Análisis funcional de células mieloides infiltrantes de tumores mediante citometría de flujo y transferencia adoptiva

Resumen

Este protocolo proporciona métodos fiables de disociación de tumores sólidos y aislamiento de células mieloides en modelos tumorales intradérmicos o subcutáneos murinos. La citometría de flujo permite la caracterización fenotípica de poblaciones mieloides heterogéneas dentro del microambiente tumoral y la clasificación demostrará su funcionalidad en el contexto de la transferencia adoptiva.

Resumen

El compartimento de células mieloides infiltrantes del tumor representa una población heterogénea de células inmunosupresoras amplias que han sido explotadas por el tumor para apoyar su crecimiento. Su acumulación en el tejido tumoral y linfoide secundario conduce a la supresión de las respuestas inmunitarias antitumorales y, por lo tanto, es un objetivo para la intervención terapéutica. Como se sabe que el entorno local de citocinas puede dictar la programación funcional de las células mieloides infiltrantes de tumores, se han ideado estrategias para manipular el microambiente tumoral (TME) para expresar un paisaje de citocinas más propicio para la actividad de las células mieloides antitumorales. Para evaluar los cambios inducidos por la terapia en las células mieloides infiltrantes de tumores, este artículo describirá el procedimiento para disociar el tejido tumoral intradérmico/subcutáneo de ratones portadores de tumores sólidos en preparación para la recuperación de leucocitos. Se proporcionarán estrategias para el análisis de citometría de flujo que permitan la identificación de poblaciones mieloides heterogéneas dentro de leucocitos aislados y la caracterización de fenotipos mieloides únicos. Por último, en este artículo se describirá un medio para purificar células mieloides viables para ensayos funcionales y determinar su valor terapéutico en el contexto de la transferencia adoptiva.

Introducción

El microambiente tumoral (TME) está compuesto por células neoplásicas que proliferan rápidamente y un compartimento heterogéneo de células estromales circundantes. Dado que los tumores en crecimiento suelen estar mal vascularizados, la EMT es un sitio periférico caracterizado únicamente por hipoxia, privación de nutrientes y acidosis¹. Para sobrevivir en este panorama, las respuestas al estrés tumoral y la reprogramación metabólica dan como resultado la secreción de factores solubles que promueven la remodelación tisular y la angiogénesis, así como el reclutamiento selectivo de células inmunitarias². Dado que las células mieloides son uno de los tipos más abundantes de células hematopoyéticas en la TME, existe un creciente interés en examinar el papel de las células mieloides infiltrantes de tumores en la TME.

Las células mieloides son un grupo heterogéneo y plástico de células inmunitarias innatas que incluyen monocitos, macrófagos, células dendríticas y granulocitos. Aunque tienen un papel crítico en la homeostasis de los tejidos y en la regulación de la respuesta inmunitaria adaptativa, su función puede ser polarizante en función de la composición de las señales de activación dentro del microambiente local³. Los tumores se benefician de las características de las células mieloides a través de la secreción de factores solubles dentro de la TME. Estas señales alternativas pueden desviar la mielopoyesis hacia la diferenciación inmadura y sesgar la función de las células mieloides infiltrantes de tumores existentes³. De hecho, las células mieloides dentro de la TME a menudo promueven la progresión del cáncer y pueden suprimir las respuestas inmunitarias antitumorales, lo que provoca efectos adversos en la terapia contra el cáncer.

Aunque se ha demostrado que las estrategias terapéuticas que promueven el agotamiento de las células mieloides inmunosupresoras retrasan el crecimiento^{tumoral 4}, la falta de especificidad de la diana pone en riesgo la eliminación de las células mieloides inmunoestimuladoras, que, por el contrario, ayudan a la resolución del cáncer. Estas células mieloides inflamatorias pueden ejercer profundos efectos antitumorales, incluida la destrucción directa de células tumorales y la activación de células T CD8⁺ citotóxicas⁵. Por otra parte, las estrategias que normalizan la composición y función de las células mieloides en el TME han mostrado éxito terapéutico⁶; Sin embargo, los mecanismos biológicos que subyacen a su reeducación hacia un fenotipo antitumoral aún no se han comprendido completamente. En última instancia, es necesaria una caracterización completa de las células mieloides tumorales para mejorar aún más el tratamiento del cáncer.

Desafortunadamente, la desagregación reproducible de tumores para el aislamiento de células mieloides es un desafío. Las células mieloides derivadas de tumores son sensibles a la manipulación ex vivo en comparación con otros subconjuntos de leucocitos, y la agresividad del procesamiento tumoral puede conducir a la escisión enzimática del epítopo y a una reducción de la viabilidad de las células recuperadas⁷. El propósito de este método es proporcionar un medio confiable de disociación tumoral para preservar la integridad del marcador de superficie para el análisis y la vitalidad celular para el estudio funcional. En comparación con los protocolos de aislamiento de leucocitos infiltrantes tumorales (TIL) que favorecen mezclas enzimáticas más duras para mejorar la liberación reproducible de varios subconjuntos celulares, este método favorece una digestión enzimática más conservadora para maximizar la recuperación de las células mieloides. También se proporcionan estrategias de compuerta de flujo multicolor de alto nivel para identificar subconjuntos de células mieloides tumorales murinas para su posterior caracterización y/o clasificación.

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Protocolo

NOTA: Todos los estudios en animales cumplieron con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados por la Junta de Ética de Investigación Animal de la Universidad McMaster.

1. Recolección y disociación tumoral

1. Inocular a ratones hembra C57BL/6 de 6-8 semanas de edad por vía intradérmica/subcutánea con 2 células de melanoma × 10⁵ B16 según lo descrito por Nguyen et ^al.8 Permita que los tumores crezcan durante 7 días antes de la recolección.
2. Eutanasia al ratón por dislocación cervical mientras se asegura de no interrumpir el tumor al hacerlo. Rocíe el ratón con etanol al 70% antes de cosechar.
3. Con un bisturí y unas tijeras, extirpe quirúrgicamente el tumor intradérmico/subcutáneo del tejido circundante (incluidos los ganglios linfáticos adheridos que drenan el tumor) y coloque los tumores en un tubo de microfuga previamente pesado. Mantener en hielo.
   NOTA: Realice la recolección de tumores en un gabinete de bioseguridad para uso animal. Use un tubo cónico de 15 ml para tumores más grandes.
4. Pesar los tumores y agregar 500 μL de medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino (FBS) a cada tubo, usando tijeras para cortar los tumores en pedazos pequeños dentro del tubo o en una placa de 6 pocillos.
   NOTA: Las piezas tumorales deben ser lo suficientemente pequeñas como para ser mezcladas por una pipeta eléctrica una vez que se haya agregado el medio de digestión.
5. Prepare la mezcla de disociación disolviendo colagenasa tipo IV a 0,5 mg/mL y DNasa a 0,2 mg/mL en medio RPMI-1640 con 10% de FBS y 5 mM de cloruro de calcio.
   NOTA: La mezcla de disociación debe prepararse fresca para maximizar la actividad de la colagenasa.
6. Transfiera la suspensión tumoral picada a un tubo cónico de 15 mL y agregue 10 mL de mezcla de disociación por 0,25 mg de tumor. Coloque el tubo en un agitador orbital con control de temperatura durante 30 min a 37 °C con agitación de 200 rpm. Neutralizar la actividad de la colagenasa añadiendo dos volúmenes de medio frío RPMI-1640 con 10% de FBS y 2 mM de ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA), y refrigerar durante 10 min a 4 °C.
7. Realice un vórtice breve y pipetee la suspensión en un filtro de 40 μm en un tubo cónico de 50 mL. Use un émbolo de jeringa y un medio neutralizante para disgregar el tejido tumoral residual y lávelo a través del colador. Centrifugar la suspensión durante 5 min (500 × g, 4 °C), desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2% de FBS y 1 mM de EDTA.

2. Enriquecimiento de TIL y tinción por citometría de flujo (FACS)

1. Para enriquecer los TIL para la caracterización de células mieloides, utilice un kit de separación de células magnéticas diseñado para la selección de biotina positiva con anticuerpos CD45.2 biotinilados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS (PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% p/v) y transfiéralas a una placa de fondo en U de 96 pocillos.
   NOTA: No exceda una concentración de tinción de 1 × 10⁸ células/mL. Ajuste el volumen y divida las muestras en varios pocillos para compensar el alto número de celdas.
3. Centrifugar la placa durante 5 min (500 × g, 4 °C) y desechar el sobrenadante. Añadir 50 μL de solución en bloque de Fc (dilución 1:200 de CD16/CD32 anti-ratón de rata purificado [ver la Tabla de Materiales] en tampón FACS, concentración final de 2,5 μg/mL), y resuspender las células mediante pipeteo. Incubar durante 10 min a 4 °C.
4. Añadir 50 μL de tampón FACS que contiene una concentración 2x de anticuerpo que teñe la superficie (dilución 1:50 de CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) y tinción de viabilidad fijable (FVS, dilución 1:500), y mezclar las células mediante pipeteo. Incubar durante 20 min a 4 °C.
   NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Los anticuerpos deben valorarse antes del experimento para determinar empíricamente la dilución óptima.
5. Lave las células dos veces añadiendo 200 μL de tampón FACS a cada pocillo, centrifugando la suspensión (5 min, 500 × g, 4 °C) y desechando el sobrenadante.
6. Añadir 100 μL de solución de fijación/permeabilización (ver la Tabla de Materiales) a cada pocillo, mezclar las células por pipeteo e incubar durante 20 min a 4 °C.
7. Añada 100 μL de tampón de permeabilización 1x (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo, centrifugue la placa durante 5 min (500 × g, 4 °C) y deseche el sobrenadante.
8. Lave las células añadiendo 200 μL de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo, centrifugando la suspensión (5 min, 500 × g, 4 °C) y desechando el sobrenadante.
   NOTA: El experimento se puede pausar durante la noche después de volver a suspender las células en el tampón de permeabilización. Almacene la muestra a 4 °C y protéjala de la luz. Reanude después de mezclar brevemente las células antes de centrifugar.
9. Añadir 100 μL de tampón de permeabilización que contenga 1x concentración de anticuerpo de tinción intracelular (dilución 1:100 de óxido nítrico sintasa 2 (NOS2), arginasa 1 (Arg1)), y mezclar las células mediante pipeteo. Incubar durante 20 min a 4 °C.
   NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Los anticuerpos deben valorarse antes del experimento para determinar empíricamente la dilución óptima.
10. Añada 100 μL de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo, centrifugue la placa durante 5 min (500 × g, 4 °C) y deseche el sobrenadante.
11. Lavar las células añadiendo 200 μL de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo, centrifugando la suspensión (5 min, 500 × g, 4 °C) y desechando el sobrenadante.
12. Vuelva a suspender las células en 300 μL de tampón FACS. Filtre la muestra a través de un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL con tapón de filtro de 40 μm antes de realizar el análisis de citometría de flujo.

3. Clasificación de células mieloides tumorales para estudios funcionales

1. Después de identificar las poblaciones de células mieloides deseadas mediante un análisis de citometría de flujo, enriquezca previamente las células mieloides a granel para clasificarlas con un kit de separación de células magnéticas diseñado para la selección de CD11b o CD11c positivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Utilizando anticuerpos de tinción de superficie específicos para los subconjuntos de células mieloides deseados (dilución 1:100 de CD11b, Ly6C, Ly6G), tiñe las células preenriquecidas como se describe en los pasos 2.2-2.5.
   NOTA: Incluya una tinción de viabilidad fijable para garantizar la clasificación de las células mieloides vivas. No exceda una concentración de tinción de 1 × 10⁸ células/mL. Ajuste el volumen y divida las muestras en varios pocillos para compensar el alto número de celdas.
3. Vuelva a suspender las células en un tampón de clasificación en frío (PBS con 1% p/v de BSA, 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES) y 1 mM de EDTA). Filtre la muestra a través de un tubo de polipropileno de fondo redondo de 5 mL con un tapón colador de 40 μm. Mantenga las celdas en hielo y cubra el tubo con papel de aluminio.
   NOTA: Ajuste la concentración de células/volumen a la especificación deseada del instrumento para la clasificación.
4. Prepare un tubo de recolección de muestras con medio de captura (tubo de polipropileno de fondo redondo de 5 mL que contiene PBS con 50% de FBS).
   NOTA: Cubra los tubos con medio de captura de 5 mL durante la noche antes de clasificarlos. Deseche todo menos 1-2 mL del medio de captura al día siguiente antes de analizar la muestra.
5. Modifique la configuración del instrumento clasificador para disminuir la presión de la muestra y evitar perturbaciones en la formación de gotas. Equipe la punta de la boquilla de 130 μm y utilice la configuración de 10 psi. Ejecute la muestra a un caudal bajo con agitación periódica de la muestra a 100 rpm, asegurándose de que la deposición de gotas esté en el centro del tubo. Después de la clasificación, mantenga la muestra en hielo.
6. Incubar la muestra durante 10 min a 4 °C. Centrifugar el tubo durante 5 min (500 × g, 4 °C), desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el medio deseado para ensayos funcionales o transferencia adoptiva.

4. Transferencia adoptiva de células mieloides tumorales purificadas

1. Inocular por vía intradérmica a ratones C57BL/6 hembras de 6 a 8 semanas de edad con 1 × 10⁶ células tumorales de melanoma B16 resuspendidas en 30 μL de PBS.
   NOTA: Inocular a los ratones con anticipación de manera que el crecimiento del tumor no exceda los 100^mm3 en el momento de la transferencia adoptiva.
2. Vuelva a suspender las células mieloides tumorales clasificadas en PBS con 25 mM de HEPES y 1 mM de EDTA a una concentración de 2 × 10⁶ células/mL. Filtre la muestra a través de un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL con un tapón colador de 40 μm. Mantener en hielo.
3. Inducir y mantener ratones bajo anestesia con isoflurano al 3%. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad/lesión ocular.
4. Cargue una jeringa de 31 G con 50 μL de suspensión celular. Desaloje las burbujas de aire moviendo suavemente la jeringa. Limpie el lugar de la inyección con un hisopo con alcohol.
5. Con pinzas estériles, levante la piel en la base del tumor. Inserte la aguja en el espacio subcutáneo en un ligero ángulo hacia arriba para ingresar al tumor desde debajo de la piel. Use las pinzas para pellizcar la piel que rodea la aguja y dispense lentamente el volumen de la jeringa. Continúe pellizcando la piel con las pinzas mientras retira la aguja lentamente, y use un hisopo de algodón para limpiar las posibles fugas.
   NOTA: Proceda con cualquier tratamiento terapéutico adicional si lo desea.
6. Permita que los ratones se recuperen de la anestesia.

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Resultados

Los resultados demuestran que este método produce un alto rendimiento de células mieloides procedentes de tumores murinos sólidos. La preservación de la integridad del receptor y la viabilidad celular facilita el análisis funcional fiable de los subconjuntos mieloides deseados. Estas mejoras en el aislamiento de células mieloides permitieron el discernimiento de la función cambiante de las células mieloides intratumorales tras la normalización de la TME con el inhibidor de la hi...

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Discusión

Aunque las células mieloides infiltrantes de tumores existen en diferentes estados de activación y diferenciación dentro del tumor, se han identificado varios subconjuntos, entre los que se incluyen las CD asociadas al tumor (TADC), los neutrófilos asociados al tumor (TAN), las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y los macrófagos asociados al tumor (TAM)¹². Desafortunadamente, la expresión superpuesta de los marcadores de la superficie celular ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated Antibody	R&D Systems	IC5868F	1:100