Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons

Resumo

As gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático. Culturas neuronais de neurônios CG foram mostrados como modelos celulares eficazes no estudo das interações musculares nervosas. Descrevemos um protocolo detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios CG de embriões de filhotes.

Resumo

Os gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático e são responsáveis pela inervação dos tecidos musculares presentes no olho. Este gânglio é constituído por uma população homogênea de neurônios ciliares e coroidais que invato fibras musculares e lisas, respectivamente. Cada um desses tipos neuronais regulam estruturas e funções oculares específicas. Ao longo dos anos, as culturas neuronais do gânglio ciliar filhote mostraram-se modelos celulares eficazes no estudo das interações músculo-nervoso do sistema, que se comunicam por meio de sinapses colinérgicas. Os neurônios ciliares são, em sua maioria, colinérgicos. Este modelo celular tem se mostrado útil comparativamente aos modelos celulares heterogêneos anteriormente utilizados que compreendem vários tipos neuronais, além da colinérgica. Anatomicamente, o gânglio ciliar é localizado entre o nervo óptico (ON) e a fissura choroide (CF). Aqui, descrevemos um procedimento detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios gânglios ciliares de embriões de filhotes. Fornecemos um protocolo passo-a-passo para obter culturas celulares altamente puras e estáveis dos neurônios CG, destacando as principais etapas do processo. Essas culturas podem ser mantidas in vitro por 15 dias e, por meio deste, mostramos o desenvolvimento normal das culturas cg. Os resultados também mostram que esses neurônios podem interagir com fibras musculares através de sinapses colinérgicas neuromusmas.

Introdução

Os neurônios de gânglio ciliar (CG) pertencem ao sistema nervoso parassimpático. Estes neurônios são colinérgicos, sendo capazes de estabelecer sinapses muscarínicos ou nicotínicas^1,,2,3. Anatomicamente, o CG está localizado na parte posterior do olho entre o nervo óptico (ON) e a fissura coroóide (CF) e consiste em cerca de 6000 neurônios nos estágios embrionários iniciais^1,,4. Para a primeira semana na cultura, os neurônios ciliares de gânglio apresentam uma morfologia multipolar. Após uma semana, eles começam a transição para um estado unipolar, com um neurite estendendo e formando o axônio⁵. Além disso, aproximadamente metade dos neurônios CG morrem entre os dias⁸ e 14^th do desenvolvimento de embriões de filhotes, através de um processo programado de morte celular. Essa diminuição no número de neurônios resulta em uma população total do gânglio ciliar de cerca de 3000 neurônios^6,7,8. In vitro, não há redução no número de neurônios CG quando cultivados com células musculares⁹ e neurônios CG podem ser cultivados por várias semanas^1,9.

O gânglio ciliar consiste em uma população homogênea de neurônios ciliares e neurônios coroidais, cada um representando metade da população neuronal no CG, inervando o músculo do olho. Esses dois tipos de neurônios são estruturalmente, anatomicamente e funcionalmente distintos. Os neurônios ciliares inervam as fibras musculares estriadas na íris e na lente, sendo responsáveis pela contração da pupila. Os neurônios choroidais inervam o músculo liso do coroide^1,10,11,12.

Culturas de neurônios gânglios ciliar de frango têm se mostrado ferramentas úteis para o estudo de sinapses neuromusculares e formação de sinapse^1,,5,9. Considerando que as sinapses neuromusculares são colinérgicas¹³, utilizando uma população neuronal que é colinérgica – neurônios CG – emergiu como alternativa potencial aos modelos celulares anteriores¹⁴. Esses modelos consistiam em uma população neuronal heterogrógena, na qual apenas uma pequena parte é colinérgica. Alternativamente, os neurônios de gânglio ciliar desenvolvem-se in vitro relativamente rápido, e após aproximadamente 15 horas já formam sinapses¹. Os neurônios CG têm sido usados como um sistema modelo ao longo dos anos para estudos de pesquisa distintos, devido à sua relativa facilidade de isolamento e manipulação. Essas aplicações incluem estudos optogenéticos, desenvolvimento de sinapse, apoptose e interações neuromusculares^14,15.

Descrevemos um procedimento detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios gânglios ciliares a partir de embriões de filhotes embrionários do dia 7 (E7). Fornecemos um protocolo passo-a-passo para obter culturas celulares altamente puras e estáveis de neurônios colinérgicos. Destacamos também os principais passos do protocolo que requerem atenção especial e que melhorarão a qualidade das culturas neuronais. Essas culturas podem ser mantidas in vitro por pelo menos 15 dias.

Protocolo

1. Preparação de reagentes

NOTA: Os materiais necessários para este procedimento são os seguintes: fórceps (nº 5 e nº 55), pinça cirúrgica, placas de Petri de dissecção (fundo preto), placas de 24 poços, pipeta pasteur plástica, pipeta Pasteur de vidro polido a fogo, seringa de 10 mL, filtro de seringa de 0,22 μm.

1. Prepare e esterilize todo o material necessário para o protocolo, incluindo tampas de vidro, fórceps (nº 5 e nº 55), pinças cirúrgicas, placas de Petri (fundo preto), H₂O destilada, pipetas e material para cirurgia.
2. Prepare a solução de 0,1 mg/mL Poly-D-Lysine (PDL).
   1. Reconstituir pdl em tampão de 0,1 M de borate (pH 8.2) a uma concentração de 1 mg/mL (solução 10x).
   2. Diluir 1:10 em 166,6 mM tampão de borate (pH 8.2) para obter uma concentração final de 0,1 mg/mL.
3. Prepare a solução de laminina de 10 μg/mL.
   1. Diluir 1 mg/mL laminina em meio neurobásal simples até uma concentração final de 10 μg/mL.
4. Prepare a solução de sal balanceado da Hank (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 5 mM de glicose, 1 mM piruvato de sódio, 10 mM hepes tampão, 0,001% vermelho fenol. Ajuste o pH para 7,2.
5. Prepare 0,1% de solução de trippsina.
   1. Dissolver 5 mg de trippsina 1:250 em pó em 5 mL de HBSS para uma concentração final de 0,1%.
   2. Coloque em uma batedeira a 4 °C até dissolver completamente.
   3. Filtrar usando uma seringa de 10 mL e um filtro de seringa de 0,22 μm.
6. Prepare o meio incompletociliar gânglio: meio neurobásico sem glutamina, 1X B27 (foto-sensível), 10% soro de cavalo inativado por calor, 2% FBS inativados por calor, 12,5 U/mL penicilina/estreptomicina (0,25x) e 2 mM de glutamina. Use reagentes estéreis e prepare o meio em condições estéreis.
7. Preparar o meio completo de gânglio ciliar (complementado com fatores de crescimento): ao meio incompleto, adicione 5 ng/mL GDNF e 5 ng/mL CNTF.

2. Preparação de tampas de vidro para placas de 24 poços

1. Coloque o número desejado de tampas de vidro dentro de um recipiente resistente ao ácido e adicione 65% de ácido nítrico até que todas as tampas estejam submersas. Coloque o recipiente em um agitador orbital e incuba durante a noite à temperatura ambiente (RT) a uma velocidade de 1000 rpm.
2. No dia seguinte, transfira cuidadosamente o ácido nítrico para um pequeno reservatório e armazene para uso posterior. O ácido nítrico pode ser reutilizado 2-3x.
3. Cuidadosamente, adicione H₂O destilado às tampas para remover o ácido nítrico restante. Coloque em agitação por 30 minutos, descarte a solução de lavagem e repita este 5x.
4. Enxágüe as tampas com 75% de etanol duas vezes.
5. Separe cuidadosamente e coloque tampas individuais em um rack de metal coberto com papel alumínio e incubar a 50 ºC por 10-15 minutos ou até secar completamente.
   NOTA: Não autoclave tampas de vidro, pois elas grudarão umas nas outras.
6. Esterilize as tampas sob luz UV por 10-15 minutos. Manter tampas estéreis para a cultura do tecido neuronal.

3. Revestimento de tampas de vidro para placas de 24 poços

1. Usando uma pinça estéril, coloque uma mancha de cobertura em cada poço de uma placa de 24 poços.
2. Adicione 500 μL de 0,1 mg/mL PDL e incubar durante a noite a 37 °C.
3. No dia seguinte, enxágue as tampas duas vezes com H₂O destilado estéril. Em seguida, adicione 500 μL de água destilada a cada deslizamento de cobertura e deixe por 30 minutos em temperatura ambiente.
4. Descarte a água e adicione 350 μL de solução de laminina de 10 μg/mL em cada poço.
5. Coloque em uma incubadora de 37 °C por 2 h.
6. Antes do revestimento celular, remova a solução de laminina e lave duas vezes com meio neurobásal simples.
   NOTA: É importante que as tampas não sequem em nenhum momento.
7. Adicione 300 μL de meio completo e deixe em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ até o tempo de chapeamento. Antes de emplacamento de células, remova este meio.

4. Cultura de gânglio ciliar do embrião de frango (dia 7 embrionário)

1. Dissecção de gânglios ciliares (CG)
   1. Retire os ovos da incubadora e pulverize-os com 75% de etanol.
      NOTA: Os ovos são armazenados a ~16 °C antes de serem incubados a 37,7 °C durante 7 dias (ou o estágio embrionário desejado). Os ovos usados aqui são da espécie de frango Ross.
   2. Corte a parte superior do ovo com uma tesoura e retire o embrião usando uma colher. Coloque o embrião em uma placa de Petri com HBSS gelado e separe a cabeça do corpo cortando na região do pescoço.
      NOTA: Assim que o embrião é removido do óvulo, ele pode produzir proteases responsáveis pela morte celular. É importante separar rapidamente a cabeça do corpo uma vez que o embrião está fora da concha para minimizar a morte celular.
   3. Mantenha a cabeça do embrião em HBSS gelado.
   4. Segure a cabeça do embrião e fixe-a no bico do filhote com fórceps nº 5. Em seguida, com nº 55 fórceps, comece a remover a fina camada de pele ao redor do olho.
   5. Remova cuidadosamente o olho e gire-o para acessar a parte posterior. Ao separar o olho da cabeça do filhote, observe o nervo óptico sendo seccionado. Isso ajudará a localizar o gânglio ciliar.
   6. Uma vez que o olho esteja separado, mantenha-o com o lado posterior para cima e observe o gânglio ciliar adjacente ao nervo óptico seccionado e à fissura coroide. O nervo pré-brilhante ainda pode estar ligado ao gânglio ciliar, o que facilita sua identificação.
   7. Dissecar o gânglio ciliar de cada olho e limpar muito bem removendo o excesso de tecido ao redor de cada gânglio.
      NOTA: Para ter um rendimento de ~1x10⁶ células/mL, dissecar ~70 CGs. Por favor, note que a população celular obtida contém células não-neuronais também. Para diminuir o número de células não neuronais e, consequentemente, aumentar a pureza da população neuronal, é muito importante limpar o gânglio ciliar o máximo possível, removendo todo o excesso de tecido.
2. Dissociação e cultura de gânglios ciliares
   1. Colete todas as gânglios ciliares em um tubo de 15 mL usando uma pipeta pasteur de plástico estéril.
      NOTA: É importante pré-molhar a pipeta Pasteur para minimizar a fixação do gânglio na parede da pipeta.
   2. Centrifugar o gânglio ciliar por 2 minutos a 200 x g.
   3. Remova cuidadosamente todo o meio HBSS usando uma pipeta Pasteur e, em seguida, uma micropipette P1000. Adicione 1 mL de solução de trippsina de 0,1% e incubar por 20 minutos a 37 °C em banho-maria, sem agitação.
   4. Centrífuga por 2 minutos a 200 x g.
   5. Remova imediatamente a solução de trippsina e adicione 1 mL de meio incompleto.
      NOTA: O meio incompleto contém soro que interromperá imediatamente o efeito da trippsina.
   6. Centrifugar por 2 minutos a 200 x g e remover todo o meio.
   7. Adicione 350-500 μL de meio completo.
      NOTA: O volume necessário para dissociar as células depende do número de gânglios ciliares obtidos e, assim, do tamanho da pelota obtido. Para ~70 CG recomenda-se usar 500 μL de médio.
   8. Dissociar CGs por pipetar para cima e para baixo 10-15x primeiro usando um P1000 seguido por 10-15x usando uma pipeta Pasteur de vidro polido com fogo. Evite a formação de bolhas de ar para minimizar a perda celular.
      NOTA: Mantenha a suspensão do celular no gelo até chapeamento.
   9. Determine a densidade celular usando uma solução azul Trypan e uma câmara neubauer padrão.
   10. Placa 1 x 10⁴ células/mL em cada poço da placa de 24 poços diluindo o volume apropriado de suspensão celular em 500 μL de meio completo (suplementado com 10 μM 5'-FDU).
   11. Incubar células em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO_2.

5. Imunocytoquímica e análise de imagem de neurônios ciliares

1. Realizar o ensaio de imunocitoquímica apresentado neste artigo como descrito anteriormente^16,17.
2. Use os seguintes anticorpos primários: tubulina monoclonal do rato (1:1000, T8578), neurofilamento monoclonal de frango M (1:1000, AB5735), SV2 monoclonal do rato (1:1000, AB2315387).
3. Como anticorpos secundários, use o anticorpo anti-rato de cabra alexa Fluor 568 (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-conjugado anticorpo anti-frango de cabra (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-conjugado anticorpo anti-rato de cabra (1:1000, A21235).
4. Montagem de tampas usando meio de montagem com DAPI, para coloração nuclear (P36935).

Resultados

A duração estimada para este procedimento depende firmemente do rendimento necessário para cada experimento específico e, portanto, do número de gânglios ciliares que precisam ser isolados. Para um rendimento estimado de 1 x 10⁶ células/mL, isole cerca de 70 gânglios ciliares (35 ovos). Para este número de gânglios, levará de 2 a 3 horas para o procedimento de dissecção e um total de 4-5 horas para o procedimento total. Uma ilustração passo a passo do protocolo de isolamento é mostrada na

Discussão

Neste protocolo, demonstramos como preparar e cultivar neurônios CG. A identificação e dissecação do gânglio ciliar pode ser difícil para usuários não-experimentais. Por isso, apresentamos um procedimento detalhado e passo a passo para dissecar eficientemente o Gânglio ciliar do pintinho E7, dissociar o tecido e preparar culturas neuronais que podem ser mantidas por pelo menos 15 dias. Os neurônios gânglios ciliares obtidos com este protocolo também são adequados para a co-cultura com células musculares.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018