フローサイトメトリーと養子移植による腫瘍浸潤性骨髄細胞の機能解析

要約

このプロトコルは、マウスの皮内または皮下腫瘍モデルにおける固形腫瘍の解離および骨髄細胞の単離の信頼性の高い方法を提供します。フローサイトメトリーは、腫瘍微小環境内の不均一な骨髄系集団の表現型の特徴付けを可能にし、ソーティングは養子移植の文脈でそれらの機能を実証します。

要約

腫瘍浸潤性骨髄細胞コンパートメントは、腫瘍がその増殖を支援するために利用してきた広範な免疫抑制細胞の不均一な集団を表しています。腫瘍および二次リンパ組織へのそれらの蓄積は、抗腫瘍免疫応答の抑制につながるため、治療介入の標的です。局所的なサイトカイン環境が腫瘍浸潤性骨髄細胞の機能プログラミングを決定できることが知られているため、腫瘍微小環境(TME)を操作して、抗腫瘍骨髄細胞活性をより助長するサイトカインランドスケープを発現する戦略が考案されています。腫瘍浸潤性骨髄細胞の治療誘発性変化を評価するために、この論文では、白血球の回復に備えて固形担がんマウスから皮内/皮下腫瘍組織を解離する手順を概説します。フローサイトメトリー解析の戦略は、単離された白血球内の不均一な骨髄集団の同定と、ユニークな骨髄表現型の特性評価を可能にするために提供されます。最後に、この論文では、機能アッセイのために生存可能な骨髄細胞を精製し、養子縁組の文脈でそれらの治療的価値を決定する方法について説明します。

概要

腫瘍微小環境(TME)は、急速に増殖する腫瘍細胞と周囲の不均一な間質細胞コンパートメントで構成されています。成長中の腫瘍は血管新生が不十分な場合が多いため、TMEは低酸素症、栄養欠乏、およびアシドーシス1を特徴とする独自の末梢部位^です。この状況で生き残るために、腫瘍のストレス応答と代謝のリプログラミングは、組織のリモデリングと血管新生を促進する可溶性因子の分泌と、免疫細胞の選択的動員をもたらします²。骨髄細胞はTMEで最も豊富な造血細胞の1つであるため、TMEにおける腫瘍浸潤性骨髄細胞の役割を調べることへの関心が高まっています。

骨髄系細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などの自然免疫細胞の不均一で可在なグループです。それらは組織の恒常性維持と適応免疫応答調節に重要な役割を果たしていますが、その機能は局所微小環境内の活性化シグナルの構成によっては分極する可能性があります³。腫瘍は、TME内の可溶性因子の分泌を通じて骨髄細胞の特性を利用します。これらの代替シグナルは、骨髄造成を未熟な分化に向け、既存の腫瘍浸潤性骨髄細胞の機能を歪める可能性があります³。実際、TME内の骨髄細胞は、がんの進行を促進し、抗腫瘍免疫応答を抑制することが多く、がん治療に悪影響を及ぼす可能性があります。

免疫抑制性骨髄細胞の枯渇を促進する治療戦略は、腫瘍の成長を遅らせることが示されている⁴が、標的特異性の欠如は免疫刺激性骨髄細胞の除去を危険にさらし、対照的に、がんの解決を助ける。これらの炎症性骨髄系細胞は、腫瘍細胞の直接的な死滅や細胞傷害性CD8⁺ T細胞の活性化など、大きな抗腫瘍効果を発揮することができます⁵。あるいは、TMEにおける骨髄系細胞の組成と機能を正常化する戦略は、治療の成功を示しています⁶。しかし、抗腫瘍表現型に向けた彼らの再教育の根底にある生物学的メカニズムは、まだ完全には理解されていません。最終的には、がん治療のさらなる改善のためには、腫瘍骨髄細胞の包括的な特性評価が必要です。

残念ながら、骨髄系細胞単離のための腫瘍の再現性のある脱凝集は困難です。腫瘍由来骨髄系細胞は、他の白血球サブセットと比較して ex vivo 操作に敏感であり、腫瘍プロセシングの攻撃性は、酵素エピトープの切断と回復した細胞の生存率の低下につながる可能性があります⁷。この方法の目的は、分析のための表面マーカーの完全性と機能研究のための細胞の活力を維持するための腫瘍解離の信頼できる手段を提供することです。腫瘍浸潤性白血球(TIL)単離プロトコルでは、さまざまな細胞サブセットの再現性のある放出を促進するために、より厳しい酵素ミックスが好まれるのに対し、この方法は骨髄細胞の回収を最大化するために、より保存的な酵素消化を好みます。また、マウス腫瘍骨髄系細胞サブセットを同定し、さらなる特性評価やソーティングを行うためのハイレベルなマルチカラーフローゲーティング戦略も提供されています。

プロトコル

注:すべての動物実験は、カナダ動物管理評議会のガイドラインに準拠し、マクマスター大学の動物研究倫理委員会によって承認されました。

1. 腫瘍の採取と解離

1. Nguyenらによって記載されたように、6〜8週齢の雌、C57BL / 6マウスに皮内/皮下×2^{10 5} B16メラノーマ細胞を接種します。
2. 子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させますが、その際に腫瘍を破壊しないように注意してください。収穫する前に、マウスに70%エタノールをスプレーします。
3. メスとハサミを使用して、周囲の組織(付着した腫瘍排出リンパ節を含む)から皮内/皮下腫瘍を外科的に切除し、腫瘍を事前に計量したマイクロチューブに入れます。氷の上を保ってください。
   注:腫瘍採取は、動物用バイオセーフティキャビネットで行ってください。より大きな腫瘍には15mLの円錐形チューブを使用してください。
4. 腫瘍の重量を量り、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI-1640培地500μLを各チューブに加え、ハサミを使用して腫瘍をチューブ内または6ウェルプレートで小さく切断します。
   注:腫瘍片は、消化培地が追加された後に電動ピペッターで混合できるほど小さくなければなりません。
5. コラゲナーゼIV型を0.5 mg/mLで、DNaseを0.2 mg/mLでRPMI-1640培地に溶解し、10% FBSおよび5 mM塩化カルシウムを用いて解離ミックスを調製します。
   注:解離ミックスは、コラゲナーゼ活性を最大化するために新鮮に調製する必要があります。
6. みじん切りにした腫瘍懸 ?? 液を15 mLのコニカルチューブに移し、腫瘍0.25 mgあたり10 mLの解離ミックスを追加します。.チューブを温度制御されたオービタルシェーカーに30分間、37°Cで200rpmの攪拌で置きます。コラゲナーゼ活性を中和するには、10% FBSと2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む2容量の冷冷RPMI-1640培地を加え、4°Cで10分間冷蔵します。
7. 懸濁液を短時間ボルテックスし、50mLの円錐管上の40μmのストレーナーにピペットで移します。シリンジプランジャーと中和剤を使用して、残存腫瘍組織を分解し、ストレーナーで洗浄します。懸濁液を5分間(500 × g、4°C)遠心分離し、上清を廃棄し、2% FBSおよび1 mM EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にペレットを再懸濁します。

2. TIL濃縮およびフローサイトメトリー染色(FACS)

1. 骨髄系細胞の特性評価のためにTILを濃縮するには、製造元の指示に従って、ビオチン化CD45.2抗体を用いたビオチン陽性選択用に設計された磁気細胞分離キットを使用します( 材料表を参照)。
2. 細胞を200 μLのFACSバッファー(PBSと0.5% w/vウシ血清アルブミン(BSA))に再懸濁し、96ウェルU底プレートに移します。
   注:染色濃度が1 × 10⁸細胞/mLを超えないようにしてください。容量を調整し、サンプルを複数のウェルに分割して、高いセル数を補正します。
3. プレートを5分間(500 × g、4°C)遠心分離し、上清を捨てます。50 μLのFcブロック溶液(精製ラット抗マウスCD16/CD32の1:200希釈、最終濃度2.5 μg/mL)をFACS緩衝液に添加し、ピペッティングで細胞を再懸濁します。4°Cで10分間インキュベートします。
4. 2倍濃度の表面染色抗体(CD45.2、NK1.1、CD11c、F4/80、CD8a、Ly6C、CD11b、CD4、Ly6Gを1:50希釈)および固定生存率染色(FVS、1:500希釈)を含むFACSバッファー50μLを加え、ピペッティングで細胞を混合します。4°Cで20分間インキュベートします。
   注意: 光への露出を最小限に抑えるために、プレートをアルミホイルで覆います。抗体は、最適な希釈を経験的に決定するために、実験の前に滴定する必要があります。
5. 各ウェルに200 μLのFACSバッファーを添加し、懸濁液を遠心分離(5分間、500 × g、4°C)して細胞を2回洗浄し、上清を捨てます。
6. 各ウェルに100 μLの固定/透過化溶液( 材料表を参照)を加え、ピペッティングで細胞を混合し、4°Cで20分間インキュベートします。
7. 100 μLの1x透過化バッファー( 材料表を参照)を各ウェルに加え、プレートを5分間(500 × g、4°C)遠心分離し、上清を捨てます。
8. 各ウェルに200 μLの1x透過化バッファーを加え、懸濁液を遠心分離(5分間、500 × g、4°C)して細胞を洗浄し、上清を捨てます。
   注:実験は、細胞を透過化バッファーに再懸濁した後、一晩中断することができます。サンプルは4°Cで保存し、光から保護してください。遠心分離する前に細胞を短時間混合した後、再開します。
9. 1倍濃度の細胞内染色抗体(一酸化窒素合成酵素2(NOS2)、アルギナーゼ1(Arg1)を1:100希釈)含む透過化緩衝液100μLを加え、ピペッティングで細胞を混合します。4°Cで20分間インキュベートします。
   注意: 光への露出を最小限に抑えるために、プレートをアルミホイルで覆います。抗体は、最適な希釈を経験的に決定するために、実験の前に滴定する必要があります。
10. 各ウェルに100 μLの1x透過化バッファーを加え、プレートを5分間(500 × g、4°C)遠心分離し、上清を捨てます。
11. 各ウェルに200 μLの1x透過化バッファーを加え、懸濁液を遠心分離(5分、500 × g、4°C)して細胞を洗浄し、上清を捨てます。
12. 細胞を300 μLのFACSバッファーに再懸濁します。フローサイトメトリー解析を行う前に、40 μmのストレーナキャップが付いた5 mLの丸底ポリスチレンチューブでサンプルをろ過します。

3. 機能研究のための腫瘍骨髄細胞の選別

1. フローサイトメトリー分析により目的の骨髄系細胞集団を同定した後、CD11bまたはCD11c陽性選択用に設計された磁気細胞分離キットを用いて、調製用のバルク骨髄細胞を事前に濃縮します( 材料表を参照)。
2. 目的の骨髄系細胞サブセット(CD11b、Ly6C、Ly6Gの1:100希釈)に特異的な表面染色抗体を使用して、ステップ2.2〜2.5で説明したように、事前に濃縮した細胞を染色します。
   注:生骨髄細胞の選別を確実にするために、固定可能な生存率染色剤を含めます。染色濃度が1 × 10⁸ 細胞/mLを超えないようにしてください。容量を調整し、サンプルを複数のウェルに分割して、高い細胞数を補正します。
3. 細胞をコールドソーティングバッファー(PBS、1% w/v BSA、25 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、および1 mM EDTA)に再懸濁します。40 μmのストレーナーキャップが付いた5 mLの丸底ポリプロピレンチューブでサンプルをろ過します。セルを氷上に置き、チューブをアルミホイルで覆います。
   注:細胞/容量の濃度を、ソーティングのために目的の装置仕様に調整します。
4. 捕捉培地(50% FBS含有PBSを含む5 mL丸底ポリプロピレンチューブ)を含むサンプル収集チューブを調製します。
   注:ソーティング前に、チューブを5 mLの捕捉培地で一晩コーティングします。サンプルを分析する前に、翌日に1〜2mLを除くすべてのキャプチャー培地を廃棄します。
5. ソーター装置の設定を変更して、サンプル圧力を下げ、液滴形成の摂動を防ぎます。130μmのノズルチップを装備し、10psiの設定を利用します。100 rpmで定期的にサンプルを攪拌しながら低流量でサンプルを流し、液滴の堆積がチューブの中心にあることを確認します。選別後、サンプルを氷の上に保ちます。
6. サンプルを4°Cで10分間インキュベートします。 チューブを5分間(500 × g、4°C)遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを目的の培地に再懸濁して、機能アッセイまたは養子移しを行います。

4. 精製腫瘍骨髄細胞の養子移植

1. 生後6〜8週齢の雌、C57BL / 6マウスに、30μLのPBSに再懸濁した1×10⁶ B16メラノーマ腫瘍細胞を皮内に接種します。
   注:養子縁組の移植時までに腫瘍の成長が100 mm³ を超えないように、事前にマウスに接種してください。
2. 選別した腫瘍骨髄細胞を、25 mM HEPESおよび1 mM EDTAを使用してPBSに再懸濁し、2 × 10⁶ 細胞/ mLの濃度で再懸濁します。40 μmのストレーナキャップが付いた5 mLの丸底ポリスチレンチューブでサンプルをろ過します。氷の上を保ってください。
3. マウスを3%イソフルランで麻酔下で誘導し、維持します。眼の乾燥/損傷を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。.
4. 31 Gシリンジに50 μLの細胞懸濁液をロードします。シリンジを静かにフリックして気泡を取り除きます。アルコール綿棒を使用して注射部位を清掃します。
5. 滅菌鉗子を使用して、腫瘍の基部にある皮膚を持ち上げます。針をわずかに上向きの角度で皮下腔に挿入して、皮膚の下から腫瘍に入ります。鉗子を使用して針の周囲の皮膚をつまみ、シリンジの量をゆっくりと分配します。針をゆっくりと取り外しながら、鉗子で皮膚をつまみ続け、綿棒を使用して漏れの可能性を洗います。
   注:必要に応じて、追加の治療治療を進めてください。.
6. マウスが麻酔から回復するのを待ちます。

結果

この結果は、この方法が固形マウス腫瘍から骨髄系細胞を高収率で生成することを示しています。受容体の完全性と細胞生存率の維持により、目的の骨髄サブセットの信頼性の高い機能解析が容易になります。骨髄細胞単離のこれらの改善により、養子T細胞療法中にクラスIヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACi)であるMS-275でTMEを正常化すると、腫瘍内骨髄細胞の変...

ディスカッション

腫瘍浸潤性骨髄細胞は、腫瘍内でさまざまな活性化および分化状態で存在するが、腫瘍関連DC(TADC)、腫瘍関連好中球(TAN)、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、および腫瘍関連マクロファージ(TAM)など、いくつかのサブセットが同定されている¹²。残念ながら、これらの骨髄系細胞サブセットを同定するために使用される細胞表面マーカーの発現が重複し?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated Antibody	R&D Systems	IC5868F	1:100