成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

要約

このプロトコルは、走査型電子顕微鏡を用いた、胚乳およびデンプン顆粒形態の分析のための穀物種子(例えば米)の横断切片の調製を可能にする。

要約

デンプン顆粒(SG)は、植物種、特に ポアセ科 の胚乳に応じて異なる形態を示す。子宮内精子表現型は走査型電子顕微鏡(SEM)解析を用いてSG形態型に基づく遺伝子型を分類するために使用することができる。SGは、カーネル(pericarp、アローロン層、および子宮内精子)をスライスし、オルガネラ属の内容物を露出させることによって、SEMを使用して可視化することができる。現在の方法では、米のカーネルをプラスチック樹脂に埋め込み、ミクロトームを使用して切り離すか、切り捨てられたピペットチップに埋め込み、カミソリの刃を使用して手で切り離す必要があります。前者の方法は特殊な設備を必要とし、時間がかかり、後者は米の遺伝子型に応じて新しい問題を導入します。チョーク米の品種は、特に、彼らの子宮内精子組織の不可解な性質のために、このタイプの断面に問題を提起する。ここでは、ピペットの先端とメスの刃のみを必要とする顕微鏡用の半透明およびチョーク米カーネルセクションを準備するための技術です。ピペットチップの範囲内でセクションを準備すると、米カーネルの胚乳が粉々になり(半透明または「膜状」の)、崩れ(チョーク状のフェノタイプの場合)を防ぐことができます。この手法を用い、無傷のSGの細胞パターニングや構造を観察できる。

概要

デンプン顆粒(SG)は、植物種によって異なる形態を呈し、特にポアセ科^1,2の胚乳では特に。子宮内精子表現型は走査型電子顕微鏡分析を用いてSG表現型に基づく遺伝子型を分類するために使用することができる。SGは、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、カーネルをスライスし、子宮内精子^細胞壁2を掻き取ることによって可視化することができる。

この技術の目的は、高速SEM分析のためだけに、簡単に横米カーネルセクションを準備することです。この技術の開発は、最小限の装置を使用して可視化する直前にサンプルをSEM顕微鏡用に調製する迅速な断面アプローチの必要性によって動機づけられました。

この技術は、完全な固定化のために、ピペットチップに殻を押した米のカーネルを挿入することを含む。これは、チョーク米カーネルの異型を横断する際に特に重要であり、これは、圧力³の下で容易に崩れ落ちやすい。チョークは、カーネルの外観に影響を与え、研磨と粉砕の間にカーネルが壊れやすい原因となるので、米の望ましくない品質^{です 3.}チョークは、肉眼で観察できるカーネルの断面の不透明な領域として提示します。顕微鏡レベルでは、チョークは小さく、緩く詰まったデンプン顆粒によって特徴付けられる。チョークの原因は、遺伝的^{な4、5または}環境^6、7である^可能性があります。

穀類種子の断面は、パラフィンワックスまたは別の固体マトリックス^{4、8、9、10}に埋め込まれたサンプルに続く化学的固定法および断面を使用して伝統的に調製されてきた。2010年には、複雑で時間のかかる米のカーネルサンプル調製⁴を避ける方法として、松島法が導入されました。この方法では、切り捨てられたピペットチップに殻を押した米カーネルを挿入する必要があります。先端はブロックトリマーによって静止し、薄い部分的な胚乳セクションは手持ち型のカミソリの刃を使用して収穫される。2016年に開発された別の迅速な技術は、チョーク品種¹⁰を含む多種多様な乾燥種子の薄い全体の切り分けを可能にしました。これらの方法は、ここで提示された迅速な技術の開発を動機づけました。

この新しい技術は、SEMを用いた胚乳フェノタイピングやデンプン形態解析のために、米核の断面をそのまま取得したい研究者に適しています。

このプロトコルは、松島切り捨てピペットチップ法⁴の適応を表し、いくつかの顕著な変更を伴います:(1)カーネルは、技術のどの時点でも浸透していません。(2)セクションを準備するためにブロックトリマーもウルトラミクロトームも必要としない。野生型の「半透明」品種(オリザ・サティバL.ssp. japonica cv. 日本バレ)と日本裸の変異体化された「チョーク状」ライン(ssg1、標準以下デンプングレイン1)4をこの研究で検討した。これらの2つの品種は、半透明とチョーク型の米のセクションの処理における技術的および視覚的な違いを実証するために、ここで分析のために選択されました。

プロトコル

1. 横米セクションの準備

1. 図 1Aに示すように、デハスクドライ、無傷のカーネル.
   1. 2つの平らなゴム製ストッパーの間でカーネルを粉砕することによって、殻とデハルライスカーネルを緩めます。必要に応じて、シャクした米のカーネルをパニックから取り除きます。
   2. 作業台の平らなゴム製ストッパーに単一のカーネルを置く(図1B)。このストッパーが静止したままであることを確認します。
   3. 第1ゴム栓に対して、十分な圧力を使用して、カーネルをブラドリングするために第2平らなゴム栓(図1C)を使用する(図1D)。カーネルから殻を取り除き、胚乳を粉々にしないように注意してください。細かい鉗子を使用して残りの殻を取り除きます。 図 1Eに、脱殻カーネルを示します。
2. 微細な鉗子を使用して、個々の殻付きカーネルをプラスチックピペットチップ(250 μLサイズ、1種/チップ)に挿入します(図1F)。カーネルの胚端がピペットチップの(円錐形)端に向かっていることを確認します(図1G)。
   注: カーネルをこのように挿入すると、カーネルが近位の端に向かって狭くなるにつれて、カーネルがピペットチップにできるだけぴったりと収まるようになります。
3. 2番目の250 μLピペットチップを挿入して、カーネルをピペットチップに押し込み、切除中にカーネルを動かさないようにします。適切な「望遠鏡」の集合体を 図1Iに示します。
4. ピペットチップの集合体を作業台に平らに置き、手で所定の位置に保持する(図1J)。一方、鋭いメスの刃(20番)を使ってカーネルの中央をスライスし、ピペット先端の端を切り落とします(図1K)。メスを使用して、米のカーネルの1mmの厚い部分をカットしました(図1L)。
   注: カーネルセクションはプラスチックのアヌラスで密に囲まれています(図1M)。3つの例示的な遺伝子型の平均断面厚さは 表1に記載されています。1mmより著しく薄いセクションは粉々になるか、または崩壊する。デンプンの形態は、胚乳¹¹全体で変化するので、この実験が比較のためにいくつかの種類の米に対して行われている場合、各セクションのカーネルのどの部分が始まるのか注意することが重要である。

2. 横米部の反射光顕微鏡

1. 細かい鉗子を使用して、横米セクション(セクション1で用意)を黒いゲージの黒い紙の上に置きます。
2. 図 1N-Sに示すように、斜めの照明用にグースネックを取り付けた立体顕微鏡を使用して、日本ベアの横切り部分の光画像を取得します。
3. 少なくとも10倍の倍率で、子宮内精子形態を観察する。
   注: この手法を使用して得られたセクションは光が通過するのに十分な薄さではないため、明視野顕微鏡よりもエピライト光源が好ましいです。

3. 横米断面の走査型電子顕微鏡

1. サンプルをアルミニウムスタブに貼り付けたカーボンディスク上に置き、チャージリダクションサンプルホルダーの上に置きます。プラスチックがSEMの真空装置に入るのを防ぐために、細かい鉗子を使用してピペットチップマウントからプラスチックリングを取り外します。
   注:子宮内精子細胞、SG、およびサブ顆粒の画像は、スパッタコーティングするサンプルを必要としないデスクトップSEMマシンを使用して取得されます。
2. 10kVで高感度マルチモード後方散乱電子(BSE)検出器を使用して画像を取得します。

結果

野生型の日本裸(図2A)と ssg1 セクション(図2B)を、260x、920x、4200xの3つの倍率で調べた。この技術は、十分な質のセクションを作製し、全ての胚乳細胞(図3A)、化合物デンプン顆粒(図3B)、および個々のサブ顆粒(図3C)を観察する。Husked カーネルは、切断前に摩耗によって除去する必要があるため、磨かれたカーネルよりも処理に時間がかかります。チョークカーネルはまた、切断中にカーネルを粉砕しないように注意しなければならないので、研磨された半透明のカーネルよりも処理に時間がかかります。適切に準備された米の部分は、約0.9mmの厚さ(表1)で、子宮内精子(図1N)と無傷の腹膜およびアローロン層の粉砕を最小限に抑える必要があります(図1O)。切り離し時にピペットチップにメスを不適切に配置すると、セクションが欠けする可能性があります(図1P)。同様に 、ssg1 の最適な横切りセクションの明るいフィールド画像(図1Q)は、無傷の子宮内精子、包皮、およびアローロン層をそのまま可視化し、可視化可能に示した(図1R)。SG を観察するだけなら、壊れたチョークカーネルセクション(図1S)は、まだ可視化に使用できるかもしれませんが、子宮内精子細胞パターンは見えません。壊れたセクションは、解析のために扱うのが難しい場合があります。細胞は ssg1 カーネルよりもしっかりと詰め込まれ、難易度が低いので、胚乳細胞壁のより多くの剪断が野生型の日本裸で観察された。 ssg1 セクションでは、胚芽細胞の剪断は認められず、化合物デンプン顆粒はそのままである。

図S1は、米のカーネルを切除する「望遠鏡」技術を用いた結果の信頼性を示しています。半透明のカーネル生産者として識別された米線 - 野生型耐性デンプン(RS)ハイブリッドラインXieyou 7954(オリザサティバL.インディカ)12、13、14(図S1A)とコバルト生成変異体RS111^13、15(図S1B)は、光がステレオ顕微鏡を使用して見えるセクションを生成しました。対応するSEM画像は、これらのラインが「正常な」米の胚乳能を生成することを明らかにしました:しっかりと詰まった、多面体デンプン顆粒。チョーク状カーネル生産者は、市販品Yi-Tang¹⁶⁽図S1C)およびRS4 13、RS111115の変異体(図S1D)、白色、不透明なカーネル切片を示した。対応するSEM画像は、野生型半透明RS背景線と比較して著しく異なる形態を表示しました:デンプン顆粒は丸く、緩く詰め込まれました。野生型Xiushui11(オリザサティバL.ssp.ジャポニカ)とその変異体であるKMD1(Kemingdao1)は、昆虫の閉食を阻害するCry1Ab遺伝子を発現するKMD1(Kemingdao1)17、18、19(図S1F)は、半透明RS線に類似した切片および子宮内精子形態を呈した。

ここで紹介する技術は、表現型分析のためのチョーク状の米核のサンプルを調製するのに最適であるが、半透明の米核表現型²⁰を切り離す利点を提供する:上記からの圧力を用いてサンプルをスライスすると、子宮内胚乳の粉砕および脱臼のリスクを低減する。サンプルは数秒以内に簡単に準備できます(表2)。この技術を用いて複数の遺伝子型を分析し、その有効性をテストした(表3)。図S2に示すように、この技術は他の種の種子に適用することができる。モデルモノコットブラキゲッテディスディスタキオンは、B-顆粒デンプン²¹のみを含む非常に硬い種子を産生し、これは、純粒状肉粒²²に柔らかさを与えるタンパク質であるプロイヌリンAを欠いている。それでも、そのまま横断面を得ることが可能であった(図S2A)。軟白冬小麦(SWWW)から無傷の横切れ部を得るは困難であったが、実行することができる(図S2B)。SWWW種子は、B.ディタキオン種子や米のカーネルと比較すると、プロイヌリンAが高く、大きい。望遠鏡の集合体を使用して切除すると、これらの種子は頻繁に崩壊します。

遺伝子型	望遠鏡の集合体を用いた平均断面幅(μm)	平均断面幅(μm)の断面フリーハンド
日本裸(殻付き)	971.7 ± 152.4ab	1059.571 ± 394.2ab
謝陽 7954	825.1 ± 128.3b	1306.187 ± 179.1a
RS4	910.6 ± 165.0ab	1126.694 ± 395.3ab
P < 0.01 では、一方向分散分析 (ANOVA) と Tukey の検定 (n = 10) を使用しても、同じ文字が続く平均は大きく異なりません。統計分析はJMP 15ソフトウェアを用いて行った。

表1:カーネル断面の厚さの平均値

遺伝子型	平均時間(s)*
日本裸(殻付き)	14.7 ± 1.36a
謝陽 7954	9.81 ± 0.98b
RS4	11.9 ± 1.28c
*望遠鏡の組み立てを使用。
P < 0.01 では、一方向分散分析 (ANOVA) と Tukey の検定 (n = 10) を使用しても、同じ文字が続く平均は大きく異なりません。統計分析はJMP 15ソフトウェアを用いて行った。

表2:サンプル調製時間の平均値。

遺伝子型	バックグラウンド	品質
日本裸	ワイルドタイプ	半透明
標準以下の澱粉粒1 (ssg1)	日本裸	白亜質
耐性デンプン(RS) 謝陽 7954	ワイルドタイプ	半透明
RS111	謝陽 7954	半透明
RS4	RS111	白亜質
イタン「新しい人生」、ルジュレンブランド	謝陽 7954	白亜質
秀輝 11	ワイルドタイプ	半透明
ケミンダオ1 (KMD1)	秀輝 11	半透明

表3:本研究で調べた米の遺伝子型

図1:横米セクションの作製(A)野生型日本裸カーネルと無傷の殻。(B)、直径4インチのゴム栓に置かれたカーネル。(C)ハクスは、2つのアポージングゴム製ストッパーの間でカーネルを粉砕することによって除去された。(D) 殻は米のカーネルから分離されています。(E) 殻を閉じた米のカーネルのクローズアップ。胚末端が示される。(F)微細な鉗子を用いてピペットチップにカーネルを挿入する。(G) ピペット先端の遠位端にカーネルが入った。(H) 切除用カーネルを固定化するための第2ピペットチップの挿入(望遠鏡集合体)。(I)米のカーネルはピペット先端の遠位端にぴったりと取り付けられた。(J)集合体内の米核の切除。(K) 断面カットのクローズアップ。(L) プラスチック環状の環状のカーネルの一部。(M) 横セクションのクローズアップ。(N) 野生型日本裸の横部。(O) 野生型日本裸部内の胚乳のクローズアップ(P)野生型日本裸カーネルの貧弱、最適でない部分。(Q) 日本バレ変異体ssg1⁴の横部(R) ssg1セクション内の子宮内精子のクローズアップ。(S) ssg1の下手な、最適でないセクション。バー(パネルA、N- S)=1mm。全体の米のカーネルとセクションは、デジタルズームカメラとグースネックライトを搭載した実体顕微鏡を使用して画像化されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:横方向カーネルセクションのSEM画像(A)ワイルドタイプの日本裸、半透明の品種。化合物デンプン顆粒は互いにしっかりと固められていた;(B)日本裸体変異体ssg14、チョーク状表現型化合物デンプン顆粒は緩やかに詰め込まれ、野生型の日本芽スターチ形態のセメント性を欠いていた。左から右への拡大:260x、920x、および4200x。バーの長さはパネルに示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:西秀輝11の横方向カーネル部のSEM顕微鏡解剖学。(A) 単一の子宮内精子細胞が赤で輪郭を描く。260倍の倍率。(B) 化合物澱粉顆粒が赤で輪郭を描く。920倍の倍率。(C)複数のデンプンのサブ顆粒が赤で輪郭を描いている。2250x倍率。バーの長さはパネルに示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図S1:この技術を用いてSEM用に調製された他の米遺伝子型の横断部。(A) 耐性澱粉 (RS) 謝陽 7954¹².(B)RS111、7954¹³の高RS透過変異体。(C)RS4、RS1111115のチョーク状変異体。(D)イタン、高アミロース米¹⁶の商業品種。(E) 秀輝 11.(F) KMD1 (ケミンダオ1)^17,18,19.明るいフィールド画像の10倍の倍率。白い棒 = 1 mm. 2250x の SEM 画像の倍率。バーの長さはパネルに示されます。こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。

図S2:テクニックは他の種子に有用である。(A)偽紫ブロムの横切りセクション(ブラキ表ディスタキオンL.加盟Bd21)種子。(B)柔らかい白い冬の小麦の横断セクション(トリチカム・アエスティバムL.cv. オーガスタ)種子。明るいフィールド、20倍の倍率。バー= 1 mm.こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。

ディスカッション

ここで紹介する手法は、デスクトップ SEM の視覚化のための横断的な米の断面を準備するための、高速でシンプルで鋭いアプローチを表します。この断面化技術により、胚乳細胞の形状、大きさ、パターン、化合物顆粒、デンプン形態の迅速な観察が可能になります。胚精子のフェノタイピングや胚芽スクリーニングの目的のために、米カーネル^4、23、24の全断面を得ることが重要である。メスの刃の圧力が粉々になったり粉々になったりするのを防ぐために、ピペットチップ内にカーネルを完全に挿入することが最も重要です。「望遠鏡」の集合体が適切に組み立て済みである限り、サンプルは、典型的な実験室の設定で既に手に入っている材料を使用して、15秒以内に可視化のために調製することができる(表2)。この技術は、楕円体の種子の断面に適用可能です 直径約4ミリメートルの最も広い点で.モデル草の種はブラキ表ディスタキオン(図S2A)も同様に切り離すことができますが、環状に囲まれたままにしないでください。小麦のような大きな種子は、容易に骨折し、断面化時に注意を必要とします(図S2B)。

ただし、ここで示す手法には、いくつかの制限があります。この技術を用いて得られたセクションは、光が通過するのに十分な薄さではなく、明視野(米カーネルセクション²⁵の最大サンプル厚さ500 μm)や透過電子顕微鏡(TEM)(500 nm最大サンプル厚さ²⁶⁾のような透過光ベースの顕微鏡アプローチに対して使用することを禁止する).また、断面「マトリックス」としてピペットチップを使用すると、この技術を使用して切り離すことができる種子のサイズも制限されます。米とは非常に異なる種に対してこの技術を適応させるためには、さらなるトラブルシューティングが必要であり、「マトリックス」のサイズは、購入可能なピペットチップのサイズによって制限されます。

この技術が提供するもう一つの明確な利点は、チョーク状の表現型の米のカーネルから作り出すことができるサンプルの質である。松島の研究でさえ、比較を目的として本研究で再現されたチョーク状表現型⁴の特定の方法を用いて断面を得ることは困難であると認めたことは注目に値する(図1S)。その場合、チョーク状の米サンプルを化学的に固定し、切り離し用の樹脂に埋め込む必要が生じるようになった。この新しい技術は、デスクトップSEMイメージングと組み合わせて、研究者が固定化サポートなしでより一貫性のある顕微鏡用の米カーネルの横断セクションを簡単に準備することを可能にする(表3)。

フェノミクスとメタボロミクスの新時代には、種子中のデンプンの機能と重要性をよりよく理解するために、変異原性線とトランスポゾンタグ付きライブラリを監視することが重要です。さらに、国際ライスジーンバンクは、130,000米のアクセスを²⁷以上保持しています。ここで示したような迅速な種子のフェノタイピング技術は、栄養の質²⁸のための分類とサンプリングを促進するだろう。最後に、この技術は、気候変動の影響を侵食することに照らして有用である可能性があります。穀物充填時の季節的な高温ストレスは、すでにチョークの主な原因として同定されていた^が、最近の研究は、米収量^7、29のチョーク性の増加に世界的な気温の上昇に関与している。このような迅速な胚乳型のフェノタイピングは、世界的な温度の上昇の影響の広範な農業イメージを提供するのに役立つかもしれない。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP 15	SAS	N/A	N/A
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100)	Agar Scientific	AGG3347N	N/A
Phenom Pro Desktop SEM	Thermo Scientific	PHENOM-PRO	N/A
Pipette Tips RC UNV 250 µL	Rainin	17001116	N/A
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium	Micro to Nano	10-002012-50	N/A
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm	Thermo Scientific	3120019	N/A
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm	Thermo Scientific	28618256	N/A
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle	Thermo Scientific	5334	N/A
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope	Zeiss	N/A	N/A