小鸡西里神经神经元的分离与培养

摘要

小鸡丝神经通（CG）是寄生虫神经系统的一部分。在神经肌肉相互作用研究中，小鸡CG神经元的神经元培养被证明是有效的细胞模型。我们描述了从小鸡胚胎中解剖、分离和体外培养的详细方案。

摘要

小鸡丝骨神经合体（CG）是寄生虫神经系统的一部分，负责眼睛中肌肉组织的内膜。这种结节是由一个同质的胆小和胆状神经元组成的，分别内维条纹和平滑的肌肉纤维。这些神经元类型都调节特定的眼部结构和功能。多年来，在肌肉-神经系统相互作用研究中，小鸡胆碱神经的神经元培养被证明是有效的细胞模型，通过胆碱性突触进行交流。胆结神经元，在其大多数，胆碱性。与以前使用的异质细胞模型相比，这种细胞模型已被证明是有用的，这些异构细胞模型包括多种神经元类型，除了胆碱。解剖学上，胆碱结节在视神经（ON）和胆状肌瘤（CF）之间局部。在这里，我们描述了从小鸡胚胎中解剖、分离和体外培养的一个详细程序。我们提供一个分步协议，以获得CG神经元高度纯净稳定的细胞培养，突出过程的关键步骤。这些文化可以在体外保持15天，在此，我们显示了CG文化的正常发展。研究结果还表明，这些神经元可以通过神经肌肉胆碱性突触与肌肉纤维相互作用。

引言

Ciliary结节（CG）神经元属于寄生神经系统。这些神经元是胆碱，能够建立肌肉或烟酸突触^{1，2，3。,31,}从解剖学上讲，CG位于视神经（ON）和胆虫肌瘤（CF）之间的眼后部，由大约6000个处于早期胚胎阶段^{1、4,的神经元组成}。在培养的第一周，硅突神经元呈现多极形态。一周后，他们开始过渡到单极状态，一个神经石延伸并形成轴^孔5。此外，大约一半的CG神经元死亡之间的8^天至14^日小鸡胚胎发育，通过细胞死亡的编程过程。神经元数量的减少导致大约3000个神经元6，7，8^6,的西里^{结子的总种群}。在体外，当生长与肌肉细胞⁹和CG神经元可以培养几个星期1，9时^，CG神经元^{的数量没有减少}。

胆结由同性细胞神经元和胆状神经元的均匀种群组成，每个细胞群代表CG中神经元群的一半，内维眼睛的肌肉。这两种类型的神经元在结构上、解剖学和功能上是截然不同的。虹膜和透镜上的心肌神经元内侧，负责瞳孔收缩。胆道神经元内侧^,增强胆道1、10、11、12^{1,10,11的平滑肌}。

鸡骨结神经元的培养已被证明是研究神经肌肉突触和突触形成^{1，5，95的有用工具}。¹考虑到神经肌肉突触是胆碱^13，使用神经群是胆碱性-CG神经元-出现作为一个潜在的替代以前的细胞模型^14。这些模型包括异源神经元群体，其中只有一小部分是胆碱性。或者，在体外发育得相对较快，大约15小时后已经形成突触^1。CG神经元多年来一直被用作模型系统，用于不同的研究，因为它相对容易分离和操作。这些应用包括光遗传学研究，突触发育，凋亡和神经肌肉相互作用^{14，15。14,}

我们描述了从胚胎第7天（E7）小鸡胚胎中解剖、分离和体外培养的一个详细程序。我们提供一个分步协议，以获得高度纯净和稳定的细胞培养的胆碱神经元。我们还强调了需要特别注意并改善神经元培养质量的协议的关键步骤。这些培养物可以在体外保持至少15天。

研究方案

1. 试剂制备

注:本程序所需的材料如下:钳子（第5和no 55）、手术钳、解剖培养皿（黑底）、24孔板、塑料巴斯德移液器、火抛光玻璃巴斯德移液器、10 mL注射器、0.22μm注射器过滤器。

1. 准备和消毒协议所需的所有材料，包括玻璃盖玻片、钳子（第5和no 55）、手术钳子、培养皿（黑底）、蒸馏_H2O、移液器和手术材料。
2. 准备 0.1 毫克/mL 聚-D-Lysine （PDL） 溶液。
   1. 在0.1 M玻酸缓冲液（pH 8.2）中重组PDL，浓度为1mg/mL（10x溶液）。
   2. 在 166.6 mM 玻利气液缓冲液 （pH 8.2） 中稀释 1:10，以获得 0.1 mg/mL 的最终浓度。
3. 准备 10 μg/mL 层压素溶液。
   1. 在普通神经基础介质中稀释1mg/mL层宁，最终浓度为10μg/mL。
4. 准备汉克的平衡盐溶液 （HBS）: 5.36 mM KCl， 0.44 mM KH₂PO₄， 137 mM NaCl， 4.16 mM NaHCO3， 0.34 mM Na₂HPO₄+2H₂O， 5 mM 葡萄糖， 1 mM 丙酮酸钠， 10 mM HEPES 缓冲液， 0.001% 苯酚红色.将 pH 调整到 7.2。
5. 准备 0.1% 的 trypsin 溶液。
   1. 在5 mL的HPSS中溶解5毫克的尝试蛋白1:250粉末，最终浓度为0.1%。
   2. 在4°C下放入滚筒搅拌机中，直到完全溶解。
   3. 使用 10 mL 注射器和 0.22 μm 注射器过滤器进行过滤器。
6. 准备丝室神经节不完全介质:无谷氨酰胺的神经基础介质，1X B27（光敏），10%热灭活马血清，2%热灭活FBS，12.5 U/mL青霉素/链霉素（0.25x）和2mM谷氨酰胺。使用无菌试剂，并在无菌条件下准备培养介质。
7. 准备硅刚体完整介质（辅以生长因子）:在不完全介质上，加入5纳克/mL GDNF和5纳克/mL CNTF。

2. 为24孔板准备玻璃盖玻片

1. 将所需数量的玻璃盖玻片放在耐酸容器内，并加入 65% 的硝酸，直到所有盖玻片被淹没。将容器放在轨道摇床中，在室温 （RT） 下以 1000 rpm 的速度孵育过夜。
2. 第二天，小心地将硝酸转移到一个小储液罐中，并储存进一步使用。硝酸可再使用2-3倍。
3. 小心地将蒸馏的 H₂O 添加到盖玻片中，以去除剩余的硝酸。搅拌 30 分钟，丢弃洗涤溶液，重复此 5 倍。
4. 用 75% 乙醇冲洗盖玻片两次。
5. 小心地分离并放置单个盖玻片，将铝箔覆盖在金属机架中，并在 50 oC 下孵育 10-15 分钟，或直到完全干燥。
   注:请勿将玻璃盖玻片进行遮挡，因为它们会相互粘附。
6. 在紫外线下消毒盖玻片 10-15 分钟。保持盖玻片无菌的神经元组织培养。

3. 24 孔板的玻璃盖玻片涂层

1. 使用无菌钳子，在 24 井板的每个井中放置一个盖玻片。
2. 加入500μL 0.1毫克/mL PDL，在37°C下孵育过夜。
3. 第二天，用无菌蒸馏H2 O冲洗盖_玻片两次。然后，将500μL的蒸馏水加入每个盖玻片，并在室温下离开30分钟。
4. 弃水，在每个井中加入350μL的10μg/mL层压素溶液。
5. 放在37°C培养箱中2小时。
6. 在细胞电镀之前，取出层压素溶液，用普通神经基础介质洗涤两次。
   注:盖玻片必须不干燥。
7. 加入300μL的完整介质，在37°C和5%CO2的培养箱中离开，直到电₂镀时间。在电镀电池之前，请取出此介质。

4. 鸡胚胚的丝骨节生文化 （胚胎第7天）

1. 硅刚体解剖 （CG）
   1. 从孵化器中取出鸡蛋，用75%乙醇喷洒。
      注:鸡蛋储存在+16°C，然后以37.7°C孵育7天（或所需的胚胎期）。这里使用的鸡蛋来自罗斯鸡种。
   2. 用剪刀切掉鸡蛋的顶部，用勺子取出胚胎。将胚胎放在带冰冷HSS的培养皿中，通过颈部区域切割将头部与身体分离。
      注:一旦胚胎从卵子中去除，它就可以产生导致细胞死亡的蛋白酶。一旦胚胎在壳体外，迅速将头部与身体分离，以尽量减少细胞死亡，这一点很重要。
   3. 将胚胎的头部放在冰冷的 HBSS 中。
   4. 举起胚胎头，用5个钳子把它固定在小鸡的嘴上。然后用55个钳子，开始去除眼睛周围的薄层皮肤。
   5. 小心地取出眼睛并旋转眼睛以进入后部。分离眼睛和小鸡头部时，注意视神经被分部。这将有助于本地化的 cilis 结节。
   6. 一旦眼睛被分离，保持它与后侧向上，并注意到与分割的视神经和胆状肌裂变相邻的胆结。前结神经可能仍然附着在丝雀结节上，这有利于识别。
   7. 从每只眼睛中解剖结节，通过去除每个结节周围的多余的组织来清洁得很好。
      注:要具有±1x10^{6个细胞/mL}的产率，解剖±70 CGs。请注意，获得的细胞组也含有非神经元细胞。为了减少非神经元细胞的数量，从而增加神经元群的纯度，尽可能清洁丝骨神经，去除所有多余的组织是非常重要的。
2. 硅联的分离与文化
   1. 使用无菌塑料巴斯德移液器将所有硅刚杆收集到 15 mL 管中。
      注:必须预先湿润巴斯德移液器，以尽量减少将小松附到移液器壁上。
   2. 在200 x g下离心2分钟。
   3. 小心地，使用巴氏移液器和 P1000 微移液器拆下所有 HBSS 介质。加入1 mL的0.1%的三辛酸盐溶液，在37°C的水浴中孵育20分钟，无搅拌。
   4. 在200 x g下离心2分钟。
   5. 立即删除 trypsin 溶液，并添加 1 mL 的不完整介质。
      注:不完全的介质含有血清，这将立即停止尝试蛋白的效果。
   6. 在 200 x g 下离心 2分钟，并取出所有介质。
   7. 加入350-500μL的完整介质。
      注:分离细胞所需的体积取决于获得的硅细胞数量，因此取决于获得的颗粒大小。对于 ±70 CG，建议使用 500 μL 的介质。
   8. 首先使用 P1000 将上下移液 10-15 倍，然后使用火抛光玻璃巴斯德移液器 10-15 倍，分离 10-15 倍。避免形成气泡，以尽量减少细胞损失。
      注:将细胞悬浮液放在冰上直到电镀。
   9. 使用 Trypan 蓝色溶液和标准 Neubauer 腔室确定细胞密度。
   10. 板 1 x 10⁴细胞/mL 在 24 井板的每个井中，通过稀释适当体积的细胞悬浮液在 500 μL 的完整介质（辅以 10 μM 5'-FDU）。
   11. 在37°C中孵育细胞，5%CO₂培养箱。

5. 细胞细胞化学及细胞神经元图像分析

1. 执行本文中介绍的免疫细胞化学测定，如前面描述的^{16、17。16,}
2. 使用以下原抗体:小鼠单克隆b-III 块蛋白 （1:1000， T8578），鸡单克隆神经丝 M （1:1000， AB5735），小鼠单克隆 SV2 （1:1000， AB2315387）。
3. 作为二级抗体， 使用亚历克萨氟568结合山羊抗小鼠抗体（1:1000，A11031），亚历克萨氟568结合山羊抗鸡抗体（1:1000，A11041），亚历克萨氟647-结合山羊抗小鼠抗体（1:1000，A21235）。
4. 使用带 DAPI 的安装介质安装盖玻片，用于核染色 （P36935）。

结果

此过程的估计持续时间紧要取决于每个特定实验所需的产量，因此取决于需要分离的硅合体数量。对于估计产量为1 x 10⁶细胞/mL，分离约70个硅节（35个鸡蛋）。对于这一数量的刚体，解剖过程需要2-3小时，整个手术总共需要4-5个小时。图 1A 显示了隔离协议的分步图示。识别硅丝结节可能很困难，尤其是在首次执行此协议时。胆结在视神经和胆状肌裂附近的局部（图

讨论

在该协议中，我们演示了如何准备和培养CG神经元。对于没有经验的用户来说，对西里结子的识别和解剖可能很困难。因此，我们提出了一个详细的和分步的程序，以有效地解剖E7小鸡丝骨神经，分离组织，并准备神经元培养，可以保持至少15天。通过此协议获得的 ciliion 节神经元也适合与肌肉细胞共培养。

根据研究的目的，在小鸡胚胎发育的不同发育阶段，可用作细胞模型?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018