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要在经济学研究中使用卡诺哈布迪炎(C.elegans),需要一种方法来生成大量蠕虫,其中单个样本可以在平台上测量以进行比较分析。在这里,提出了一种在大型文化板块(LSCPs)上培养C.elegans种群并记录人口增长的方法。
卡诺哈布迪炎(C.elegans)一直是并仍然是研究发育生物学、衰老、神经生物学和遗传学的宝贵模型有机体。大量关于C.elegans的研究使得它成为融入大量全动物研究以解剖复杂的生物成分及其与另一个生物体关系的理想候选者。为了在协作-经济学研究中使用C.elegans,需要一种方法来生成大量动物,其中单个样本可以在不同的平台上进行分解和检测,以便进行比较分析。
在这里,介绍了一种在大型文化板块(LSCP)上培养和收集大量混合阶段 C.elegans 种群的方法,以及随后的表型数据。这条管道产生足够的动物来收集表型和种群数据,以及-经济学实验(即基因组学、转录学、蛋白质组学和代谢学)所需的任何数据。此外,LSCP 方法要求对动物本身进行最少的操作,减少用户准备时间,提供严格的环境控制,并确保在整个研究过程中对每个样本的处理保持一致,以便全面可重复性。最后,介绍了在给定的LSCP中记录 C.elegans 生命阶段的人口规模和人口分布的方法。
C. elegans是一种小型自由生存线虫,在世界各地各种自然栖息地被发现。其相对容易生长、快速生成时间、生殖系统和透明的身体使其成为在发育生物学、衰老学、神经生物学和遗传学2、3中被广泛研究的强大模型生物体。大量关于C.elegans的研究使得利用-经济学研究将表型与复杂的生物成分及其在给定生物体中的关系全面联系起来成为最佳候选者。
为了在协作-经济学研究中使用C.elegans,需要一种方法来产生大量的动物混合阶段种群,其中一个样本可以拆分,并跨不同的平台和仪器用于比较分析。创建生成此类样本的管道需要敏锐地了解饮食、环境、压力、人口结构以及样本处理和收集。因此,必须将标准和可重复的栽培条件纳入大型管道。在C.elegans的研究中,两种传统方法被用来培养蠕虫——阿加·佩特里菜肴和液体培养4。
从历史上看,当需要大量的C.elegan时,它们生长在液体培养中。在液体培养中产生大量蠕虫的步骤需要多个处理步骤,通常包括漂白剂同步破裂的成年角质层,释放胚胎以达到所需的种群大小。然而,当使用漂白剂同步时,人口增长取决于开始人口普查的规模,因此影响随后的增长和人口数量。此外,C. elegans菌株的皮质敏感性、暴露时间和对漂白剂同步的压力反应也各不相同,因此很难在5、6、7、8、9时检测许多菌株。
此外,液体培养中的蠕虫生长需要几个转移步骤,因为通常建议在收获前只生长一代蠕虫,因为如果生长多代,很容易出现过度拥挤,并导致尽管存在食物10的dauer形成。道尔的形成通过小信号分子(如通常被称为"dauer信息素")发生,11、12、13、14,被释放到液体介质中,影响人口的增长。此外,液体培养中大量蠕虫种群的增加会导致培养物中细菌积累过多,当下游表型检测需要清洁样本时,会产生困难。最后,当液体培养物被污染时,由于真菌孢子或细菌细胞很容易分散在媒体15中,因此更难维持。
种植 C.elegans 的另一种传统方法是在阿加·佩特里菜肴上。市售的Petry菜肴可以很容易地生长多代混合阶段蠕虫,而不会像液体培养物中那样,出现过度拥挤和高道尔形成的快速影响。然而,在传统的琼脂培养皿上,蠕虫生长的一个缺点是,最大的市售Petry菜不会产生大量的蠕虫种群进行-经济学研究,而不添加漂白剂同步步骤。总之,在阿加·佩特里菜肴上培养 C.elegans 的混合阶段种群更适合收集-经济学数据,但我们需要一种方法来产生非常大的人口规模,而无需液体培养。
在这里,我们提出了一种在大型文化板块(LSCP)上培养和收集大型混合阶段C.elegans种群的方法。通过这条管道收集样本可以产生足够的样本来收集表型和种群数据,以及-经济学实验(即基因组学、转录学、蛋白质组学和代谢学)所需的任何数据。此外,LSCP 方法要求对动物进行最少的操作,减少用户准备时间,提供严格的环境控制,并确保在整个研究过程中对每个样本的处理保持一致,以便整体可重复性。
1. 消毒 LSCP 和设备
2. 准备线虫生长介质阿加罗斯 (NGMA)
3. 在 LSCP 上为 NGMA 生成 大肠杆菌 食物
4. NGMA 上的细菌草坪
5. 块蠕虫,以减少不同样本的压力和年龄变化
6. 斑点漂白青金成人到 Lscp
注意:这种漂白技术用于根除大多数污染物和溶解从成年蠕虫中释放胚胎的草本植物的角质层。漂白液将在胚胎孵化前浸泡到NGMA中。
7. 控制温度 (CT) 室中的蠕虫生长
8. 采集 LSCP 样本
9. 估计人口规模
注意:快速通过步骤9.1-9.7。步骤 8.13 中的 ddH2O 和蠕虫的混合物在随后的步骤中称为"蠕虫样本"。
10. (可选) 大粒子流细胞测量准备样本
注:步骤10、11和12是作者记录样本增长(即C.elegans生命周期阶段的人口规模和人口分布)并确定文化成功的首选方法。此协议的用户可以用自己的增长成功指标替换可选步骤 10、11 和 12。第 10、11 和 12 步在这里描述有两个原因:首先,拥有步骤 10、11 和 12 中使用的设备的用户可以复制这些步骤:其次,显示此增长方法的验证。以上步骤 9 提供了对蠕虫总数的良好估计,以确定阿里报价大小,第 10 步是一个更量化的指标,以估计特定样本中蠕虫的数量和种群分布。
11. (可选) 记录人口分布和准备 384 井板进行成像
注:第 11 步使用大粒子流细胞仪 (LPFC)。本协议假定了LPFC的基本知识。可以替代其他方法记录样本的增长和人口分布。此处记录的步骤是针对计划在其管道中使用 LPFC23的用户。
12. (可选) 成像 384 井板
注:第12步使用板读微孔显微镜。本协议假定了微型共焦显微镜的基本知识。可以替代其他方法记录样本的增长和人口分布。
使用 LSCP 方法生长的C. elegans在 12.2 天内平均每个样本产生大约 240 万种混合阶段蠕虫。使用 LSCP 方法的C. elegans的生长使用户能够生成大量C. elegans的混合阶段种群,而很少处理和操纵动物,这是大规模经济学研究的理想选择(图 1)。一旦 LSCP 变得充满成人蠕虫,达到大种群规模,并且细菌数量极少,用户就可以收获和估计种群规模。这一点还可以通过评估人口是否足以用于-omics管道(图2)作为质量控制。人口动态取决于菌株本身、菌株的行为(即挖洞菌株往往具有较低的蠕虫恢复率)和生长成功(即污染)。LSCP方法在15株含有卡诺哈布迪炎遗传学中心(CGC)突变体和卡诺哈布迪蒂斯埃莱甘斯自然多样性资源(CeNDR)野生菌株25的混合物的C.elegans上进行了测试。应变基因型在补充表 3中描述。
LSCP方法产生的人口规模从大约94 500人增加到9 290 000人。参考菌株PD1074和跨菌株的平均种群规模约为240万蠕虫(图3)。在平均12.2 LSCP生长日(图4)的过程中,C.elegans菌株之间的估计种群数量没有显著差异。PD1074 LSCP花了10-14天的时间才增长到一个完整的混合阶段人口。整个PD1074的平均增长时间为10天。生长最慢的菌株最多生长20天,增长最快的菌株最多生长10天(图4)。
因此,使用这种 LSCP 方法,用户可以轻松地将新的兴趣菌株集成到对开发时机和背景专业知识知之甚少的研究中。请注意,必须通过采摘来维持的菌株和表型,有生育缺陷,是异质的,或有生长缺陷,可能不能很好地工作在这个管道中。
大粒子流细胞测量和样品成像允许用户记录人口分布。 各种平台可用于衡量成功的人口增长。
对于可重复的-经济学测量,重要的是要发展一致的文化。培养可重复性的指标是蠕虫的数量和给定菌株的一致大小分布。我们展示了参考菌株 PD1074 的样本分布 - 原始 N2 布里斯托尔菌株的变种,使用 LPFC23、26和微共焦显微镜图像作为生长成功的代理。由于蠕虫是从L1阶段通过500万成年人在LPFC分布(图5),随后的成像(图6)和在样本(图7)的人口分布的变化,我们可以看到,这条管道产生了C.elegans的混合阶段种群。
为了仔细观察混合阶段样本的人口分布情况,我们通过查看整个飞行时间 (TOF) (即身体长度) 分布中每个区域中蠕虫百分比(图 7A,B)来观察 35 PD1074 LSCP 的分布情况。
图1:LSCP蠕虫生长管道概述。(A) 一旦在实验室收到,所有菌株都准备和冷冻,长期储存在-80°C2。(B) 从冷冻蠕虫库存中准备了一块"主块"板,储存在15°C,使用时间不超过一个月。(C) 每个样本在 LSCP 上生长之前,连续经历了四个分块步骤,以减轻代压。( D ) 从步骤(D)中的"块 4" 6 厘米板中挑选 5 个单独的格拉维德成人,并在 LSCP 的 5 个给定区域进行漂白。(E) LSCP 被放置在控制温度室中,生长在 20 °C,直到 LSCP 充满成人蠕虫,达到大种群规模,细菌数量最少。(F) 虫群被收获并收集到下游步骤。(G) 阿里报价是从 LSCP 创建的,并用于下游所需的应用被冻结。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:LSCP收获和估计人口规模概述。(A) 50 mL 的 M9 用于从 NGMA 表面清洗蠕虫。蠕虫悬架被管道放入50mL圆锥管中。步骤 (A) 重复了两次。(B) 15 mL 的蠕虫悬架被倒入新的 15 mL 圆锥管中。蠕虫被离心机撬动。M9+碎片在没有干扰蠕虫颗粒的情况下被吸走。步骤 (B) 重复,直到收集所有 150 mL 的蠕虫悬架。(C) 用M9清洗和离心三次,以消除残留的碎片。样品清洁后,蠕虫颗粒在 ddH2O(D)的 10 毫升中重新喷出,并创建样本的连续稀释以估计蠕虫种群大小。使用了稀释因子,使蠕虫能够准确计数。使用的稀释因子根据 LSCP 的人口大小而变化。(E) 一旦选择稀释因子,稀释的所有三种稀释复制品的所有蠕虫都被吹到干净的滑梯上,蠕虫在解剖显微镜下计数。(F) 样本被分成适当大小的别名。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:LSCP方法平均产生240万混合阶段蠕虫。LSCP 的人口规模最小,约为 94,500 人,人口增长率最大,约为 9,290,000 人。所有菌株的平均种群规模为240万蠕虫。C. elegans菌株名称下方的条形表示菌株是 CGC 突变体还是 CeNDR 自然分离物。显示每个菌株的 LSCP 样本大小。使用 Tukey 的 HSD 测试对所有对进行了比较。C. elegans菌株(F (14,108) = 0.7,p = 0.77)的估计种群大小之间没有显著差异。 彩色条表示各自C. elegans应变表示的标准颜色显示。请单击此处查看此图的较大版本。
图4:LSCP方法在10-20天内产生大量蠕虫混合阶段种群。给定的C. elegans LSCP 生长,直到样本中充满成人蠕虫,达到大种群规模,并且留下的细菌草坪最少。LSCP需要10-20天的时间才能增长到完全的混合阶段人口,这取决于压力。整个菌株的平均生长时间为12.2天。显示每个菌株的 LSCP 样本大小。每个错误栏都是使用 1 个标准偏差构建的。同一字母未连接的水平明显不同。使用图基 HSD 测试对所有对进行比较。C. elegans菌株 (F (14,108) = 8.8,p < 0.0001*)所需的 LSCP 生长时间存在显著差异。 彩色条表示各自C. elegans应变表示的标准颜色显示。请单击此处查看此图的较大版本。
图5:野生型参考菌株PD1074的混合种群和生长测量。野生型参考菌株(原始 N2 布里斯托尔菌株的变种)的一种 LSCP 增长具有代表性的 LPFC 分布,记录了混合阶段种群的大小分布和事件计数。x 轴显示排序蠕虫的长度(飞行时间、TOF)。y 轴显示已排序蠕虫的光学密度(光学灭亡、EXT)。每个数据点都是样本中记录的蠕虫。用于图像分析的每个 TOF 区域都以不同的颜色显示。创建了20个托福区域(R2–R21),从50到2050年不等。每个 TOF 区域的详细信息可在补充表 1 中找到。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6:从R2-R12等 TOF区域排序的蠕虫图像显示了PD1074 LPFC分布。在区域 R2 中,可以识别 L1 蠕虫,在区域 R9 中,主要识别成年虫,跨越两个发育幼虫极端,使我们在流细胞仪分布中大致区域,即分布中预计阶段。比例栏表示 1 mm。代表性图像取自 图5中显示的LPFC分布,彩色框与 图5中的区域相对应。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7:野生型参考菌株PD1074中飞行时间(TOF)区域的人口分布。蠕虫在整个 TOF 区域的分布显示发现蠕虫的区域。每个 PD1074 LSCP 都表示为单个颜色。(A) x 轴显示观察到并计算 LSCP 的 20 个 TOF 区域 (R2 – R21),显示整个大小分布。y 轴显示来自特定 LSCP 的蠕虫百分比,该蠕虫的体型属于给定的 TOF 区域。(B) 由于蠕虫种群的一小部分落在R7-R21区域之间,因此需要记录每个区域内蠕虫的百分比,以显示种群分布。x 轴显示 R7-R21 TOF 区域。y 轴显示特定 LSCP 中蠕虫百分比的日志,该蠕虫的体型属于给定 TOF 区域。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1:生长和处理 LSCP 的生长条件的平均日温度 (°C)。报告的受控温度 (CT) 室的温度记录并在整个样品生长和收集的六个月跨度内收集。这里报告了日平均气温。在项目期间LCSP增长的温度(F(5,24) = 2.59,p = 0.0524)之间未发现显著差异。 在整个样品生长和生成的六个月持续时间内,整个温差不超过 0.003 °C。请单击此处下载此图。
补充表1:用于将蠕虫分类到384井板进行成像的 TOF 封闭区域。 从50-2050年起,在整个 TOF 分布中,创建了 100 个绑定区域。门控区域可以更改和优化,以满足您的需求。用于图像分析的每个 TOF 区域都以不同的颜色显示。 请单击此处下载此表。
补充表2:TOF区域的384井板模板和复制布局。 每个样本被分类成384井板进行成像。为选择排序的每个区域创建了四个复制品。门控区域可以更改和优化,以满足您的需求。有关在此协议中创建和使用的特定门控区域,请参阅补充表 1。用于图像分析的每个 TOF 区域都以不同的颜色显示。 请单击此处下载此表。
补充表3:本协议中使用的 C.elegans 菌株含有CGC和CeNDR菌株的混合物。 此表中描述了应变、基因型、应变源和详细信息。 请单击此处下载此表。
各种船只可用作 LSCP。在此协议中,使用了标准玻璃烤盘。使用的 LSC 的外部尺寸为 35.56 x 20.32 厘米,内部尺寸为 27.94 x 17.78 厘米,深约 4.45 厘米,并配有合适的盖子。因此,这里使用的细菌量已优化为具有上述尺寸的 LSCP,以产生大量混合阶段蠕虫。细菌体积和浓度可以调整,以满足实验需要。
霉菌、真菌或其他细菌源的污染可能发生在 LSCP 方法的任何步骤中,因此要小心处理样品。在开始协议的任何步骤之前,请确保用 70% 乙醇和 10% 漂白剂清洁工作空间。如有,请用紫外线处理使用区域 30 分钟,并在开始每个步骤前 30 分钟打开 HEPA 空气过滤器。
通过在受控设置(即在 20 °C 的 CT 室中)中增长 LSCP,用户可以更轻松地跟踪样本的增长并记录潜在的污染。如果 LSCP 表面受到污染,请尽可能消除污染,如果污染无法控制,则让样品继续生长或丢弃样品。必须迅速解决污染问题,以减少不必要的增长,并确保它不会在资源方面胜过蠕虫。
这种方法是为那些谁想要发展大规模的混合人口文化 的C.elegans。虽然有可能像在市售的培养皿和液体培养物上那样,在LSCP上增加同步的蠕虫种群,但作者尚未测试这一选项。此外,如果用户希望在给定样本中平均生长超过 240 万蠕虫,则建议采用其他方法4。增长的成功取决于正在处理的压力。作者成功地在至少5个 15C.elegans 菌株的生物复制品中培育出大约240万只蠕虫,表明该方法是强大的。
在开始实验之前,需要注意的是,特定蠕虫的年龄和健康会影响体型和随后的人口增长时间。确保蠕虫在使用此管道之前保持健康,应力最小。假设库存样本已被创建、冷冻并保存在 -80 °C,以减少遗传漂移。
根据给定实验的需要,LSCP 上的开始受试成人的数量可以更改。改变LSCP上开始育成的成年人的数量将改变增长率,从而改变收获的时间。五个贪图的成年人被用来播种每个LSCP的原因如下:(1) 一种简单,快速和有效的方法,种子许多 C.elegans 菌株到LSCP一次是必要的:(2)以减少年龄差异的草根成人选择,可能导致生长异质性。
这种方法允许用户收获大量具有所有生命周期阶段的蠕虫。根据现有方法,收集大规模 C.elegans 样本需要漂白剂同步,以获得下游工作所需的蠕虫数量。鉴于这种方法,人们现在可以在发酵器或大型液体培养物中尽可能多地生长蠕虫,而不会遇到与漂白剂同步和多个处理步骤相关的困难。我们的协议允许人们有效地瞄准利益菌株,在生长样品本身时使用最少的处理时间,并根据下游管道中需要隔离蠕虫或种群的阶段。
利用LPFC作为工具,记录特定LSCP中的人口分布和规模。使用的LPFC是一个连续流动系统,根据蠕虫的大小(TOF)和光学密度分析、分类和分配蠕虫。当给定蠕虫穿过流动细胞时,轴向光损失探测器捕获了被 488 nm 固态激光阻断的信号光量,以延长蠕虫通过的时间长度,从而使用户获得蠕虫的 TOF 和光学密度。荧光收集光学和探测器还可用于最大限度地提高每个样品的荧光灵敏度和收集量。LPFC 收集参数将因仪器而异。用户可以使用各种平台来捕获蠕虫大小,如果 LPFC 不可用,则不限于使用此协议。
作者使用此处描述的方法中生长的样本,通过液相色谱学 -质谱学、NMR光谱学和RNA测序,识别各种 丙烯 酸盐菌株中的未知代谢物。作者计划继续使用这种方法在这条管道中用各种 C.elegans 菌株生长样品,因为新的感兴趣菌株可以很容易地使用这条管道进行处理。
作者没有什么可透露的。
我们感谢爱迪生实验室的成员对这份手稿的有益讨论和反馈;特别是B.M加西亚一些菌株由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室(P40 OD010440)和CENDR提供,后者由NSF生活收藏CSBR 1930382资助。这项工作得到了国家卫生研究院(U2CES030167)的资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |
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