АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы. Нейронные культуры цыпленка CG нейронов было показано, что эффективные модели клеток в изучении взаимодействия мышц нерва. Мы описываем подробный протокол для вскрытия, диссоциации и культуры in vitro нейронов CG от эмбрионов птенцов.

Аннотация

Чик цилиарной ганглии (CG) являются частью парасимпатической нервной системы и отвечают за иннервацию мышечных тканей, присутствующих в глазу. Этот ганглия состоит из однородной популяции цилиарных и хороидальных нейронов, которые иннервировать полосатые и гладкие мышечные волокна, соответственно. Каждый из этих нейронных типов регулирует определенные структуры глаз и функции. На протяжении многих лет, нейронные культуры цыпленка цилиарных ганглиев было показано, чтобы быть эффективными моделями клеток в изучении мышечно-нервной системы взаимодействий, которые общаются через холинергические синапсы. Ciliary ганглия нейроны, в большинстве, холинергические. Эта модель клеток была показана, чтобы быть полезным сравнительно ранее использовались неоднородные модели клеток, которые состоят из нескольких типов нейронов, кроме холинергических. Анатомически, цилиарный ганглия локализована между зрительным нервом (ON) и трещиной хороида (CF). Здесь мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбрионов птенцов. Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур нейронов CG, подчеркивая ключевые этапы процесса. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке в течение 15 дней, и, таким образом, мы показываем нормальное развитие cg культур. Результаты также показывают, что эти нейроны могут взаимодействовать с мышечными волокнами через нейро-мышечные холинергические синапсы.

Введение

Цилиаровые ганглия (CG) нейроны принадлежат к парасимпатической нервной системы. Эти нейроны холинергические, будучи в состоянии установить muscarinic или никотиновых синапсов1,2,3. Анатомически, CG расположен в задней части глаза между зрительным нервом (ON) и трещины сосудистой системы (CF) и состоит из около 6000 нейронов в ранних эмбриональных стадиях1,4. В течение первой недели в культуре, цилиарные ганглия нейроны представляют многополярную морфологию. Через неделю они начинают переходить в однополярное состояние, при этом один неврит расширяется и образует аксон5. Кроме того, примерно половина нейронов CG умирают между8-м и 14-м днем развития эмбриона цыпленка, через запрограммированный процесс клеточной смерти.th Это снижение числа нейронов приводит к общей популяции цилиарного ганглия около 3000 нейронов6,7,8. В пробирке, нет сокращения числа нейронов CG, когда выросли с мышечными клетками9 и CG нейроны могут быть культивируется в течение нескольких недель1,9.

Цилиарный ганглия состоит из однородной популяции цилиарных нейронов и хороидальных нейронов, каждый из которых представляет половину популяции нейронов в CG, иннервируя мышцы глаза. Эти два типа нейронов структурно, анатомически и функционально отличаются. Ciliary нейроны innervate полосатые мышечные волокна на радужной оболочке глаза и хрусталика, будучи ответственным за сокращение зрачка. Хороидальные нейроны иннервировать гладкую мышцу сосудистой1,10,11,12.

Культуры куриных цилиарных ганглия нейронов было показано, что полезные инструменты для изучения нервно-мышечных синапсов и формирования синапса1,5,9. Учитывая, что нервно-мышечные синапсы являются холинергические13, используя нейронной популяции, которая холинергический - CG нейронов - возникла в качестве потенциальной альтернативы предыдущим моделям клеток14. Эти модели состояли из неоднородной нейронной популяции, в которой лишь небольшая часть является холинергической. Кроме того, цилиарные ганглия нейроны развиваются относительно быстро in vitro, и примерно через 15 часов уже образуют синапсы1. CG нейроны были использованы в качестве модели системы на протяжении многих лет для различных исследований, из-за его относительно легкости изоляции и манипуляции. Эти приложения включают в себя оптогенетические исследования, развитие синапса, апоптоз и нервно-мышечные взаимодействия14,,15.

Мы описываем подробную процедуру вскрытия, диссоциации и культуры in vitro цилиарных ганглиев нейронов из эмбриональных эмбрионов 7 дня (Е7). Мы предоставляем пошаговый протокол для получения высоко чистых и стабильных клеточных культур холинергических нейронов. Мы также выделяем ключевые шаги протокола, которые требуют особого внимания и которые улучшат качество нейронных культур. Эти культуры могут поддерживаться в пробирке, по крайней мере 15 дней.

протокол

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этой процедуры являются следующие: щипцы (no 5 и Noo 55), хирургические пинцет, рассечение Петри блюда (черное дно), 24-хорошо пластины, пластиковые пастерская пипетки, огонь полированного стекла Пастер пипетки, 10 мл шприц, 0,22 мкм шприц фильтр.

  1. Подготовка и стерилизация всех материалов, необходимых для протокола, включая стекло крышки, щипцы (No 5 и No 55), хирургические пинцет, Петри блюда (черное дно), дистиллированной H2O, пипетки и материал для хирургии.
  2. Приготовьте раствор 0,1 мг/мЛ Poly-D-Lysine (PDL).
    1. Восстановление PDL в буфере 0,1 М бората (рН 8.2) к концентрации 1 мг/мл (10x раствор).
    2. Разбавить 1:10 в буфере 166,6 мМ бората (рН 8,2) для получения конечной концентрации 0,1 мг/мл.
  3. Приготовьте 10 мкг/мл ламинин раствора.
    1. Разбавить 1 мг/мл ламинина в простой нейробазальной среде до конечной концентрации 10 мкг/мл.
  4. Подготовка сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS): 5.36 mM KCl, 0,44 мМХК 2PO4, 137 мМ NaCl, 4,16 мМ NaHCO3, 0,34 мМ На2HPO42H2O, 5 мМ глюкозы, 1 мМ натрия пируват, 10 мМ HEPES буфер, 0,001% фенол красный. Отрегулируйте рН до 7.2.
  5. Подготовьте 0,1% трипсин решение.
    1. Растворите 5 мг трипсина 1:250 порошок в 5 мл HBSS для окончательной концентрации 0,1%.
    2. Поместите в роликовый миксер при 4 градусах Цельсия до полного растворения.
    3. Фильтр с помощью шприца 10 мл и фильтра шприца 0,22 м.
  6. Подготовка цилиарной ганглии неполной среды:нейробазальной среды без глутамина, 1X B27 (фото-чувствительной), 10% тепло-инактивированной сыворотки лошади, 2% теплоинактивированных FBS, 12,5 U /mL пенициллин / стрептомицин (0,25x) и 2 мМ глутамин. Используйте стерильные реагенты и подготовьте среду в стерильных условиях.
  7. Подготовка цилиарной ганглии полной среды (дополненной факторами роста): к неполной среде, добавьте 5 нг/мЛ GDNF и 5 нг/mL CNTF.

2. Приготовление стеклянных крышков для 24-х пластин

  1. Поместите нужное количество стеклянных крышков внутри кислотоустойчивого контейнера и добавьте 65% азотной кислоты до тех пор, пока все крышки не будут погружены в воду. Поместите контейнер в орбитальный шейкер и инкубировать на ночь при комнатной температуре (RT) со скоростью 1000 об/мин.
  2. На следующий день тщательно перенесите азотную кислоту в небольшой резервуар и храните для дальнейшего использования. Азотная кислота может быть повторно использована 2-3x.
  3. Аккуратно добавьте дистиллированный H2O в крышки, чтобы удалить оставшуюся азотную кислоту. Место в агитации в течение 30 минут, отбросить стиральный раствор и повторить это 5x.
  4. Промыть крышки с 75% этанола в два раза.
  5. Тщательно отделить и поместить отдельные крышки в металлическую стойку, покрытую алюминиевой фольгой и инкубировать при 50 oC в течение 10-15 минут или до тех пор, пока полностью высохнет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не автоклав стекла coverslips, как они будут придерживаться друг к другу.
  6. Стерилизовать крышки под ультрафиолетовым светом в течение 10-15 минут. Поддерживать крышки стерильными для культуры нейронных тканей.

3. Покрытие стеклянных крышков для 24-ну пластин

  1. Используя стерильный пинцет, поместите один покрывало в каждый колодец 24-хорошо пластины.
  2. Добавьте 500 мл 0,1 мг/мл PDL и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
  3. На следующий день, промыть крышки дважды с стерильной дистиллированной H2O. Затем добавьте 500 мл дистиллированной воды в каждый налокотый листок и оставьте на 30 минут при комнатной температуре.
  4. Отбросьте воду и добавьте 350 мл 10 мкг/мл ламинин раствора в каждом колодце.
  5. Поместите в инкубатор с 37 градусами по Цельсию на 2 ч.
  6. Перед клеточным покрытием, удалить раствор ламинина и промыть дважды с простой нейробасальной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы крышки не высыхали в любое время.
  7. Добавьте 300 мл полной среды и оставьте в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 до времени покрытия. Перед покрытием клеток, удалить эту среду.

4. Культура цилиарных ганглиев из куриного эмбриона (эмбриональный день 7)

  1. Вскрытие цилиарных ганглиев (CG)
    1. Удалить яйца из инкубатора и распылить их с 75% этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца хранятся при 16 градусах Цельсия перед инкубацией при 37,7 градусов по Цельсию в течение 7 дней (или желаемой эмбриональной стадии). Яйца, используемые здесь, относятся к видам курицы Росса.
    2. Вырезать верхнюю часть яйца с ножницами и вынуть эмбрион с помощью ложки. Поместите эмбрион в чашку Петри с ледяной HBSS и отделить голову от тела путем резки в области шеи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только эмбрион удаляется из яйцеклетки, он может производить протеазы, которые отвечают за гибель клеток. Важно быстро отделить голову от тела, как только эмбрион находится за пределами оболочки, чтобы свести к минимуму гибель клеток.
    3. Держите голову эмбриона в ледяной HBSS.
    4. Держите эмбрион голову вверх и исправить его в клюве цыпленка с no 5 щипцами. Затем с No 55 щипцами, начать удалять тонкий слой кожи вокруг глаза.
    5. Аккуратно удалите глаз и поверните его, чтобы получить доступ к задней части. Отделяя глаз от головы птенца, обратите внимание на оптический нерв, сеченный. Это поможет локализовать цилиарный ганглия.
    6. Как только глаз отделен, держать его с задней стороной вверх и обратите внимание на цилиарный ганглия, прилегающая к секционированному зрительному нерву и трещине сосудистой системы. Предганглионный нерв все еще может быть прикреплен к цилиарный ганглия, что облегчает его идентификацию.
    7. Вскрыть цилиарный ганглия от каждого глаза и очистить очень хорошо, удалив избыток ткани вокруг каждого ганглия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы иметь выход в размере 1x106 ячеек/мЛ, вскрыть 70 КГ. Обратите внимание, что полученная популяция клеток содержит негенные клетки. Чтобы уменьшить количество ненегенальных клеток и, как следствие, повысить чистоту нейрональной популяции, очень важно максимально очистить цилиарные ганглии, удалив все лишнее ткани.
  2. Диссоциация и культура цилиарной ганглии
    1. Соберите все цилиарные ганглии в трубку 15 мЛ с помощью стерильной пластиковой пастерской пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предварительно промокнуть пастер пипетки, чтобы свести к минимуму крепление ганглиев к стене пипетки.
    2. Центрифуга цилиарных ганглиев в течение 2 минут при 200 х г.
    3. Осторожно, удалите все средства HBSS с помощью пастер-пипетки, а затем микропиетты P1000. Добавьте 1 мл 0,1% раствора трипсина и инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах на водяной бане, без волнения.
    4. Центрифуга в течение 2 минут при 200 х г.
    5. Немедленно снимите раствор трипсина и добавьте 1 мл неполной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполная среда содержит сыворотку, которая немедленно остановит эффект трипсина.
    6. Центрифуга в течение 2 минут при 200 х г и удалить все средние.
    7. Добавьте 350-500 мл полной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимый объем для разъединить клетки зависит от количества полученных килианых ганглиев и, таким образом, от полученного размера гранул. Для 70 CG рекомендуется использовать 500 мл среднего.
    8. Разъединяют CG путем pipetting вверх и вниз 10-15x сперва используя P1000 последовав за 10-15x используя fire-polished стекло Пастер pipette. Избегайте образования пузырьков воздуха, чтобы свести к минимуму потерю клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите сотовую подвеску на льду до покрытия.
    9. Определите плотность сотовой связи с помощью синего раствора Трипан и стандартной камеры Neubauer.
    10. Плита 1 х 104 клетки/мл в каждом колодце 24-хорошо пластины путем разбавления соответствующего объема клеточной суспензии в 500 мл полной среды (дополнено 10 м 5'-FDU).
    11. Инкубировать клетки в 37 кк, 5% CO2 инкубатора.

5. Иммуноцитохимия и анализ изображений цилиарных нейронов

  1. Выполните иммуноцитохимию анализа, представленного в этой работе, как описано ранее16,17.
  2. Используйте следующие первичные антитела: моноклональный б-III тубулин мыши (1:1000, T8578), куриный моноклональный нейрофиламент М (1:1000, AB5735), мышиный моноклональный SV2 (1:10000, AB2315387).
  3. В качестве вторичных антител, использовать Alexa Fluor 568-конъюгированных коза анти-мышки антитела (1:10000, A11031), Alexa Fluor 568-конъюгированных козы анти-куриные антитела (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-конъюгъюратный коза анти-мышелов антитела (1:1000, A22135).
  4. Гора крышки с использованием монтажа среды с DAPI, для ядерного окрашивания (P36935).

Результаты

Расчетная продолжительность этой процедуры в строгом времени зависит от урожайности, необходимой для каждого конкретного эксперимента, и, таким образом, от количества цилиарных ганглиев, которые необходимо изолировать. Для предполагаемого выхода 1 х 106 клеток/мЛ, изолировать око...

Обсуждение

В этом протоколе мы продемонстрировали, как подготовить и культуры CG нейронов. Идентификация и вскрытие цилиарского ганглия может быть затруднено для неопытных пользователей. Поэтому мы представляем детальную и пошаговую процедуру, чтобы эффективно вскрыть е7 цыпленка цилиарной ганг...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Европейским фондом регионального развития (ERDF) в рамках Региональной оперативной программы Centro 2020 в рамках проектов CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO20 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, и через COMPETE 2020 - Оперативная программа по конкурентоспособности и интернационализации и португальских национальных фондов через FCT - Фонд пара Ci'ncia электронной Текнологии, I.P., в рамках проектов UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, а также индивидуальные гранты SFRH/BD/141092/101092/104100/2008, а также индивидуальные гранты SFRH/BD/141092/1 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) и Мари Кюри Действия - IRG, 7-я Рамочная программа.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)Merck (Sigma Aldrich)F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibodyThermo Fisher ScientificA11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibodyThermo Fisher ScientificA11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibodyThermo Fisher ScientificA21235
B27 supplement (50x), serum freeInvitrogen (Gibco)17504-044
Chicken monoclonal neurofilament MMerck (Sigma Aldrich)AB5735
D-(+)-Glucose monohydrateVWR24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, BrazilInvitrogen (Gibco)10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biologyFisher Scientific10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originInvitrogen (Gibco)26050-070
L-Glutamine (200 mM)Invitrogen (Gibco)25030-081
Mouse laminin ICultrex (R&D systems)3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulinMerck (Sigma Aldrich)T8578
Mouse monoclonal SV2DSHBAB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)Thermo Fisher Scientific11874235
Neurobasal medium without glutamineInvitrogen (Gibco)21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)Invitrogen (Gibco)15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell cultureMerck (Sigma Aldrich)P3532
Poly-D-LysineMerck (Sigma Aldrich)P7886
Potassium chlorideFluka (Honeywell Reaarch Chemicals)31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACSPanreac Applichem131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPIInvitrogen (Gibco)P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pkFisher Scientific10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Peprotech450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)Peprotech450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISOPanreac Applichem131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma gradePanreac Applichem141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)Thermo Fisher11360039
Syringe without needle, 10 mLThermo Fisher11587292
Trypsin 1:250 powderInvitrogen (Gibco)27250-018

Ссылки

  1. Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
  2. Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
  3. Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
  4. Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
  5. Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
  6. Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
  7. Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
  8. Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
  9. Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
  10. Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
  11. Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
  12. Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
  13. Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
  14. Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
  15. Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
  16. Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
  17. Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
  18. Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
  19. Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
  20. Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
  21. Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
  22. Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
  23. Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
  24. Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
  25. Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
  26. Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
  27. Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены