독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

요약

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부입니다. 병아리 CG 뉴런의 신경 배양신경 근육 상호 작용의 연구에서 효과적인 세포 모델 것으로 나타났다. 우리는 병아리 배아에서 CG 뉴런의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부이며 눈에 존재하는 근육 조직의 내면화를 담당합니다. 이 신경절은 섬모와 코로이드 뉴런의 균일 한 인구에 의해 구성되며, 내면의 무늬와 부드러운 근육 섬유는 각각. 이러한 신경 유형의 각각특정 눈 구조 와 기능을 조절. 수년에 걸쳐, 병아리 섬모 신경질의 신경 배양은 해막 시냅스를 통해 통신하는 근육 신경계 상호 작용의 연구 결과에 있는 효과적인 세포 모형으로 보였습니다. Ciliary 신경절 뉴런은, 그것의 대다수에서, 콜린성. 이러한 세포 모델은 이전에 사용되는 이질세포 모델들이 여러 신경세포를 포함하는 비교적 유용하게 사용되어 왔으며, 그 외에 는 콜린성 이외에. 해부학적으로, 섬모 신경절은 시신경(ON)과 코로이드 균열(CF) 사이에 국한된다. 여기에서, 우리는 병아리 배아에서 섬모 신경신경의 해부, 해피 및 체외 문화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 우리는 CG 뉴런의 매우 순수하고 안정적인 세포 배양을 얻기 위해 단계별 프로토콜을 제공하여 프로세스의 주요 단계를 강조합니다. 이러한 문화는 15일 동안 체외에서 유지될 수 있으며, 이를 통해 CG 문화의 정상적인 발전을 보여줍니다. 결과는 또한 이 뉴런이 신경 근육 질의 시냅스를 통해 근육 섬유와 상호 작용할 수 있음을 보여줍니다.

서문

Ciliary 신경절 (CG) 뉴런은 부교감 신경계에 속한다. 이러한 뉴런은 해골성이며, 무스카린 또는 니코틴 시냅스^1,,2,,3을설정할 수 있다. 해부학적으로, CG는 시신경(ON)과 코로이드 균열(CF) 사이의 눈의 후방 부분에 위치하며 초기 배아 단계^1,,4에서약 6000뉴런으로 구성된다. 문화의 첫 주에 대 한, 섬 모 성 신경 절개 뉴런은 다극성 형태를 제시. 일주일 후, 그들은 축 하⁵확장 하 고 형성 하는 하나의 neurite와 함께 단극성 상태로 전환 하기 시작. 또한, CG 뉴런의 약 절반은 병아리 배아 발달의^{8일과 14일} 사이에 세포 사멸의 프로그램된 과정을 통해 죽는다. 이 뉴런의 수의 감소는 약 3000 뉴런^{66, 7,7,8의}섬모 신경절의 총 인구 결과. 시험관에서는, 근육세포^9와 CG 뉴런으로 성장하면 CG 뉴런의 수가 감소하지^않으며,CG 뉴런은 몇 주 동안 배양될 수 있다^1,9.

섬광 신경절은 모분 뉴런과 치오로이드 뉴런의 균일 한 인구로 구성되어 있으며, 각각 CG에서 신경 인구의 절반을 나타내며 눈의 근육을 내면화합니다. 뉴런의 이 두 가지 유형은 구조적으로, 해부학적으로 기능적으로 구별됩니다. Ciliary 뉴런은 홍채와 렌즈에 줄무늬 근육 섬유를 내면으로 고정하여 동공 수축을 담당합니다. 코로이드 뉴런은 코로이드^{1,10,,,11,,12의}부드러운 근육을 내면으로 한다.

닭 섬모 신경절 신경절 뉴런의 배양신경신경은 신경 근육 시냅스와 시냅스 형성^1,,5,,9의연구에 유용한 도구로 표시되었습니다. 신경근육 시냅스가^13이며,해조류인 신경인구를 사용하여 CG 뉴런이 이전 세포^{모델(14)에}대한 잠재적 대안으로 떠올랐다. 이 모형은 단지 작은 부분이 해병인 이종성 신경 인구에서 이루어져 있습니다. 대안적으로, 섬모 신경절 뉴런은 시험관 내에서 상대적으로 빠르게발전하고, 약 15시간 후에 이미 시냅스^1을형성한다. CG 뉴런은 분리와 조작의 상대적으로 용이성 으로 인해, 독특한 연구 연구를 위한 수년에 걸쳐 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 이러한 응용 분야는 광유전학 연구, 시냅스 개발, 세포사멸 및 신경 근육 상호 작용^14,,15를포함한다.

우리는 배아 일 7 (E7) 병아리 배아에서 섬모 신경신경의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 우리는 콜린성 뉴런의 매우 순수하고 안정적인 세포 배양을 얻기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 특별한 주의를 필요로하고 신경 문화의 질을 향상시킬 프로토콜의 주요 단계를 강조. 이러한 문화권은 적어도 15일 동안 시험관내에서 유지될 수 있다.

프로토콜

1. 시약 준비

참고 : 이 절차에 필요한 재료는 다음과 같습니다 : 집게 (nº 5 및 nº 55), 수술 핀셋, 해부 페트리 접시 (검은 바닥), 24 웰 플레이트, 플라스틱 파스퇴르 파이펫, 화재 광택 유리 파스퇴르 파이펫, 10 mL 주사기, 0.22 μm 주사기 필터.

1. 유리 커버립, 집게(nº 5 및 nº 55), 수술 핀셋, 페트리 접시(검은 바닥), 증류된 H₂O, 파이펫 및 수술용 소재를 포함하여 프로토콜에 필요한 모든 재료를 준비하고 살균합니다.
2. 0.1 mg/mL 폴리-D-리신(PDL) 용액을 준비한다.
   1. 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.2)에서 1 mg / mL (10x 용액)의 농도로 PDL을 재구성합니다.
   2. 희석 1:10 에서 166.6 mM 붕산 완충제 (pH 8.2) 0.1 mg/mL의 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
3. 10 μg/mL 라미닌 용액을 준비합니다.
   1. 10 μg/mL의 최종 농도에 일반 신경 물질 매체에 1 mg/mL 라미닌을 희석.
4. 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션 (HBSS): 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH₂PO_4,137 mM NaCl, 4.16 mM NaHCO3, 0.34 mM_Na2HPO_·42H2 O, 5 mM 포도당, 1 mM 나트륨 pyruvate, 10 m HEPES 버퍼, 00 m HEPES 버퍼, 00 mM HEPES.₂ pH를 7.2로 조정합니다.
5. 0.1% 트립신 솔루션을 준비합니다.
   1. 용해 5 트립신 의 mg 1:250 분말 에 5 ML HBSS의 최종 농도0.1%.
   2. 완전히 용해 될 때까지 4 °C의 롤러 믹서에 놓습니다.
   3. 10mL 주사기와 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 필터링합니다.
6. 글루타민이 없는 신경물질 매체,1X B27(사진 민감성), 열불식 말 혈청 10%, 열비활성화 FBS 2%, U/mL 페니실린/스트렙토마이신(0.25x) 및 2mM 글루타민을 준비한다. 멸균 시약을 사용하고 멸균 조건에서 배지를 준비하십시오.
7. 고분 검소 전체 매체를 준비 (성장 인자로 보충): 불완전 한 매체에, 추가 5 ng/mL GDNF 와 5 ng/mL CNTF.

2. 24웰 플레이트용 유리 커버립 준비

1. 원하는 수의 유리 커버립을 산내 내성 용기 안에 넣고 모든 커버립이 물에 잠길 때까지 65%의 질산을 추가합니다. 컨테이너를 궤도 셰이커에 넣고 실온(RT)에서 하룻밤 동안 1000rpm의 속도로 배양합니다.
2. 다음 날, 조심스럽게 작은 저수지에 질산을 전송하고 추가 사용을 위해 저장합니다. 질산은 2-3배 재사용할 수 있다.
3. 조심스럽게, 나머지 질산을 제거하기 위해 커버립에 증류 된 H₂O를 추가합니다. 30분 동안 교반에 놓고 세척 용액을 버리고 이 5x를 반복하십시오.
4. 커버립을 75%의 에탄올로 두 번 헹구습니다.
5. 알루미늄 호일로 덮인 금속 랙에 개별 커버립을 조심스럽게 분리하고 놓고 50 ºC에서 10-15 분 또는 완전히 건조 할 때까지 배양하십시오.
   참고 : 유리 커버립이 서로 달라 붙는 것처럼 자동 복제하지 마십시오.
6. 10-15분 동안 자외선 아래에서 커버립을 살균합니다. 신경 조직 배양에 대한 커버립 멸균을 유지합니다.

3. 24웰 플레이트용 유리 커버립 코팅

1. 멸균 트위저를 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 놓습니다.
2. 0.1 mg / mL PDL의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
3. 다음 날, 멸균 증류 H₂O로 커버립을 두 번 헹구는 다. 그런 다음 각 커버슬립에 증류수 500μL을 추가하고 실온에서 30분 동안 둡니다.
4. 물을 버리고 각 우물에 10 μg /mL 라미닌 용액의 350 μL을 추가하십시오.
5. 37°C 인큐베이터에 2시간 동안 배치합니다.
6. 세포 도금 전에 라미닌 용액을 제거하고 일반 신경 물질 매체로 두 번 씻으시면 됩니다.
   참고 : 커버립이 언제든지 건조하지 않는 것이 중요합니다.
7. 완전한 중간 크기의 300 μL을 추가하고 도금 시간까지 37 °C및 5 % CO_2의 인큐베이터에 둡니다. 세포를 도금하기 전에 이 매체를 제거하십시오.

4. 닭배아로부터 의양성 간골의 문화 (배아일 7)

1. 섬모 간골의 해부 (CG)
   1. 인큐베이터에서 계란을 제거하고 75 %의 에탄올로 스프레이하십시오.
      참고: 계란은 ~16°C에서 저장되어 7일 동안 37.7°C(또는 원하는 배아 단계)로 배양됩니다. 여기에 사용되는 계란은 로스 치킨 종에서 입니다.
   2. 가위로 계란의 상단을 잘라 숟가락을 사용하여 배아를 꺼내. 얼음차가운 HBSS를 곁들인 페트리 접시에 배아를 놓고 목 부위를 절단하여 머리를 몸과 분리합니다.
      참고: 배아가 계란에서 제거되는 즉시 세포 사멸을 담당하는 프로테아이를 생성할 수 있습니다. 배아가 세포 사멸을 최소화하기 위해 껍질 밖에 있으면 머리를 몸에서 빠르게 분리하는 것이 중요합니다.
   3. 얼음 차가운 HBSS에 태아의 머리를 유지합니다.
   4. 배아 머리를 들고 nº 5 집게로 병아리의 부리에 고정하십시오. 그런 다음 nº 55 포셉을 사용하여 눈 주위의 얇은 피부 층을 제거하기 시작합니다.
   5. 조심스럽게 눈을 제거하고 후방 부분에 액세스하기 위해 회전합니다. 병아리의 머리에서 눈을 분리하는 동안, 시신경이 절제되는 것을 주의하십시오. 이것은 섬모 신경절을 현지화하는 데 도움이됩니다.
   6. 눈이 분리되면 후방 측으로 유지하고 절개 된 시신경과 코로이드 균열에 인접한 섬모 신경절을 확인하십시오. 사전 신경은 아직도 그것의 식별을 용이하게 하는 섬모 신경절에 붙어 있을 지도지도 신경절에 붙어 있을 지도 모릅니다.
   7. 각 눈에서 섬모 신경절을 해부하고 각 신경절 주위의 과잉 조직을 제거하여 아주 잘 청소합니다.
      참고 : ~ 1x10⁶ 셀 / mL의 수율을 갖기 위해 ~ 70 개의 CD를 해부하십시오. 얻어진 세포 인구에는 비신경 세포도 포함되어 있습니다. 비신경 세포의 수를 감소시키고, 결과적으로, 신경 인구의 순도를 증가시키기 위해, 모든 과잉 조직을 제거, 가능한 한 섬모 신경을 청소하는 것이 매우 중요하다.
2. 섬모 적 중의 해리와 문화
   1. 멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 15mL 튜브에 모든 섬모 신경을 수집합니다.
      참고: 파이펫 벽에 신경리아의 부착을 최소화하기 위해 파스퇴르 파이펫을 미리 적재하는 것이 중요합니다.
   2. 200 x g에서2 분 동안 심모 성 간리를 원심 분리합니다.
   3. 조심스럽게, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 모든 HBSS 매체를 제거하고 P1000 마이크로 파이프를 제거합니다. 0.1% 트립신 용액 1mL을 넣고 교반 없이 수조에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
   4. 200 x g에서2 분 동안 원심 분리기.
   5. 트립신 용액을 즉시 제거하고 불완전한 매체 1mL을 추가합니다.
      참고: 불완전한 매체에는 트립신의 효과를 즉시 중지하는 혈청이 포함되어 있습니다.
   6. 200 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 제거하고 모든 매체를 제거합니다.
   7. 완전한 매체의 350-500 μL을 추가합니다.
      참고: 세포를 해리시키는 데 필요한 부피는 얻어진 섬모 성 졸리아의 수에 따라 달라지며, 따라서 얻어진 펠릿 크기에 따라 달라집니다. ~70 CG의 경우 배지 500 μL을 사용하는 것이 좋습니다.
   8. P1000을 사용하여 10-15배 위아래로 파이프를 한 다음, 불을 닦은 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10-15배씩 진동하여 CG를 분리합니다. 세포 손실을 최소화하기 위해 기포 형성을 피하십시오.
      참고: 도금될 때까지 셀룰러 서스펜션을 얼음 위에 보관하십시오.
   9. Trypan 블루 솔루션과 표준 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다.
   10. 플레이트 1 x 10⁴ 셀/mL은 완전한 배지의 500 μL에서 적절한 셀 서스펜션 의 적량을 희석시킴으로써 24웰 플레이트의 각 웰에 (10 μM 5'-FDU로 보완).
   11. 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양한다.

5. 모성 뉴런의 면역 세포 화학 및 이미지 분석

1. 이전에 설명된 바와 같이 본 논문에 제시된 면역세포화학 분석체를^{,17수행한다.}
2. 마우스 모노클로날 b-III 튜룰린(1:1000, T8578), 닭고기 모노클론 신경필라멘트 M(1:1000, AB5735), 마우스 모노클로날 SV2(1:1000, AB2315387)를 사용한다.
3. 이차 항체로서, 사용 알렉사 플루오르 568-공주 염소 항 마우스 항체 (1:1000, A11031), 알렉사 플루어 568 -컨쥬게이트 염소 항 닭 항체 (1:1000, A11041), 알렉사 플루어 647 공주 염소 항 마우스 항체 (1:1200, A11041), 알렉사 플루어 647 공주 염소 항 마우스 항체 (1:120).
4. 탈것은 핵 염색(P36935)을 위해 DAPI가 장착된 배지를 사용하여 커버를 마운트합니다.

결과

이 절차에 대한 예상 기간은 각 특정 실험에 필요한 수율에 따라 밀접하게 달라지므로 격리해야 하는 섬모 간질 수에 따라 달라집니다. 추정 수율 1 x 10⁶ 세포/mL의 추정 수율을 위해 약 70개의 섬모 간질(35개의 계란)을 분리합니다. 이 수의 회랑의 경우 해부 절차에 2-3 시간, 총 절차에 대해 총 4-5 시간이 소요됩니다. 격리 프로토콜의 단계별 그림은 도 1A에표시됩니다. ...

토론

이 프로토콜에서 CG 뉴런을 준비하고 배양하는 방법을 시연했습니다. 섬모 신경절의 식별 및 해부는 경험이없는 사용자에게 어려울 수 있습니다. 따라서, 우리는 E7 병아리 섬모 신경통을 효율적으로 해부하고, 조직을 해리하고, 적어도 15 일 동안 유지 될 수있는 신경 배양을 준비하는 상세하고 단계별 절차를 제시한다. 이 프로토콜로 얻은 섬모 신경절 뉴런은 근육 세포와의 공동 배양에도 적합합...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018