üretilen mutant RS111^13,15 ( ŞekilS1B) stereomikroskop kullanılarak ışığın görülebildiği bölümler üretti. İlgili SEM görüntüleri, bu çizgilerin 'normal' pirinç endosperm fenotipini ürettiğini ortaya koydu: sıkıca paketlenmiş, polihedral nişasta granülleri. Tebeşirli çekirdek üreticileri, ticari çeşitlilik Yi-Tang¹⁶ (Şekil S1C) ve RS4¹³, RS111¹⁵ 'in bir mutantını (Şekil S1D), beyaz, opak çekirdek bölümleri sergilediler. İlgili SEM görüntüleri, vahşi tip yarı saydam RS arka plan çizgisine kıyasla belirgin şekilde farklı morfoloji gösterdi: nişasta granülleri yuvarlak ve gevşek bir şekilde paketlenmişti. Vahşi tip Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Şekil S1E) ve böcek predasyonunu inhibe etmek için Cry1Ab genini ifadeeden kmd1 (Kemingdao1) yarı saydam RS hatlarına benzer bölümler ve endosperm morfotipleri sergiledi.

Burada sunulan teknik, fenotipik analiz için tebeşir tipi pirinç çekirdeklerinin örneklerini hazırlamak için en uygunudur, ancak yarı saydam pirinç çekirdeği fenotiplerini bölümlere ayırmada da avantajlar sağlar²⁰: örnekleri yukarıdan basınç kullanarak dilimleme, endosperm ve çıkık riskini azaltır. Örnekler saniyeler içinde kolayca hazırlanabilir (Tablo 2). Etkinliğini test etmek için bu teknik kullanılarak birden fazla genotip analiz edilmiştir (Tablo 3). Şekil S2'degösterildiği gibi, bu teknik diğer türlerin tohumlarına uygulanabilir. Model monokot Brachypodium distachyon sadece B granül nişastası içeren çok sert tohumlar üretir²¹, puroindoline A eksikliği, nişasta granüllerine yumuşaklık sağlayan bir protein²². Sağlam bir enine bölüm elde etmek hala mümkündü (Şekil S2A). Yumuşak beyaz kış buğdayından (SWWW) sağlam bir enine bölüm elde etmek zordu, ancak yapılabilir (Şekil S2B). SWWW tohumları Pürindolin A'da yüksektir ve B. distachyon tohumları ve pirinç çekirdekleri ile karşılaştırıldığında büyüktür. Bu tohumlar teleskop montajını kullanarak bölümleme yaparken sık sık ufalanır.

Genotip	Teleskop montajı kullanılarak ortalama kesit genişliği (μm)	Ortalama kesit genişliği (μm) kesit serbest
Nipponbare (kabuklu)	971,7 ± 152,4ab	1059.571 ± 394,2ab
Xieyou 7954	825.1 ± 128.3b	1306.187 ± 179,1a
RS4	910,6 ± 165,0ab	1126.694 ± 395,3ab
P < 0.01'de varyans (ANOVA) ve Tukey'in testinin (n = 10) tek yönlü analizi kullanılarak aynı harflerin izlediği araçlar önemli ölçüde farklı değildir. İstatistiksel analizler JMP 15 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Tablo 1: Ortalama çekirdek kesit kalınlığı.

Genotip	Ortalama süre (ler)*
Nipponbare (kabuklu)	14.7 ± 1.36a
Xieyou 7954	9,81 ± 0,98b
RS4	11,9 ± 1,28c
*Teleskop montajını kullanarak.
P < 0.01'de varyans (ANOVA) ve Tukey'in testinin (n = 10) tek yönlü analizi kullanılarak aynı harflerin izlediği araçlar önemli ölçüde farklı değildir. İstatistiksel analizler JMP 15 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Tablo 2: Ortalama numune hazırlama süresi.

Genotip	Arka plan	Nitelik
Nipponbare	Vahşi tür	Saydam
Standart altı nişast tanesi1 (ssg1)	Nipponbare	Kireçli
Dayanıklı Nişast (RS) Xieyou 7954	Vahşi tür	Saydam
RS111	Xieyou 7954	Saydam
RS4	RS111	Kireçli
Yi-Tang, 'Yeni Hayat', Lujuren markası	Xieyou 7954	Kireçli
Xiushui 11	Vahşi tür	Saydam
Kemingdao1 (KMD1)	Xiushui 11	Saydam

Tablo 3: Bu çalışmada incelenen pirinç genotipleri.

Şekil 1: Enine pirinç bölümlerinin hazırlanması. (A) Sağlam kabuklu vahşi tip Nipponbare çekirdeği. (B). Düz dört inç çapında kauçuk durdurucu üzerine yerleştirilmiş çekirdek. (C) İki apposing kauçuk durdurucu arasında çekirdek öğütülerek kabukları çıkarıldı. (D) Kabuğu pirinç çekirdeğinden ayrılmıştır. (E) Kabuklu pirinç çekirdeğinin yakın çekimi. Embriyo ucu belirtilmiştir. (F) Çekirdeğin ince ön ayaklar kullanılarak pipet ucuna yerleştirilmesi. (G) Çekirdek pipet ucunun distal ucuna saplandı. (H) Kesitleme için çekirdeği hareketsiz hale getirmek için ikinci pipet ucunun yerleştirilmesi ('teleskop' montajı). (I) Pirinç çekirdeği pipet ucunun distal ucuna sıkıca monte edildi. (J) Pirinç çekirdeğinin montaj içinde bölümlenerek. (K) Kesit kesiminin yakın çekimi. (L) Çekirdeğin plastik annulus ile çevrelenmiş bir bölümü. (M) Enine bölümün yakın çekimi. (N) Nipponbare vahşi tipte enine bölüm. (O) Vahşi tip Nipponbare bölümünde endosperm yakın çekim. (P) Vahşi tip Nipponbare çekirdeğinin zayıf, yetersiz bölümü. (S) Nipponbare mutant ssg1^4'ünenine bölümü . (R) SSG1 bölümündeki endosperm yakın çekim. (S) Ssg1'inzayıf, yetersiz bölümü . Çubuk (paneller A, N-S) = 1 mm. Tüm pirinç çekirdeği ve bölümleri, dijital zum kamerası ve bektaşi ışıkları ile stereomikroskop kullanılarak görüntülendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Enine çekirdek bölümlerinin SEM görüntüleri. (A) Vahşi tip Nipponbare, yarı saydam bir kültivar. Bileşik nişaste granülleri birbirine sıkıca çimentolandı; (B) Nipponbare mutant ssg1⁴, tebeşirli bir fenotip. Bileşik nişasta granülleri gevşek bir şekilde paketlenmiştir ve vahşi tip Nipponbare nişasta morfotipinin çimentolu doğasından yoksundu. Soldan sağa büyütme: 260x, 920x ve 4200x. Çubuk uzunluğu panellerde belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Xiushui 11'in enine çekirdek bölümünün SEM mikroskobik anatomisi. (A) Tek bir endosperm hücresi kırmızı ile özetlenmiştir. 260x büyütme. (B) Bileşik nişasta granül kırmızı ile özetlenmiştir. 920x büyütme. (C) Birden fazla nişasta altgranules kırmızı ile özetlenmiştir. 2250x büyütme. Çubuk uzunlukları panellerde belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil S1: Bu teknik kullanılarak SEM için hazırlanan diğer pirinç genotiplerinin enine bölümleri. (A) Dayanıklı Nişaste (RS) Xieyou 7954¹². (B) RS111, 7954^13'lükyüksek RS şeffaf mutant . (C) RS4, RS111¹⁵tebeşirli mutant. (D) Yi-Tang, ticari bir yüksek amiloz pirinç çeşidi¹⁶. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)^17,18,19. Parlak alan görüntüleri için 10x büyütme. Beyaz çubuk = SEM görüntüler için 1 mm. 2250x büyütme. Çubuk uzunlukları panellerde belirtilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S2: Teknik diğer tohumlar için yararlıdır. (A) Sahte mor bromun enine bölümü (Brachypodium distachyon L. katılım Bd21) tohumu. (B) Yumuşak beyaz kış buğdayının enine bölümü (Triticum aestivum L. cv. Augusta) tohumu. Parlak alan, 20 kat büyütme. Bar = 1 mm. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Burada sunulan teknik, masaüstü SEM görselleştirmesi için enine pirinç kesitleri hazırlamaya yönelik hızlı, basit ve keskin bir yaklaşımı temsil eder. Bu kesit tekniği endosperm yapısının, endosperm hücre şeklinin, boyutunun ve deseninin, bileşik granüllerin ve nişaste morfolojisinin hızlı bir şekilde gözlemlenmesine olanak tanır. Endosperm fenotipleme ve germplasm taraması amacıyla, pirinç çekirdeğinin 4^,23^,24kesitinin tamamını elde etmek önemlidir. Neşter bıçağının basıncının endosperim'i parçalanmaya veya parçalanmaya zorlamasını önlemek için çekirdeği tamamen pipet ucuna yerleştirmek çok önemlidir. 'Teleskop' montajının düzgün bir şekilde inşa edilmesi koşuluyla, numuneler tipik bir laboratuvar ortamında zaten mevcut malzemelerin kullanılarak 15 saniye içinde(Tablo 2)görselleştirme için hazırlanabilir. Bu teknik, çapı yaklaşık dört milimetre olan herhangi bir elipsoidal tohumun en geniş noktasında kesiti için geçerlidir. Model çim Brachypodium distachyon tohumları (Şekil S2A) benzer şekilde bölümlerek olabilir, ancak annulus içinde kapalı kalmaz. Buğday gibi daha büyük tohumlar kolayca kırılır ve kesitlerken bakım gerektirir (Şekil S2B).

Ancak, burada sunulan tekniğin birkaç sınırlaması vardır. Bu teknik kullanılarak elde edilen bölümler, parlak alan (pirinç çekirdeği bölümleri için 500 μm maksimum numune kalınlığı²⁵⁾ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) (500 nm maksimum numune kalınlığı²⁶⁾ gibi iletilen ışık bazlı mikroskobik yaklaşımlar için bu tekniğin kullanılmasını yasaklayan ışığın geçmesi için yeterince ince değildir. ). Pipet ucunun kesit 'matrisi' olarak kullanılması, bu teknik kullanılarak bölümlendirilebilen tohumun boyutunu da sınırlar. Pirinçten oldukça farklı türler için bu tekniği uyarlamak için daha fazla sorun giderme gerekir ve 'matrisin' boyutu satın alınabilecek pipet uçlarının boyutu ile sınırlıdır.

Bu tekniğin sağladığı bir diğer belirgin avantaj da tebeşirli fenotip pirinç çekirdeklerinden üretilebilen örneklerin kalitesidir. Matsushima çalışmasının bile tebeşirli fenotipler için bu özel yöntemi kullanarak kesit elde^etmeninzor olduğunu kabul ettiğini belirtmek gerekir 4 Bu çalışmada karşılaştırma amacıyla çoğaltıldığı gibi (Şekil 1S). Onların durumunda, tebeşirli pirinç örneklerini kimyasal olarak sabitlemek ve bölümleme için reçineye gömmek gerekli hale geldi. Yeni teknik, masaüstü SEM görüntüleme ile birlikte, araştırmacının pirinç çekirdeklerinin enine bölümlerini mikroskobu için immobilizasyon desteği olmadan daha fazla tutarlılıkla kolayca hazırlamasını sağlar (Tablo 3).

Fenomik ve metabolomik yeni çağda, nişastanın tohumlardaki işlevini ve önemini daha iyi anlamak için mutajen çizgilerini ve transposon etiketli kütüphaneleri izlemek önemlidir. Ayrıca, Uluslararası Pirinç Gen Bankası 130.000'den fazla pirinç katılımını elinde bulundursa²⁷. Burada sunulan gibi hızlı bir tohum fenotipleme tekniği, beslenme kalitesi için sınıflandırma ve örneklemesi hızlandırır²⁸. Son olarak, bu teknik iklim değişikliği etkilerinin aşınması ışığında yararlı olabilir. Tahıl doldurma sırasında mevsimsel yüksek sıcaklık stresi zaten tebeşirlemenin önemli bir nedeni olarak tanımlanmıştı⁶, ancak son çalışmalar pirinç veriminin artan tebeşirliliğine artan küresel sıcaklıkları^7,29'abulaştırdı. Bu tür hızlandırılmış endosperm fenotipleme, artan küresel sıcaklıkların etkisinin geniş bir tarımsal görüntüsünü sağlamaya yardımcı olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP 15	SAS	N/A	N/A
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100)	Agar Scientific	AGG3347N	N/A
Phenom Pro Desktop SEM	Thermo Scientific	PHENOM-PRO	N/A
Pipette Tips RC UNV 250 µL	Rainin	17001116	N/A
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium	Micro to Nano	10-002012-50	N/A
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm	Thermo Scientific	3120019	N/A
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm	Thermo Scientific	28618256	N/A
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle	Thermo Scientific	5334	N/A
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope	Zeiss	N/A	N/A