Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

Resumen

Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.

Resumen

Los polluelos ciliares (CG) son parte del sistema nervioso parasimpático y son responsables de la inervación de los tejidos musculares presentes en el ojo. Este ganglio está constituido por una población homogénea de neuronas ciliares y coroidales que inergen fibras musculares estriadas y lisas, respectivamente. Cada uno de estos tipos neuronales regulan las estructuras y funciones oculares específicas. Con los años, las culturas neuronales de los polluelos ganglios ciliares se demostraron para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones del sistema músculo-nervioso, que se comunican a través de sinapsis colinérgicas. Las neuronas ganglionares ciliar son, en su mayoría, colinérgicas. Este modelo celular ha demostrado ser útil comparativamente a los modelos celulares heterogéneos utilizados anteriormente que comprenden varios tipos neuronales, además de colinérgicos. Anatómicamente, el ganglio ciliar se localiza entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF). Aquí, describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas ganglias ciliares de embriones de polluelos. Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas CG, destacando los pasos clave del proceso. Estas culturas se pueden mantener in vitro durante 15 días y, por la presente, mostramos el normal desarrollo de las culturas CG. Los resultados también muestran que estas neuronas pueden interactuar con las fibras musculares a través de sinapsis colinérgicas neuromusculares.

Introducción

Las neuronas del ganglio ciliar (CG) pertenecen al sistema nervioso parasimpático. Estas neuronas son colinérgicas, pudiendo establecer sinapsis muscarnicas o nicotínicos^1,2,3. Anatómicamente, el CG se encuentra en la parte posterior del ojo entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF) y consiste en alrededor de 6000 neuronas en las primeras etapas embrionarias^1,4. Durante la primera semana en el cultivo, las neuronas ganglionares ciliares presentan una morfología multipolar. Después de una semana, comienzan a pasar a un estado unipolar, con un neurito extendiendo y formando el axón^5. Además, aproximadamente la mitad de las neuronas CG mueren entre el^{día 8} y 14 del desarrollo del embrión del polluelo, a través de un proceso programado de muerte celular. Esta disminución en el número de neuronas resulta en una población total del ganglio ciliar de alrededor de 3000 neuronas^6,7,8. In vitro, no hay reducción en el número de neuronas CG cuando se cultiva con células musculares⁹ y las neuronas CG se pueden cultivar durante varias semanas^1,,9.

El ganglio ciliar consiste en una población homogénea de neuronas ciliares y neuronas coroideas, cada una representando la mitad de la población neuronal en el CG, inervando el músculo del ojo. Estos dos tipos de neuronas son estructural, anatómica y funcionalmente distintas. Las neuronas ciliares inerben las fibras musculares estriadas en el iris y la lente, siendo responsables de la contracción de la pupila. Las neuronas coroideas inerben el músculo liso de la coroides^1,10,11,12.

Se ha demostrado que los cultivos de neuronas ganglionares ciliares de pollo son herramientas útiles para el estudio de las sinapsis neuromusculares y la formación de sinapsis^1,5,9. Teniendo en cuenta que las sinapsis neuromusculares son colinérgicas¹³, utilizando una población neuronal que es colinérgico – CG neuronas – surgió como una alternativa potencial a los modelos celulares anteriores¹⁴. Estos modelos consistían en una población neuronal heterogénea, en la que sólo una pequeña parte es colinérgico. Alternativamente, las neuronas ganglionares ciliar se desarrollan relativamente rápido invitro, y después de aproximadamente 15 horas ya forman sinapsis¹. Las neuronas CG se han utilizado como un sistema modelo a lo largo de los años para estudios de investigación distintos, debido a su relativa facilidad de aislamiento y manipulación. Estas aplicaciones incluyen estudios optogenéticos, desarrollo de sinapsis, apoptosis e interacciones neuromusculares^14,15.

Describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas gangliares ciliares de embriones de polluelos embrionarios día 7 (E7). Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas colinérgicas. También destacamos los pasos clave del protocolo que requieren una atención especial y que mejorarán la calidad de las culturas neuronales. Estos cultivos se pueden mantener in vitro durante al menos 15 días.

Protocolo

1. Preparación de reactivos

NOTA: Los materiales necesarios para este procedimiento son los siguientes: fórceps (no 5 y no 55), pinzas quirúrgicas, disección de placas Petri (fondo negro), placas de 24 pocillos, pipeta de plástico Pasteur, pipeta Pasteur de vidrio pulido al fuego, jeringa de 10 ml, filtro de jeringa de 0,22 m.

1. Preparar y esterilizar todo el material necesario para el protocolo, incluyendo cubreobjetos de vidrio, fórceps (no 5 y no 55), pinzas quirúrgicas, platos Petri (fondo negro), H₂O destilado, pipetas y material para cirugía.
2. Preparar 0,1 mg/ml de solución de poli-D-lisina (PDL).
   1. Reconstituir PDL en tampón de borato de 0,1 M (pH 8.2) a una concentración de 1 mg/ml (10x solución).
   2. Diluir 1:10 en tampón de borato de 166,6 mM (pH 8.2) para obtener una concentración final de 0,1 mg/ml.
3. Preparar una solución de laminin de 10 g/ml.
   1. Diluir 1 mg/ml de laminin en medio neurobasal simple a una concentración final de 10 g/ml.
4. Preparar la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS): KCl de 5,36 mM, 0,44 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na₂HPO₄x_{2H 2}O, 5 mM de glucosa, 1 mM de piruvato sódico, 10 mM de tampón HEPES, 0,001% de fenol rojo. Ajuste el pH a 7.2.
5. Preparar una solución de trippsina al 0,1%.
   1. Disolver 5 mg de trippsina 1:250 polvo en 5 ml de HBSS para una concentración final de 0,1%.
   2. Colocar en una mezcladora de rodillos a 4 oC hasta que se disuelva por completo.
   3. Filtrar con una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,22 m.
6. Preparar ganglios ciliar medio incompleto:medio neurobasal sin glutamina, 1X B27 (fotosensible), 10% de suero de caballo termoactivado, 2% DE FBS inactivado por calor, 12,5 U/ml de penicilina/estreptomicina (0,25x) y 2 mM de glutamina. Utilice reactivos estériles y prepare el medio en condiciones estériles.
7. Preparar ganglios ciliar medio completo (complementado con factores de crecimiento): al medio incompleto, añadir 5 ng/mL GDNF y 5 ng/mL CNTF.

2. Preparación de cubreobjetos de vidrio para placas de 24 pozos

1. Coloque el número deseado de cubreobjetos de vidrio dentro de un recipiente resistente a los ácidos y agregue un 65% de ácido nítrico hasta que todos los cubreobjetos estén sumergidos. Coloque el recipiente en un agitador orbital e incubar durante la noche a temperatura ambiente (RT) a una velocidad de 1000 rpm.
2. Al día siguiente, transfiera cuidadosamente el ácido nítrico a un pequeño depósito y guárdelo para su uso posterior. El ácido nítrico se puede volver a utilizar 2-3x.
3. Con cuidado, agregue H₂O destilado a los cubreobjetos para eliminar el ácido nítrico restante. Colocar en agitación durante 30 minutos, desechar la solución de lavado y repetir esta 5x.
4. Enjuague los cubreobjetos con 75% de etanol dos veces.
5. Separe cuidadosamente y coloque los cubreobjetos individuales en un estante metálico cubierto con papel de aluminio e incubar a 50 oC durante 10-15 minutos o hasta que esté completamente seco.
   NOTA: No se cubran los cubreobjetos de vidrio de autoclave, ya que se pegarán entre sí.
6. Esterilice los cubreobjetos bajo la luz UV durante 10-15 minutos. Mantenga los cubreobjetos estériles para el cultivo del tejido neuronal.

3. Recubrimiento de cubreobjetos de vidrio para placas de 24 pozos

1. Usando una pinza estéril, coloque un cubreobjetos en cada pozo de una placa de 24 pozos.
2. Añadir 500 l de PDL de 0,1 mg/ml e incubar durante la noche a 37oC.
3. Al día siguiente, enjuague los cubreobjetos dos veces con H₂O destilado estéril. A continuación, agregue 500 l de agua destilada a cada cubrel y déjelo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Deseche el agua y añada 350 l de solución de laminin de 10 g/ml en cada pocópido.
5. Colocar en una incubadora de 37oC durante 2 h.
6. Antes del enchapado celular, retire la solución de laminin y lave dos veces con un medio neurobasal liso.
   NOTA: Es importante que los cubreobjetos no se sequen en ningún momento.
7. Añadir 300 l de medio completo y dejar en una incubadora a 37oC y 5% de CO₂ hasta el tiempo de enchapado. Antes de ensopar las células, retire este medio.

4. Cultivo de ganglios ciliarios a partir de embriones de pollo (día embrionario 7)

1. Disección de ganglios ciliares (CG)
   1. Retire los huevos de la incubadora y rocíelos con 75% de etanol.
      NOTA: Los huevos se almacenan a 16 oC antes de ser incubados a 37,7 oC durante 7 días (o la etapa embrionaria deseada). Los huevos utilizados aquí son de especies de pollo Ross.
   2. Cortar la parte superior del huevo con una tijera y sacar el embrión usando una cuchara. Coloque el embrión en una placa de Petri con HBSS helado y separe la cabeza del cuerpo cortando en la región del cuello.
      NOTA: Tan pronto como el embrión se retira del óvulo, puede producir proteasas que son responsables de la muerte celular. Es importante separar rápidamente la cabeza del cuerpo una vez que el embrión está fuera de la cáscara para minimizar la muerte celular.
   3. Mantenga la cabeza del embrión en el HBSS helado.
   4. Sostenga la cabeza del embrión hacia arriba y fíjela en el pico del polluelo con no 5 fórceps. Luego, con no 55 fórceps, comienza a eliminar la fina capa de piel alrededor del ojo.
   5. Retire cuidadosamente el ojo y gírelo para acceder a la parte posterior. Al separar el ojo de la cabeza del polluelo, observe que el nervio óptico está siendo seccionado. Esto ayudará a localizar el ganglio ciliar.
   6. Una vez que el ojo esté separado, manténgalo con el lado posterior hacia arriba y observe el ganglio ciliar adyacente al nervio óptico seccionado y la fisura coroides. El nervio pregangliónico todavía podría estar unido al ganglio ciliar, lo que facilita su identificación.
   7. Disecciona el ganglio ciliar de cada ojo y limpiar muy bien mediante la eliminación del exceso de tejido alrededor de cada ganglio.
      NOTA: Para tener un rendimiento de 1x10⁶ celdas/ml, disecciona 70 CG. Tenga en cuenta que la población celular obtenida también contiene células no neuronales. Para disminuir el número de células no neuronales y, en consecuencia, aumentar la pureza de la población neuronal, es muy importante limpiar los ganglios ciliar tanto como sea posible, eliminando todo el exceso de tejido.
2. Disociación y cultura de ganglios ciliares
   1. Recoger todos los ganglios ciliares a un tubo de 15 ml utilizando una pipeta pasteur de plástico estéril.
      NOTA: Es importante pre-mojar la pipeta Pasteur para minimizar la fijación de los ganglios a la pared de la pipeta.
   2. Centrifugar los ganglios ciliares durante 2 minutos a 200 x g.
   3. Con cuidado, retire todo el medio HBSS con una pipeta Pasteur y luego una micropipeta P1000. Añadir 1 ml de solución de trippsina al 0,1% e incubar durante 20 minutos a 37oC en un baño de agua, sin agitación.
   4. Centrífuga durante 2 minutos a 200 x g.
   5. Retire inmediatamente la solución de tripsina y añada 1 ml de medio incompleto.
      NOTA: El medio incompleto contiene suero que detendrá inmediatamente el efecto de la trippsina.
   6. Centrifugar durante 2 minutos a 200 x g y retire todo el medio.
   7. Añadir 350-500 l de medio completo.
      NOTA: El volumen necesario para disociar las células depende del número de ganglios ciliares obtenidos y, por lo tanto, del tamaño del pellet obtenido. Para 70 CG se recomienda utilizar 500 l de medio.
   8. Disocia los GG pipeteando arriba y abajo 10-15x primero usando un P1000 seguido de 10-15x usando una pipeta de vidrio pulido por fuego Pasteur. Evite la formación de burbujas de aire para minimizar la pérdida celular.
      NOTA: Mantenga la suspensión celular sobre hielo hasta el enchapado.
   9. Determinar la densidad celular utilizando una solución azul Trypan y una cámara Neubauer estándar.
   10. Placa 1 x 10⁴ células/ml en cada pocómo de la placa de 24 pocillos diluyendo el volumen adecuado de suspensión celular en 500 l de medio completo (complementado con 10 m 5'-FDU).
   11. Incubar células en una incubadora de 37oC, 5%_co-2.

5. Inmunocitoquímica y análisis de imágenes de neuronas ciliares

1. Realizar el ensayo de inmunocitoquímica presentado en este documento como se describió anteriormente^16,17.
2. Utilice los siguientes anticuerpos primarios: tubulina monoclonal b-III de ratón (1:1000, T8578), neurofilamento monoclonal de pollo M (1:1000, AB5735), SV2 monoclonal de ratón (1:1000, AB2315387).
3. Como anticuerpos secundarios, utilice Alexa Fluor 568-conjugado anticuerpo anti-ratón cabra (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-conjugado anticuerpo anti-pollo cabra (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-conjugado goat anti-ratón anticuerpo (1:1000, A21235).
4. Monte los cubreobjetos utilizando un medio de montaje con DAPI, para tinción nuclear (P36935).

Resultados

La duración estimada de este procedimiento depende estrechamente del rendimiento necesario para cada experimento específico y, por lo tanto, del número de ganglios ciliares que deben aislarse. Para un rendimiento estimado de 1 x 10⁶ células/ml, aísle alrededor de 70 ganglios ciliares (35 huevos). Para este número de ganglios, tomará 2-3 horas para el procedimiento de disección y un total de 4-5 horas para el procedimiento total. En la Figura 1Ase muestra una ilustración p...

Discusión

En este protocolo, demostramos cómo preparar y cultivar las neuronas CG. La identificación y disección del ganglio ciliar puede ser difícil para los usuarios sin experiencia. Por lo tanto, presentamos un procedimiento detallado y paso a paso para diseccionar eficientemente los polluelos E7, disociar el tejido y preparar cultivos neuronales que se pueden mantener durante al menos 15 días. Las neuronas ganglionares ciliar obtenidas con este protocolo también son adecuadas para el cocultivo con células musculares.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018