通过流式细胞术和过继转移对肿瘤浸润髓细胞进行功能分析

摘要

该方案在小鼠皮内或皮下肿瘤模型中提供了可靠的实体瘤解离和髓样细胞分离方法。流式细胞术允许对肿瘤微环境中的异质髓系细胞群进行表型表征，分选将证明它们在过继转移背景下的功能。

摘要

肿瘤浸润髓系细胞区室代表广泛免疫抑制细胞的异质性群体，这些细胞已被肿瘤利用以支持其生长。它们在肿瘤和次级淋巴组织中的积累导致抗肿瘤免疫反应的抑制，因此是治疗干预的靶点。众所周知，局部细胞因子环境可以决定肿瘤浸润髓系细胞的功能编程，因此已经设计了纵肿瘤微环境 （TME） 以表达更有利于抗肿瘤髓系细胞活性的细胞因子景观的策略。为了评估治疗诱导的肿瘤浸润髓系细胞的变化，本文将概述从实体瘤荷瘤小鼠中分离皮内/皮下肿瘤组织以准备白细胞恢复的程序。将提供流式细胞术分析策略，以便能够识别分离的白细胞内的异质性髓系细胞群并表征独特的髓系表型。最后，本文将描述一种纯化活髓细胞用于功能测定并确定它们在过继转移背景下的治疗价值的方法。

引言

肿瘤微环境 （TME） 由快速增殖的肿瘤细胞和周围的异质性基质细胞区室组成。由于生长中的肿瘤通常血管化不良，因此 TME 是一个以缺氧、营养剥夺和酸中毒为独特特征的外周部位¹。为了在这种环境中生存，肿瘤应激反应和代谢重编程导致可溶性因子的分泌，这些因子促进组织重塑和血管生成，以及免疫细胞的选择性募集²。由于髓系细胞是 TME 中最丰富的造血细胞类型之一，因此人们对研究肿瘤浸润髓系细胞在 TME 中的作用越来越感兴趣。

髓系细胞是一组异质性和可塑性的先天免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞。尽管它们在组织稳态和适应性免疫反应调节中起关键作用，但它们的功能可能会两极分化，具体取决于局部微环境中激活信号的组成³。肿瘤通过 TME 内可溶性因子的分泌利用髓系细胞特性。这些替代信号可以将骨髓生成转向未成熟分化，并扭曲现有肿瘤浸润髓样细胞的功能³。事实上，TME 内的髓系细胞通常会促进癌症进展，并可以抑制抗肿瘤免疫反应，从而对癌症治疗产生不利影响。

尽管促进免疫抑制髓系细胞耗竭的治疗策略已被证明可以延缓肿瘤生长⁴，但缺乏靶标特异性可能会去除免疫刺激髓系细胞，相比之下，免疫刺激髓系细胞有助于癌症的消退。这些炎性髓系细胞可以发挥深远的抗肿瘤作用，包括直接杀死肿瘤细胞和激活细胞毒性 CD8⁺ T 细胞⁵。或者，使 TME 中髓系细胞的组成和功能正常化的策略已显示出治疗成功⁶;然而，他们向抗肿瘤表型再教育的生物学机制仍未完全了解。最终，肿瘤髓细胞的全面表征对于进一步改进癌症治疗是必要的。

不幸的是，用于髓样细胞分离的可重复肿瘤分解具有挑战性。与其他白细胞亚群相比，肿瘤来源的髓系细胞对 离体 作敏感，肿瘤加工的侵袭性会导致酶促表位切割和回收细胞的活力降低⁷。该方法的目的是提供一种可靠的肿瘤解离方法，以保持用于分析的表面标志物完整性和用于功能研究的细胞活力。与倾向于使用更苛刻的酶混合物以增强各种细胞亚群的可重复释放的肿瘤浸润白细胞 （TIL） 分离方案相比，该方法有利于更保守的酶消化以最大限度地提高髓系细胞的回收率。还提供了高水平的多色流式门控策略来识别小鼠肿瘤髓系细胞亚群，以便进一步表征和/或分选。

研究方案

注意：所有动物研究均符合加拿大动物护理委员会的指导方针，并已获得麦克马斯特大学动物研究伦理委员会的批准。

1. 肿瘤收获和解离

1. 如 Nguyen 等人所述，用 2 × 10 5 B16 黑色素瘤细胞皮内/皮下接种 6-8 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠8 在收获前让肿瘤生长 7 天。
2. 通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死，同时确保在这样做时不会破坏肿瘤。收获前用 70% 乙醇喷洒鼠标。
3. 使用手术刀和剪刀，通过手术从周围组织（包括附着的肿瘤引流淋巴结）中去除皮内/皮下肿瘤，并将肿瘤放入预先称重的微量离心管中。保持在冰上。
   注意：在动物用生物安全柜中进行肿瘤采集。对于较大的肿瘤，请使用 15 mL 锥形管。
4. 称量肿瘤，向每根试管中加入 500 μL 含 10% 胎牛血清 （FBS） 的 RPMI-1640 培养基，用剪刀将肿瘤在试管内或 6 孔板中切成小块。
   注意：肿瘤块应足够小，以便在加入消化培养基后用电动移液器混合。
5. 通过在含有 10% FBS 和 5 mM 氯化钙的 RPMI-1640 培养基中溶解 0.5 mg/mL 的 IV 型胶原酶和 0.2 mg/mL 的 DNase 来制备解离混合物。
   注：解离混合物必须新鲜制备，以最大限度地提高胶原酶活性。
6. 将切碎的肿瘤悬液转移到 15 mL 锥形管中，每 0.25 mg 肿瘤加入 10 mL 解离混合物。将试管置于温度受控的轨道振荡器中，在 37 °C 下以 200 rpm 的转速搅拌 30 分钟。通过加入两体积的含有 10% FBS 和 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 的冷 RPMI-1640 培养基来中和胶原酶活性，并在 4 °C 下冷藏 10 分钟。
7. 短暂涡旋并将悬浮液移液到 50 mL 锥形管上的 40 μm 过滤器中。使用注射器柱塞和中和介质解聚残留的肿瘤组织，并通过过滤器清洗。将悬浮液离心 5 分钟（500 × g，4 °C），弃去上清液，并将沉淀重悬于含 2% FBS 和 1 mM EDTA 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。

2. TIL 富集和流式细胞术染色 （FACS）

1. 为了富集用于髓系细胞表征的 TIL，请根据制造商的说明，使用专为生物素化 CD45.2 抗体的生物素阳性选择而设计的磁性细胞分离试剂盒（参见 材料表）。
2. 将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液（含 0.5% w/v 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBS）中，并将它们转移到 96 孔 U 形底板中。
   注：染色浓度不要超过 1 × 10⁸ 个细胞/mL。调整体积，并将样品分成多个孔以补偿高细胞数量。
3. 将板离心 5 分钟 （500 × g， 4 °C），弃去上清液。在 FACS 缓冲液中加入 50 μL Fc 封闭溶液（纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32 的 1：200 稀释液 [参见 材料表]，终浓度为 2.5 μg/mL），并通过移液重悬细胞。在 4 °C 下孵育 10 分钟。
4. 加入 50 μL 含有 2 倍浓度表面染色抗体（CD45.2、NK1.1、CD11c、F4/80、CD8a、Ly6C、CD11b、CD4、Ly6G 的 1：50 稀释液）和可固定活力染色剂（FVS，1：500 稀释）的 FACS 缓冲液，并通过移液混合细胞。在 4 °C 下孵育 20 分钟。
   注意：用铝箔盖住板，以尽量减少光照。应在实验前滴定抗体，以根据经验确定最佳稀释度。
5. 通过向每个孔中加入 200 μL FACS 缓冲液，离心悬浮液（5 分钟，500 × g，4 °C）并丢弃上清液，洗涤细胞两次。
6. 向每个孔中加入 100 μL 固定/透化溶液（参见 材料表），通过移液混合细胞，并在 4 °C 下孵育 20 分钟。
7. 向每个孔中加入 100 μL 1x 透化缓冲液（参见 材料表），将板离心 5 分钟（500 × g，4 °C），然后弃去上清液。
8. 通过向每个孔中加入 200 μL 1x 透化缓冲液来洗涤细胞，离心悬浮液（5 分钟，500 × g，4 °C），并丢弃上清液。
   注：在透化缓冲液中重悬细胞后，可以暂停实验过夜。将样品储存在 4 °C 并避光。在离心前短暂混合细胞后恢复。
9. 加入 100 μL 透化缓冲液，含有 1x 浓度的细胞内染色抗体（一氧化氮合酶 2 （NOS2）、精氨酸酶 1 （Arg1） 的 1：100 稀释液），并通过移液混合细胞。在 4 °C 下孵育 20 分钟。
   注意：用铝箔盖住板，以尽量减少光照。应在实验前滴定抗体，以根据经验确定最佳稀释度。
10. 向每个孔中加入 100 μL 1x 透化缓冲液，将板离心 5 分钟（500 × g，4 °C），然后弃去上清液。
11. 通过向每个孔中加入 200 μL 1x 透化缓冲液来洗涤细胞，离心悬浮液（5 分钟，500 × g，4 °C），并丢弃上清液。
12. 将细胞重悬于 300 μL 的 FACS 缓冲液中。在进行流式细胞术分析之前，通过带有 40 μm 过滤器盖的 5 mL 圆底聚苯乙烯管过滤样品。

3. 用于功能研究的肿瘤髓系细胞分选

1. 通过流式细胞术分析确定所需的髓系细胞群后，根据制造商的说明，使用专为 CD11b 或 CD11c 阳性选择而设计的磁性细胞分离试剂盒预富集大量髓系细胞以进行分选（参见 材料表）。
2. 使用对所需髓系细胞亚群具有特异性的表面染色抗体（CD11b、Ly6C、Ly6G 的 1：100 稀释液），如步骤 2.2-2.5 所述对预富集的细胞进行染色。
   注：包括可固定活力染色剂，以确保活髓细胞的分选。染色浓度不超过 1 × 10⁸ 个细胞/mL。调整体积，并将样品分成多个孔中以补偿高细胞数量。
3. 将细胞重悬于冷分选缓冲液（含 1% w/v BSA、25 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES） 和 1 mM EDTA 的 PBS）中。通过带有 40 μm 过滤器盖的 5 mL 圆底聚丙烯管过滤样品。将细胞放在冰上，并用铝箔覆盖试管。
   注：将细胞浓度/体积调整至所需的仪器规格以进行分选。
4. 用捕获培养基（5 mL 圆底聚丙烯管，含含 50% FBS 的 PBS）制备样品收集管。
   注：分选前用 5 mL 捕获培养基包被试管过夜。第二天，在运行样品之前，丢弃除 1-2 mL 之外的所有捕获培养基。
5. 修改分选仪设置以降低样品压力并防止液滴形成产生扰动。配备 130 μm 喷嘴尖端，并使用 10 psi 设置。以低流速运行样品，并以 100 rpm 的速度定期搅拌样品，确保液滴沉积在管的中心。分选后，将样品放在冰上。
6. 将样品在 4 °C 下孵育 10 分钟。 将试管离心 5 分钟 （500 × g，4 °C），弃去上清液，并将沉淀重悬于所需培养基中，用于功能测定或过继转移。

4. 纯化肿瘤髓系细胞的过继转移

1. 皮内接种 6-8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠，皮内接种 1 ×^{10 6} B16 黑色素瘤肿瘤细胞重悬于 30 μL PBS 中。
   注意：提前接种小鼠，使过继转移时肿瘤生长不超过 100 mm³ 。
2. 用 25 mM HEPES 和 1 mM EDTA 在 PBS 中重悬分选的肿瘤髓系细胞，浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL。通过带有 40 μm 过滤器盖的 5 mL 圆底聚苯乙烯管过滤样品。保持在冰上。
3. 用 3% 异氟醚诱导并维持小鼠麻醉。涂抹眼药膏以防止眼部干燥/受伤。
4. 在 31 G 注射器中加入 50 μL 细胞悬液。轻轻弹动注射器以去除气泡。使用酒精棉签清洁注射部位。
5. 使用无菌镊子提起肿瘤底部的皮肤。将针头以略微向上的角度插入皮下间隙，从皮肤下方进入肿瘤。使用镊子捏住针头周围的皮肤，然后慢慢分配注射器体积。继续用镊子捏住皮肤，同时慢慢取出针头，并用棉签清洁潜在的泄漏。
   注意：如果需要，请继续进行任何其他治疗。
6. 让小鼠从麻醉中恢复。

结果

结果表明，该方法从实体鼠肿瘤中产生高产量的髓样细胞。受体完整性和细胞活力的保留有助于对所需髓系亚群进行可靠的功能分析。髓系细胞分离的这些改进允许在过继性 T 细胞治疗期间使用 I 类组蛋白脱乙酰酶抑制剂 （HDACi） MS-275 使 TME 正常化后识别瘤内髓系细胞的功能变化。TIL 分离方案通常不会采取措施最大限度地提高髓样细胞产量⁹。因此，酶...

讨论

尽管肿瘤浸润髓系细胞在肿瘤内以不同的活化和分化状态存在，但已经确定了几个亚群，包括肿瘤相关树突状细胞 （TADC）、肿瘤相关中性粒细胞 （TAN）、髓源性抑制细胞 （MDSC） 和肿瘤相关巨噬细胞 （TAM）¹²。不幸的是，用于识别这些髓系细胞亚群的细胞表面标志物的重叠表达使得目前难以将肿瘤髓系细胞与其他髓系细胞进行表型区分^13<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated Antibody	R&D Systems	IC5868F	1:100