Isolation und Kultur von Chick Ciliary Ganglion Neurons

Zusammenfassung

Küken-Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems. Neuronale Kulturen von Küken CG Neuronen wurden gezeigt, dass effektive Zellmodelle in der Studie der Nervenmuskel-Interaktionen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von CG-Neuronen aus Kükenembryonen.

Zusammenfassung

Küken Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems und sind verantwortlich für die Innervation der Muskelgewebe im Auge vorhanden. Dieses Ganglion besteht aus einer homogenen Population von Ziliar- und Aderhautneuronen, die die muskelfasern inneren und glatten Muskelfasern bilden. Jeder dieser neuronalen Typen reguliert spezifische Augenstrukturen und Funktionen. Im Laufe der Jahre zeigten sich neuronale Kulturen der Küken-Ziliarganglien als wirksame Zellmodelle bei der Untersuchung von Muskel-Nerven-System-Wechselwirkungen, die durch cholinerge Synapsen kommunizieren. Ziliarganglien-Neuronen sind in ihrer Mehrheit cholinerge. Dieses Zellmodell hat sich als nützlich für bisher verwendete heterogene Zellmodelle erwiesen, die neben cholinergen verschiedene neuronale Typen umfassen. Anatomisch wird das Ziliarganglien zwischen dem Sehnerv (ON) und der Aderhautspalte (CF) lokalisiert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von Ziliarganglien-Neuronen aus Kükenembryonen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um hochreine und stabile Zellkulturen von CG-Neuronen zu erhalten, wobei die wichtigsten Schritte des Prozesses hervorgehoben werden. Diese Kulturen können 15 Tage lang in vitro gepflegt werden und zeigen damit die normale Entwicklung von CG-Kulturen. Die Ergebnisse zeigen auch, dass diese Neuronen mit Muskelfasern durch neuromuskuläre cholinerge Synapsen interagieren können.

Einleitung

Ziliarganglion (CG) Neuronen gehören zum parasympathischen Nervensystem. Diese Neuronen sind cholinerg, in der Lage, muscarinische oder nikotinische Synapsen^1,2,3. Anatomisch befindet sich die CG im hinteren Teil des Auges zwischen dem Sehnerv (ON) und der Aderhautspalte (CF) und besteht aus rund 6000 Neuronen in frühen embryonalen Stadien^1,4. Für die erste Kulturwoche präsentieren Ziliarganglien-Neuronen eine multipolare Morphologie. Nach einer Woche beginnen sie, in einen unipolaren Zustand überzusteigen, wobei sich ein Neurit ausdehnt und das Axon⁵bildet. Darüber hinaus stirbt etwa die Hälfte der CG-Neuronen zwischen dem^8. und^14. Tag der Entwicklung von Kükenembryonen durch einen programmierten Prozess des Zelltodes. Dieser Rückgang der Anzahl der Neuronen führt zu einer Gesamtpopulation des Ziliarganglien von etwa 3000 Neuronen^6,7,8. In vitro, Es gibt keine Verringerung der Anzahl der CG Neuronen, wenn mit Muskelzellen⁹ und CG Neuronen wachsen kann für mehrere Wochen kultiviert werden^1,9.

Das Ziliarganglie besteht aus einer homogenen Population von Ziliarneuronen und Aderhautneuronen, die jeweils die Hälfte der neuronalen Population in der CG darstellen und den Muskel des Auges innervieren. Diese beiden Arten von Neuronen sind strukturell, anatomisch und funktionell unterschiedlich. Ziliarneuronen innervate die gestreiften Muskelfasern auf der Iris und Linse, verantwortlich für die Pupillenkontraktion. Aderhautneuronen innervate den glatten Muskel der Aderhaut^1,10,11,12.

Kulturen von Hühnerziliar Ganglien Neuronen haben sich als nützliche Werkzeuge für die Untersuchung von neuromuskulären Synapsen und Synapsenbildung^1,5,9. Wenn man bedenkt, dass neuromuskuläre Synapsen cholinerge^{sind 13}, mit einer neuronalen Population, die cholinergen ist – CG-Neuronen – entstand als mögliche Alternative zu früheren Zellmodellen¹⁴. Diese Modelle bestanden in einer heterogenen neuronalen Population, in der nur ein kleiner Teil cholinergisch ist. Alternativ entwickeln sich Ziliarganglien-Neuronen relativ schnell invitro und bilden nach ca. 15 Stunden bereits Synapsen¹. CG-Neuronen wurden im Laufe der Jahre als Modellsystem für verschiedene Forschungsstudien verwendet, aufgrund seiner relativ einfachen Isolation und Manipulation. Diese Anwendungen umfassen optogenetische Studien, Synapsenentwicklung, Apoptose und neuromuskuläre Wechselwirkungen^14,15.

Wir beschreiben ein detailliertes Verfahren für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von Ziliarganglien-Neuronen aus embryonalen Tag 7 (E7) Kükenembryonen. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um hochreine und stabile Zellkulturen von cholinergen Neuronen zu erhalten. Wir heben auch die wichtigsten Schritte des Protokolls hervor, die besondere Aufmerksamkeit erfordern und die Qualität der neuronalen Kulturen verbessern werden. Diese Kulturen können in vitro für mindestens 15 Tage aufrechterhalten werden.

Protokoll

1. Herstellung von Reagenzien

HINWEIS: Die für dieses Verfahren notwendigen Materialien sind die folgenden: Zangen (Nr. 5 und Nr. 55), chirurgische Pinzette, Sezieren Petrischalen (schwarzer Boden), 24-Well-Platten, Kunststoff Pasteur Pipette, feuerpolierte Glas Pasteur Pipette, 10 ml Spritze, 0,22 m Spritze Filter.

1. Bereiten und sterilisieren Sie alle Materialien, die für das Protokoll benötigt werden, einschließlich Glasabdeckungen, Zangen (Nr. 5 und Nr. 55), chirurgische Pinzette, Petrischalen (schwarzer Boden), destillierte H₂O, Pipetten und Material für die Chirurgie.
2. Bereiten Sie 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) Lösung vor.
   1. PDL im 0,1 M Boratpuffer (pH 8,2) auf eine Konzentration von 1 mg/ml (10x Lösung) rekonstituieren.
   2. 1:10 in 166,6 mM Boratpuffer (pH 8,2) verdünnen, um eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml zu erhalten.
3. Bereiten Sie die Lamininlösung mit 10 g/ml vor.
   1. Verdünnen Sie 1 mg/ml Laminin in einem einfachen neurobasalen Medium auf eine Endkonzentration von 10 g/ml.
4. Hank es Balanced Salt Solution (HBSS): 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 4.16 mM NaHCO3, 0.34 mM Na₂HPO₄'2H₂O, 5 mM Glucose, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES Puffer, 0.001% rot. PH auf 7,2 einstellen.
5. Bereiten Sie 0,1% Trypsin-Lösung vor.
   1. 5 mg Trypsin 1:250 Pulver in 5 ml HBSS für eine Endkonzentration von 0,1% auflösen.
   2. In einen Walzenmischer bei 4 °C geben, bis er vollständig gelöst ist.
   3. Filtern Sie mit einer 10 ml Spritze und einem 0,22 m Spritzenfilter.
6. Bereiten Ziliarganglien unvollständiges Mediumvor: neurobasales Medium ohne Glutamin, 1X B27 (fotoempfindlich), 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 2% hitzeinaktiviertes FBS, 12,5 U/ml Penicillin/Streptomycin (0,25x) und 2 mM Glutamin. Verwenden Sie sterile Reagenzien und bereiten Sie das Medium unter sterilen Bedingungen vor.
7. Bereiten Ciliary Ganglia komplettes Medium (ergänzt mit Wachstumsfaktoren): zum unvollständigen Medium, fügen Sie 5 ng/mL GDNF und 5 ng/mL CNTF.

2. Herstellung von Glasabdeckungen für 24-Well-Platten

1. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Glasabdeckungen in einen säurebeständigen Behälter und fügen Sie 65% Salpetersäure hinzu, bis alle Abdeckungen untergetaucht sind. Den Behälter in einen Orbital-Shaker legen und über Nacht bei Raumtemperatur (RT) bei einer Geschwindigkeit von 1000 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
2. Am nächsten Tag die Salpetersäure vorsichtig in ein kleines Reservoir überführen und für die weitere Verwendung aufbewahren. Salpetersäure kann 2-3x wiederverwendet werden.
3. Fügen Sie die destillierten_H2O vorsichtig zu den Deckellipsen hinzu, um die verbleibende Salpetersäure zu entfernen. 30 Minuten in Rührung geben, die Waschlösung entsorgen und 5x wiederholen.
4. Spülen Sie die Deckellipsen zweimal mit 75% Ethanol.
5. Trennen und legen Sie einzelne Abdeckungen sorgfältig in ein metallenes Rack, das mit Aluminiumfolie bedeckt ist, und inkubieren Sie bei 50 oC für 10-15 Minuten oder bis zum Trocknen.
   HINWEIS: Autoklaven Sie Glasabdeckungen nicht, da sie aneinander kleben.
6. Sterilisieren Sie die Abdeckungen unter UV-Licht für 10-15 Minuten. Halten Sie Abdeckungen steril für neuronale Gewebekultur.

3. Beschichtung von Glasabdeckungen für 24-Well-Platten

1. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie einen Deckelrutsch in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte.
2. 500 l 0,1 mg/ml PDL hinzufügen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Am nächsten Tag die Deckel zweimal mit steril destillierth H₂O abspülen. Dann 500 l destilliertes Wasser zu jedem Deckelschlupf hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur lassen.
4. Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie in jedem Brunnen 350 l mit 10 g/ml Lamininlösung hinzu.
5. In einem 37 °C-Inkubator für 2 h aufstellen.
6. Vor der Zellbeschichtung die Lamininlösung entfernen und zweimal mit einem einfachen neurobasalen Medium waschen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Abdeckungen zu keinem Zeitpunkt trocknen.
7. Fügen Sie 300 l des kompletten Mediums hinzu und lassen Sie sie in einem Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 bis zur Beschichtungszeit. Entfernen Sie dieses Medium vor dem Beschichten von Zellen.

4. Kultur der Ziliarganglien aus Hühnerembryon (Embryonaltag 7)

1. Dissektion von Ziliarganglien (CG)
   1. Eier aus dem Brutkasten entfernen und mit 75% Ethanol besprühen.
      HINWEIS: Eier werden bei 16 °C gelagert, bevor sie 7 Tage lang bei 37,7 °C inkubiert werden (oder das gewünschte embryonale Stadium). Die hier verwendeten Eier stammen von Rosshühnerarten.
   2. Schneiden Sie die Oberseite des Eis mit einer Schere und nehmen Sie den Embryo mit einem Löffel. Legen Sie den Embryo in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS und trennen Sie den Kopf vom Körper, indem Sie sie im Nackenbereich schneiden.
      HINWEIS: Sobald der Embryo aus dem Ei entfernt wird, kann er Proteasen produzieren, die für den Zelltod verantwortlich sind. Es ist wichtig, den Kopf schnell vom Körper zu trennen, sobald sich der Embryo außerhalb der Schale befindet, um den Zelltod zu minimieren.
   3. Halten Sie den Kopf des Embryos in eiskaltem HBSS.
   4. Halten Sie den Embryokopf hoch und fixieren Sie ihn im Schnabel des Kükens mit der Nr. 5 Zange. Dann mit nicht 55 Zangen, beginnen, die dünne Schicht der Haut um das Auge zu entfernen.
   5. Entfernen Sie das Auge vorsichtig und drehen Sie es, um auf das hintere Teil zuzugreifen. Während Sie das Auge vom Kopf des Kükens trennen, bemerken Sie, dass der Sehnerv geschnitten wird. Dies wird helfen, das Zilienganglion zu lokalisieren.
   6. Sobald das Auge getrennt ist, halten Sie es mit der hinteren Seite nach oben und bemerken Sie das Ziliarganglion neben dem geschnittenen Sehnerv und der Aderhautspalte. Der präganglionische Nerv könnte noch an dem Ziliarganglion befestigt werden, was seine Identifizierung erleichtert.
   7. Sezieren Sie das Ziliarganglion von jedem Auge und reinigen Sie sehr gut, indem Sie das überschüssige Gewebe um jedes Ganglion entfernen.
      ANMERKUNG: Um eine Ausbeute von 1x10⁶ Zellen/ml zu haben, sezieren Sie 70 CGs. Bitte beachten Sie, dass die erhaltene Zellpopulation auch nicht-neuronale Zellen enthält. Um die Anzahl der nicht-neuronalen Zellen zu verringern und folglich die Reinheit der neuronalen Population zu erhöhen, ist es sehr wichtig, die Ziliarganglien so weit wie möglich zu reinigen und dabei das gesamte überschüssige Gewebe zu entfernen.
2. Dissoziation und Kultur der Ziliarganglien
   1. Sammeln Sie alle Zilienganglien in einem 15 ml Rohr mit einer sterilen Kunststoff Pasteur Pipette.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Pasteur Pipette vorzubefeuchten, um die Befestigung der Ganglien an der Wand der Pipette zu minimieren.
   2. Zentrifugieren Sie die Ziliarganglien für 2 Minuten bei 200 x g.
   3. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte HBSS-Medium mit einer Pasteur-Pipette und anschließend einer P1000-Mikropipette. 1 ml 0,1% Trypsinlösung hinzufügen und 20 Minuten bei 37 °C in einem Wasserbad ohne Rührung inkubieren.
   4. Zentrifuge für 2 Minuten bei 200 x g.
   5. Entfernen Sie sofort die Trypsin-Lösung und fügen Sie 1 ml unvollständiges Mediumhinzu.
      HINWEIS: Unvollständiges Medium enthält Serum, das sofort die Wirkung von Trypsin stoppt.
   6. Zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 200 x g und entfernen Sie alle Medien.
   7. Fügen Sie 350-500 l des kompletten Mediumshinzu.
      HINWEIS: Das notwendige Volumen, um Zellen zu dissoziieren, hängt von der Anzahl der erhaltenen Ziliarganglien und damit von der erhaltenen Pelletgröße ab. Für 70 CG wird empfohlen, 500 L Medium zu verwenden.
   8. Dissoziieren Sie CGs, indem Sie zuerst 10-15x nach oben und unten pfeifen, gefolgt von 10-15x mit einer feuerpolierten Pasteurpipettenrohrette aus Glas. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, um den Zellverlust zu minimieren.
      HINWEIS: Halten Sie die zelluläre Suspension auf Eis bis zur Beschichtung.
   9. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einer Trypan-Blaulösung und einer Standard-Neubauer-Kammer.
   10. Platte 1 x 10⁴ Zellen/ml in jeder Bohrung der 24-Well-Platte durch Verdünnung des entsprechenden Volumens der Zellsuspension in 500 l komplettem Medium (ergänzt durch 10 'M 5'-FDU).
   11. Inkubieren Sie Zellen in einem 37₂ °C, 5% CO2-Inkubator.

5. Immunzytochemie und Bildanalyse von Ziliarneuronen

1. Führen Sie den in diesem Beitrag vorgestellten Immunzytochemie-Test wie zuvor beschrieben^16,17durch.
2. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Maus monoklonales b-III Tubulin (1:1000, T8578), Huhn monoklonales Neurofilament M (1:1000, AB5735), Maus monoklonal SV2 (1:1000, AB2315387).
3. Als sekundäre Antikörper verwenden Sie Alexa Fluor 568-konjugierte Ziegenanti-Maus-Antikörper (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-konjugierte Ziege Anti-Hühner-Antikörper (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-konjugierte Ziege Anti-Maus-Antikörper (1:1000, A21235).
4. Bedecken mit Montagemedium mit DAPI, für die Kernfärbung (P36935).

Ergebnisse

Die geschätzte Dauer dieses Verfahrens hängt stark von der Ausbeute ab, die für jedes spezifische Experiment benötigt wird, und damit von der Anzahl der Ziliarganglien, die isoliert werden müssen. Bei einem geschätzten Ertrag von 1 x 10⁶ Zellen/ml isolieren Sie etwa 70 Ziliarganglien (35 Eier). Für diese Anzahl von Ganglien, dauert es 2-3 Stunden für die Sezierverfahren und insgesamt 4-5 Stunden für das gesamte Verfahren. Eine schritt für Schritt Darstellung des Isolationsprotokolls ist

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie man CG-Neuronen vorbereitet und kultiviert. Die Identifizierung und Zerlegung des Ziliarganglien kann für unerfahrene Anwender schwierig sein. Daher präsentieren wir ein detailliertes und schrittweises Verfahren, um E7-Küken-Ziliarganglien effizient zu sezieren, das Gewebe zu dissoziieren und neuronale Kulturen vorzubereiten, die mindestens 15 Tage lang aufrechterhalten werden können. Die mit diesem Protokoll erhaltenen Ziliarganglienneuronen eignen sich auch für die Co-Kul...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018