Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Résumé

Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique. Les cultures neuronales des neurones de CG de poussin ont été montrées pour être des modèles de cellules efficaces dans l’étude des interactions de muscle nerveux. Nous décrivons un protocole détaillé pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones de CG des embryons de poussin.

Résumé

Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique et sont responsables de l’innervation des tissus musculaires présents dans l’oeil. Ce ganglion est constitué par une population homogène de neurones ciliaires et choroïdes qui innervate les fibres musculaires striées et lisses, respectivement. Chacun de ces types neuronaux régule des structures et des fonctions oculaires spécifiques. Au fil des ans, les cultures neuronales des ganglions ciliaires poussins se sont avérées être des modèles cellulaires efficaces dans l’étude des interactions muscle-nerveux du système, qui communiquent par synapses cholinergiques. Les neurones de ganglion ciliaire sont, dans sa majorité, cholinergiques. Ce modèle cellulaire s’est avéré utile comparativement aux modèles de cellules hétérogènes précédemment utilisés qui comprennent plusieurs types neuronaux, outre cholinergique. Anatomiquement, le ganglion ciliaire est localisé entre le nerf optique (ON) et la fissure choroïde (CF). Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones ganglionnaires ciliaires des embryons de poussin. Nous fournissons un protocole étape par étape afin d’obtenir des cultures cellulaires très pures et stables de neurones CG, mettant en évidence les étapes clés du processus. Ces cultures peuvent être maintenues in vitro pendant 15 jours et, par la présente, nous montrons le développement normal des cultures cg. Les résultats montrent également que ces neurones peuvent interagir avec les fibres musculaires par le biais de synapses cholinergiques neuro-musculaires.

Introduction

Les neurones du ganglion ciliaire (CG) appartiennent au système nerveux parasympathique. Ces neurones sont cholinergiques, étant en mesure d’établir des synapses muscariniques ou nicotiniques^1,2,3. Anatomiquement, le CG est situé dans la partie postérieure de l’œil entre le nerf optique (ON) et la fissure choroïde (CF) et se compose d’environ 6000 neurones dans les premiers stades embryonnaires^1,4. Pour la première semaine en culture, les neurones ganglionnaires ciliaires présentent une morphologie multipolaire. Après une semaine, ils commencent à la transition vers un état unipolaire, avec une neurite s’étendant et formant l’axon⁵. En outre, environ la moitié des neurones cg meurent entre le^{8 e} et le^14ème jour du développement de l’embryon de poussin, par un processus programmé de la mort cellulaire. Cette diminution du nombre de neurones se traduit par une population totale du ganglion ciliaire d’environ 3000 neurones^6,7,8. In vitro, il n’y a pas de réduction du nombre de neurones CG lorsqu’ils sont cultivés avec les cellules musculaires⁹ et les neurones CG peuvent être cultivés pendant plusieurs semaines^1,9.

Le ganglion ciliaire se compose d’une population homogène de neurones ciliaires et de neurones choroïdes, représentant chacun la moitié de la population neuronale dans le CG, instériorisant le muscle de l’œil. Ces deux types de neurones sont structurellement, anatomiquement et fonctionnellement distincts. Les neurones ciliaires innervotent les fibres musculaires striées sur l’iris et la lentille, étant responsables de la contraction de la pupille. Les neurones choroïdes innervate le muscle lisse de la choroïde^1,10,11,12.

Les cultures des neurones ganglionnaires ciliaires de poulet se sont avérées des outils utiles pour l’étude des synapses neuromusculaires et de la formation de synapse^1,5,9. Considérant que les synapses neuromusculaires sont cholinergiques¹³, en utilisant une population neuronale qui est cholinergique - neurones CG - émergé comme une alternative potentielle aux modèles cellulaires précédents¹⁴. Ces modèles se composaient d’une population neuronale hétérogène, dans laquelle seule une petite partie est cholinergique. Alternativement, les neurones de ganglion ciliaire se développent relativement rapidement invitro, et après environ 15 heures forment déjà des synapses¹. Les neurones cg ont été utilisés comme système modèle au fil des ans pour des études de recherche distinctes, en raison de sa facilité relative d’isolement et de manipulation. Ces applications comprennent les études optogénétiques, le développement de la synapse, l’apoptose et les interactions neuromusculaires^14,15.

Nous décrivons une procédure détaillée pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones ganglionnaires ciliaires des embryons de poussins du jour embryonnaire 7 (E7). Nous fournissons un protocole étape par étape afin d’obtenir des cultures cellulaires très pures et stables de neurones cholinergiques. Nous soulignons également les étapes clés du protocole qui nécessitent une attention particulière et qui amélioreront la qualité des cultures neuronales. Ces cultures peuvent être maintenues in vitro pendant au moins 15 jours.

Protocole

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Les matériaux nécessaires à cette intervention sont les suivants : forceps (nº 5 et nº 55), pinces à épiler chirurgicales, dissection petri (fond noir), plaques de 24 puits, pipette Pasteur en plastique, pipette Pasteur en verre poli par le feu, seringue de 10 mL, filtre à seringues 0,22 μm.

1. Préparer et stériliser tout le matériel nécessaire au protocole, y compris les couvercles en verre, les forceps (nº 5 et nº 55), les pinces chirurgicales, les boîtes de Pétri (fond noir), les h₂O distillés, les pipettes et le matériel pour la chirurgie.
2. Préparer une solution poly-D-Lysine (PDL) de 0,1 mg/mL.
   1. Reconstituer le PDL en tampon de borate de 0,1 M (pH 8,2) à une concentration de 1 mg/mL (solution 10x).
   2. Diluer 1:10 dans 166,6 mM tampon de borate (pH 8.2) pour obtenir une concentration finale de 0,1 mg/mL.
3. Préparer une solution de laminine de 10 μg/mL.
   1. Diluer 1 mg/mL laminine dans le milieu neurobasal plaine à une concentration finale de 10 μg/mL.
4. Préparer la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) : 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 5 mM de glucose, 1 mM de pyruvé de sodium, tampon 10 mM HEMES, 0,001% phénol rouge. Ajuster le pH à 7,2.
5. Préparer une solution trypsin de 0,1 %.
   1. Dissoudre 5 mg de trypsin 1:250 poudre dans 5 mL de HBSS pour une concentration finale de 0,1%.
   2. Placer dans un mélangeur à rouleaux à 4 °C jusqu’à dissolution complète.
   3. Filtrer à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre à seringues de 0,22 μm.
6. Préparer des ganglions ciliaires incomplets :moyen neurobasal sans glutamine, 1X B27 (photosensible), 10% sérum de cheval inactivé thermiquement, 2% FBS inactivé thermiquement, 12,5 Pélicilline/streptomycine U/mL (0,25x) et 2 mM glutamine. Utilisez des réactifs stériles et préparez le milieu dans des conditions stériles.
7. Préparer les ganglions ciliaires moyens complets (complétés par des facteurs de croissance) : au milieu incomplet, ajouter 5 ng/mL GDNF et 5 ng/mL CNTF.

2. Préparation de couvercles en verre pour les plaques de 24 puits

1. Placez le nombre désiré de couvercles en verre à l’intérieur d’un contenant résistant à l’acide et ajoutez 65 % d’acide nitrique jusqu’à ce que tous les couvercles soient submergés. Placer le récipient dans un shaker orbital et incuber toute la nuit à température ambiante (RT) à une vitesse de 1000 tr/min.
2. Le lendemain, transférer soigneusement l’acide nitrique dans un petit réservoir et les stocker pour une utilisation ultérieure. L’acide nitrique peut être réutilisé 2-3x.
3. Ajouter soigneusement le H₂O distillé aux couvercles pour enlever le reste de l’acide nitrique. Placer dans l’agitation pendant 30 minutes, jeter la solution de lavage et répéter ce 5x.
4. Rincer les couvercles avec 75% d’éthanol deux fois.
5. Séparer soigneusement et placer les couvercles individuels dans un support métallique recouvert de papier d’aluminium et incuber à 50 ºC pendant 10-15 minutes ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs.
   REMARQUE : Ne pas autoclaver les couvercles en verre car ils colleront les uns aux autres.
6. Stériliser les couvercles sous la lumière UV pendant 10-15 minutes. Maintenir les couvercles stériles pour la culture des tissus neuronaux.

3. Revêtement de couvercles en verre pour plaques de 24 puits

1. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placer un couvercle dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.
2. Ajouter 500 μL de 0,1 mg/mL PDL et incuber toute la nuit à 37 °C.
3. Le lendemain, rincer les couvercles deux fois à l’égard du H₂O distillé stérile. Ensuite, ajouter 500 μL d’eau distillée à chaque couvercle et laisser reposer 30 minutes à température ambiante.
4. Jeter l’eau et ajouter 350 μL de 10 μg/mL de laminine dans chaque puits.
5. Placer dans un incubateur de 37 °C pendant 2 h.
6. Avant le placage cellulaire, retirer la solution de laminine et laver deux fois à l’eau avec un milieu neurobasal plat.
   REMARQUE : Il est important que les couvercles ne sèchent pas à tout moment.
7. Ajouter 300 μL de milieu complet et laisser dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’au moment du placage. Avant de plaquer les cellules, retirez ce milieu.

4. Culture des ganglions ciliaires de l’embryon de poulet (jour embryonnaire 7)

1. Dissection des ganglions ciliaires (CG)
   1. Retirer les œufs de l’incubateur et les pulvériser avec 75% d’éthanol.
      REMARQUE : Les œufs sont stockés à ~16 °C avant d’être incubés à 37,7 °C pendant 7 jours (ou le stade embryonnaire souhaité). Les œufs utilisés ici proviennent d’espèces de poulets Ross.
   2. Couper le dessus de l’œuf à l’aide d’un ciseaux et retirer l’embryon à l’aide d’une cuillère. Placez l’embryon dans une boîte de Pétri avec le HBSS glacé et séparez la tête du corps en coupant dans la région du cou.
      REMARQUE : Dès que l’embryon est retiré de l’ovule, il peut produire des protéases responsables de la mort cellulaire. Il est important de séparer rapidement la tête du corps une fois que l’embryon est à l’extérieur de la coquille pour minimiser la mort cellulaire.
   3. Gardez la tête de l’embryon dans le HBSS glacé.
   4. Maintenez la tête de l’embryon vers le haut et fixez-la dans le bec du poussin avec nº 5 forceps. Ensuite, avec nº 55 forceps, commencer à enlever la fine couche de peau autour de l’œil.
   5. Retirez soigneusement l’œil et faites-le pivoter pour accéder à la partie postérieure. Tout en séparant l’œil de la tête du poussin, remarquez le nerf optique étant sectionné. Cela aidera à localiser le ganglion ciliaire.
   6. Une fois que l’œil est séparé, gardez-le avec le côté postérieur vers le haut et remarquez le ganglion ciliaire adjacent au nerf optique sectionné et à la fissure choroïde. Le nerf préganglionique pourrait encore être attaché au ganglion ciliaire, qui facilite son identification.
   7. Disséquer le ganglion ciliaire de chaque œil et nettoyer très bien en enlevant l’excès de tissu autour de chaque ganglion.
      REMARQUE : Pour avoir un rendement de ~1x10⁶ cellules/mL, disséquez ~70 DG. Veuillez noter que la population cellulaire obtenue contient également des cellules non neuronales. Pour diminuer le nombre de cellules non neuronales et, par conséquent, augmenter la pureté de la population neuronale, il est très important de nettoyer les ganglions ciliaires autant que possible, en enlevant tous les tissus excédentaires.
2. Dissociation et culture des ganglions ciliaires
   1. Recueillir tous les ganglions ciliaires à un tube de 15 mL à l’aide d’une pipette pasteur en plastique stérile.
      REMARQUE : Il est important de pré-mouiller la pipette Pasteur pour minimiser l’attachement des ganglions au mur de la pipette.
   2. Centrifuger les ganglions ciliaires pendant 2 minutes à 200 x g.
   3. Soigneusement, retirez tout le support HBSS à l’aide d’une pipette Pasteur, puis d’une micropipette P1000. Ajouter 1 mL de 0,1% de solution de trypsin et incuber pendant 20 minutes à 37 °C dans un bain d’eau, sans agitation.
   4. Centrifugeuse pendant 2 minutes à 200 x g.
   5. Retirez immédiatement la solution trypsin et ajoutez 1 mL de support incomplet.
      REMARQUE : Le milieu incomplet contient du sérum qui arrêtera immédiatement l’effet de la trypsie.
   6. Centrifuge pendant 2 minutes à 200 x g et retirez tous les milieux.
   7. Ajouter 350-500 μL de milieu complet.
      REMARQUE : Le volume nécessaire pour dissocier les cellules dépend du nombre de ganglions ciliaires obtenus et, par conséquent, de la taille des granulés obtenus. Pour ~70 CG, il est recommandé d’utiliser 500 μL de milieu.
   8. Dissociez les CG en faisant des pipes de haut en bas 10-15x d’abord à l’aide d’un P1000 suivi de 10-15x à l’aide d’une pipette Pasteur en verre poli par le feu. Évitez la formation de bulles d’air pour minimiser la perte de cellules.
      REMARQUE : Gardez la suspension cellulaire sur la glace jusqu’au placage.
   9. Déterminer la densité cellulaire à l’aide d’une solution bleu Trypan et d’une chambre neutre standard.
   10. Plaque 1 x 10⁴ cellules/mL dans chaque puits de la plaque de 24 puits en diluant le volume approprié de suspension cellulaire dans 500 μL de milieu complet (complété par 10 μM 5'-FDU).
   11. Incuber les cellules dans un incubateur de CO₂ à 37 °C et 5 %.

5. Immunocytochimie et analyse d’image des neurones ciliaires

1. Effectuer l’essai d’immunocytochimie présenté dans cet article tel que décrit précédemment^16,17.
2. Utilisez les anticorps primaires suivants : souris monoclonale b-III tubuline (1:1000, T8578), poulet monoclonal neurofilament M (1:1000, AB5735), souris monoclonal SV2 (1:1000, AB2315387).
3. En tant qu’anticorps secondaires, utilisez l’anticorps anti-souris de chèvre conjugué Alexa Fluor 568 (1:1000, A11031), l’anticorps anti-poulet de chèvre conjugué Alexa Fluor 568 (1:1000, A11041), l’anticorps anti-souris de chèvre alexa fluor 647-conjugué (1:1000, A21235).
4. Couvercles de montage utilisant le milieu de montage avec DAPI, pour la coloration nucléaire (P36935).

Résultats

La durée estimée de cette procédure dépend étroitement du rendement nécessaire pour chaque expérience spécifique et, par conséquent, du nombre de ganglions ciliaires qui doivent être isolés. Pour un rendement estimé de 1 x 10⁶ cellules/mL, isoler environ 70 ganglions ciliaires (35 œufs). Pour ce nombre de ganglions, il faudra 2-3 heures pour la procédure de dissection et un total de 4-5 heures pour la procédure totale. Une illustration étape par étape du protocole d’isolement est présentée...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré comment préparer et culturer les neurones CG. L’identification et la dissection du ganglion ciliaire peuvent être difficiles pour les utilisateurs non exexpérienced. Par conséquent, nous présentons une procédure détaillée et étape par étape pour disséquer efficacement E7 ganglions ciliaires poussin, dissocier le tissu et préparer des cultures neuronales qui peuvent être maintenues pendant au moins 15 jours. Les neurones ganglionnaires ciliaires obtenus avec ce proto...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018