Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Zusammenfassung

Um Caenorhabditis elegans (C. elegans) in der Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Würmern zu generieren, bei denen eine einzelne Probe plattformübergreifend für vergleichende Analysen gemessen werden kann. Hier wird eine Methode vorgestellt, um C. elegans Populationen auf großräumigen Kulturplatten (LSCPs) zu kulturieren und das Bevölkerungswachstum zu dokumentieren.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) war und ist ein wertvoller Modellorganismus zur Untersuchung von Entwicklungsbiologie, Alterung, Neurobiologie und Genetik. Die umfangreiche Arbeit an C. elegans macht es zu einem idealen Kandidaten, um es in großpopulationige Ganztierstudien zu integrieren, um die komplexen biologischen Komponenten und ihre Beziehungen zu einem anderen Organismus zu sezieren. Um C. elegans in der kollaborativen -Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Tieren zu generieren, bei denen eine einzelne Probe auf verschiedene Plattformen für vergleichende Analysen aufgeteilt und analysiert werden kann.

Hier wird eine Methode zur Kultur und Sammlung einer reichlich vorhandenen C. elegans-Population im Mischstadium auf einer großräumigen Kulturplatte (LSCP) und anschließenden phänotypischen Daten vorgestellt. Diese Pipeline liefert eine ausreichende Anzahl von Tieren, um phänotypische und Populationsdaten zu sammeln, zusammen mit allen Daten, die für -Omics-Experimente benötigt werden (d. H. Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik). Darüber hinaus erfordert die LSCP-Methode eine minimale Manipulation der Tiere selbst, weniger Vorbereitungszeit für den Benutzer, bietet eine strenge Umweltkontrolle und stellt sicher, dass die Handhabung jeder Probe während der gesamten Studie konsistent ist, um die Reproduzierbarkeit insgesamt zu gewährleisten. Schließlich werden Methoden zur Dokumentation der Populationsgröße und Populationsverteilung von C. elegans Lebensstadien in einem gegebenen LSCP vorgestellt.

Einleitung

C. elegans ist ein kleiner freilebender Fadenwurm, der auf der ganzen Welt in einer Vielzahl von natürlichen Lebensräumen vorkommt¹. Seine relative Leichtigkeit des Wachstums, schnelle Generationszeit, Reproduktionssystem und transparenter Körper machen es zu einem leistungsstarken Modellorganismus, der in entwicklungsbiologischer, alternder, neurobiologischer und genetik weit verbreiteter^2,3untersucht wurde. Die umfangreichen Arbeiten zu C. elegans machen es zu einem Hauptkandidaten für -omics-Studien, um Phänotypen umfassend mit komplexen biologischen Komponenten und ihren Beziehungen in einem bestimmten Organismus zu verknüpfen.

Um C. elegans in der kollaborativen -Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große gemischtstufige Populationen von Tieren zu generieren, bei denen eine einzelne Probe aufgeteilt und über verschiedene Plattformen und Instrumente für vergleichende Analysen verwendet werden kann. Die Erstellung einer Pipeline zur Generierung einer solchen Stichprobe erfordert ein ausgeprägtes Bewusstsein für Ernährung, Umwelt, Stress, Bevölkerungsstruktur sowie Probenhandhabung und -sammlung. Daher ist es entscheidend, standardisierte und reproduzierbare Kultivierungsbedingungen in große Rohrleitungen zu integrieren. In der Forschung von C. elegans werden zwei traditionelle Methoden verwendet, um Würmer zu züchten - Agar-Petrischalen und Flüssigenkultur⁴.

Historisch gesehen, wenn große Mengen von C. elegans benötigt werden, werden sie in flüssiger Kultur angebaut⁴. Die Schritte, die an der Erzeugung einer großen Population von Würmern in flüssiger Kultur beteiligt sind, erfordern mehrere Handhabungsschritte, die oft eine Bleichsynchronisation beinhalten, um gravidierte erwachsene Nagelhaut zu reißen und Embryonen freizusetzen, um die gewünschte Populationsgröße zu erreichen. Wenn jedoch Bleichsynchronisation verwendet wird, hängt das Bevölkerungswachstum von der Größe der Beginnenden Volkszählung ab und wirkt sich daher auf das nachfolgende Wachstum und die Bevölkerungszahlen aus. Darüber hinaus variieren C. elegans-Stämme in ihrer Nagelhautempfindlichkeit, Expositionszeit und Stressreaktion auf Bleichmittelsynchronisation, was es schwierig^macht,viele Stämme gleichzeitig zu bestimmen⁵,^6,7,8,9.

Darüber hinaus erfordert das Wurmwachstum in flüssiger Kultur ein paar Transferschritte, da es oft empfohlen wird, vor der Ernte nur eine Generation von Würmern anzubauen, da eine Überfüllung leicht auftreten kann, wenn sie über mehrere Generationen angebaut wird und trotz der Anwesenheit von Nahrung zu einer dauerhaften Bildung führt¹⁰. Dauerbildung erfolgt durch kleine Signalmoleküle wie Ascaroside, oft als "Dauerpheromone" bezeichnet^11,12,13,14, werden in flüssige Medien freigesetzt und beeinflussen das Wachstum der Bevölkerung. Darüber hinaus führt das Wachstum großer Wurmpopulationen in flüssiger Kultur zu einer übermäßigen Bakterienansammlung in der Kultur, was zu Schwierigkeiten führt, wenn eine saubere Probe für nachgeschaltete phänotypische Assays benötigt wird. Schließlich, wenn eine flüssige Kultur kontaminiert wird, ist es schwieriger zu erhalten, da Pilzsporen oder Bakterienzellen leicht in den Medien verteilt werden¹⁵.

Die andere traditionelle Methode des Anbaus von C. elegans ist auf Agar Petrischalen. Kommerziell erhältliche Petrischalen ermöglichen es, problemlos mehrere Generationen von Würmern im gemischten Stadium zu züchten, ohne die schnellen Auswirkungen von Überfüllung und hoher Dauerbildung, wie sie in flüssigen Kulturen beobachtet werden. Ein Nachteil des Wurmwachstums auf herkömmlichen Agar-Petrischalen ist jedoch, dass die größte kommerziell erhältliche Petrischale keine großen Wurmpopulationen für eine -omics-Studie liefert, ohne einen Bleichmittelsynchronisationsschritt hinzuzufügen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kultivierung von Populationen von C. elegans im gemischten Stadium auf Agar-Petrischalen besser geeignet ist, um -omics-Daten zu sammeln, aber wir benötigten eine Methode, um sehr große Populationsgrößen ohne flüssige Kultivierung zu erzeugen.

Hier stellen wir eine Methode vor, um große C. elegans-Populationen im gemischten Stadium auf großräumigen Kulturplatten (LSCP) zu kulturieren und zu sammeln. Das Sammeln von Proben durch diese Pipeline liefert genügend Proben, um phänotypische und Populationsdaten zu sammeln, zusammen mit allen Daten, die für -Omics-Experimente benötigt werden(z. B.Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik). Darüber hinaus erfordert die LSCP-Methode eine minimale Manipulation der Tiere, weniger Vorbereitungszeit für den Benutzer, bietet eine strenge Umweltkontrolle und stellt sicher, dass die Handhabung jeder Probe während der gesamten Studie konsistent ist, um die Reproduzierbarkeit insgesamt zu gewährleisten.