ניתוח פונקציונלי של תאים מיאלואידים חודרים לגידול על ידי ציטומטריית זרימה והעברה מאמצת

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטות אמינות לדיסוציאציה של גידול מוצק ובידוד תאים מיאלואידים במודלים של גידולים תוך-עוריים או תת עוריים של עכברים. זרימה ציטומטרית מאפשרת אפיון פנוטיפי של אוכלוסיות מיאלואידיות הטרוגניות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול ומיון ידגים את הפונקציונליות שלהן בהקשר של העברה מאמצת.

Abstract

תא התאים המיאלואידים החודר לגידול מייצג אוכלוסייה הטרוגנית של תאים מדכאי חיסון נרחבים שנוצלו על ידי הגידול כדי לתמוך בצמיחתו. הצטברותם בגידול וברקמת לימפה משנית מובילה לדיכוי תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות ולכן מהווה יעד להתערבות טיפולית. מכיוון שידוע שסביבת הציטוקינים המקומית יכולה להכתיב את התכנות התפקודי של תאים מיאלואידים חודרים לגידול, תוכננו אסטרטגיות למניפולציה של המיקרו-סביבה של הגידול (TME) כדי לבטא נוף ציטוקינים התורם יותר לפעילות תאים מיאלואידים אנטי-גידוליים. כדי להעריך שינויים הנגרמים על ידי טיפול בתאים מיאלואידים חודרים לגידול, מאמר זה יתאר את ההליך לניתוק רקמת גידול תוך-עורית/תת עורית מעכברים מוצקים נושאי גידול כהכנה להתאוששות לויקוציטים. יינתנו אסטרטגיות לניתוח זרימה ציטומטרי כדי לאפשר זיהוי של אוכלוסיות מיאלואידיות הטרוגניות בתוך לויקוציטים מבודדים ואפיון של פנוטיפים מיאלואידים ייחודיים. לבסוף, מאמר זה יתאר אמצעי לטיהור תאים מיאלואידים ברי קיימא לבדיקות תפקודיות וקביעת ערכם הטיפולי בהקשר של העברה לאימוץ.

Introduction

המיקרו-סביבה של הגידול (TME) מורכבת מתאים ניאופלסטיים המתרבים במהירות ותא תאי סטרומה הטרוגני מסביב. מכיוון שגידולים גדלים הם לרוב בעלי כלי דם גרועים, ה-TME הוא אתר היקפי המאופיין באופן ייחודי בהיפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים וחמצת¹. כדי לשרוד בנוף זה, תגובות עקה של גידול ותכנות מחדש מטבולי מביאות להפרשת גורמים מסיסים המקדמים עיצוב מחדש של רקמות ואנגיוגנזה, כמו גם גיוס סלקטיבי של תאי חיסון². מכיוון שתאים מיאלואידים הם אחד הסוגים הנפוצים ביותר של תאים המטופויאטיים ב-TME, יש עניין גובר בבחינת תפקידם של תאים מיאלואידים חודרים לגידול ב-TME.

תאים מיאלואידים הם קבוצה הטרוגנית ופלסטית של תאי חיסון מולדים כולל מונוציטים, מקרופאגים, תאים דנדריטיים וגרנולוציטים. למרות שיש להם תפקידים קריטיים בהומאוסטזיס של רקמות ובוויסות תגובה חיסונית אדפטיבית, תפקודם יכול להיות מקטב בהתאם להרכב אותות ההפעלה בתוך המיקרו-סביבה המקומית³. גידולים מנצלים את מאפייני התאים המיאלואידים באמצעות הפרשת גורמים מסיסים בתוך ה-TME. אותות חלופיים אלה יכולים להסיט מיאלופואזיס לעבר התמיינות לא בשלה ולהטות את תפקודם של תאים מיאלואידים חודרים לגידול³. ואכן, תאים מיאלואידים בתוך TME מקדמים לעתים קרובות את התקדמות הסרטן ויכולים לדכא תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות, מה שמוביל להשפעות שליליות על הטיפול בסרטן.

למרות שהוכח כי אסטרטגיות טיפוליות המקדמות את דלדול התאים המיאלואידים המדכאים את מערכת החיסון מעכבות את צמיחת הגידול⁴, היעדר ספציפיות המטרה מסכן את הסרת התאים המיאלואידים החיסוניים, אשר בניגוד לכך, מסייעים ברזולוציה של סרטן. תאים מיאלואידים דלקתיים אלה יכולים להפעיל השפעות אנטי-גידוליות עמוקות כולל הרג ישיר של תאי גידול והפעלה של תאי CD8⁺ T ציטוטוקסיים⁵. לחלופין, אסטרטגיות המנרמלות את ההרכב והתפקוד של תאים מיאלואידים ב-TME הראו הצלחה טיפולית⁶; עם זאת, המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס החינוך מחדש שלהם לפנוטיפ אנטי-גידולי עדיין לא הובנו במלואם. בסופו של דבר, אפיון מקיף של תאים מיאלואידים של הגידול נחוץ לשיפור נוסף של הטיפול בסרטן.

למרבה הצער, פירוק ניתן לשחזור של גידולים לבידוד תאים מיאלואידים הוא מאתגר. תאים מיאלואידים שמקורם בגידול רגישים למניפולציה ex vivo בהשוואה לתת-קבוצות לויקוציטים אחרות, והאגרסיביות של עיבוד הגידול עלולה להוביל למחשוף אפיטופ אנזימטי ולהפחתת הכדאיות של תאים משוחזרים⁷. מטרת שיטה זו היא לספק אמצעי אמין לדיסוציאציה של גידול כדי לשמר את שלמות סמני פני השטח לניתוח וחיוניות תאית למחקר פונקציונלי. בהשוואה לפרוטוקולי בידוד לויקוציטים חודרים לגידול (TIL) המעדיפים תערובות אנזימטיות קשות יותר כדי לשפר את השחרור הניתן לשחזור של תת-קבוצות תאיות שונות, שיטה זו מעדיפה עיכול אנזימטי שמרני יותר כדי למקסם את התאוששות התאים המיאלואידים. אסטרטגיות שער זרימה מרובות צבעים ברמה גבוהה ניתנות גם לזיהוי תת-קבוצות של תאים מיאלואידים של גידול עכברים לצורך אפיון ו/או מיון נוסף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל המחקרים בבעלי חיים עמדו בהנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי מועצת האתיקה למחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת מקמאסטר.

1. קצירת גידולים ודיסוציאציה

1. לחסן עכברים בני 6-8 שבועות, נקבה, C57BL/6 תוך עורית/תת עורית עם 2 × 10⁵ תאי מלנומה B16 כפי שתואר על ידי Nguyen et ^al.8 אפשר לגידולים לצמוח במשך 7 ימים לפני הקטיף.
2. המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם תוך הקפדה לא לשבש את הגידול בעת ביצוע פעולה זו. רססו את העכבר ב-70% אתנול לפני הקטיף.
3. בעזרת אזמל ומספריים, הסר בניתוח את הגידול התוך-עורי/תת עורי מהרקמה שמסביב (כולל בלוטות לימפה מחוברות המנקזות את הגידול), והנח את הגידולים בצינור מיקרופוגה שקול מראש. המשיכו על הקרח.
   הערה: בצע את קציר הגידול בארון בטיחות ביולוגית לשימוש בעלי חיים. השתמש בצינור חרוטי של 15 מ"ל לגידולים גדולים יותר.
4. שקלו את הגידולים, והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) לכל צינור, בעזרת מספריים כדי לחתוך את הגידולים לחתיכות קטנות בתוך הצינור או בצלחת של 6 בארות.
   הערה: חלקי הגידול צריכים להיות קטנים מספיק כדי לערבב אותם על ידי פיפטור חשמלי לאחר הוספת מדיום העיכול.
5. הכן את תערובת הדיסוציאציה על ידי המסת קולגנאז מסוג IV ב-0.5 מ"ג/מ"ל ו-DNase ב-0.2 מ"ג/מ"ל במדיום RPMI-1640 עם 10% FBS ו-5 מ"מ סידן כלורי.
   הערה: יש להכין תערובת דיסוציאציה טרייה כדי למקסם את פעילות הקולגנאז.
6. העבירו את תרחיף הגידול הטחון לצינור חרוטי של 15 מ"ל, והוסיפו 10 מ"ל תערובת דיסוציאציה לכל 0.25 מ"ג גידול. הנח את הצינור בשייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה של 200 סל"ד. נטרלו את פעילות הקולגנאז על ידי הוספת שני נפחים של מדיום RPMI-1640 קר עם 10% FBS ו-2 מ"מ חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA), ומקררים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. מערבולת קצרה ופיפטה את המתלה למסננת של 40 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מ"ל. השתמש בבוכנת מזרק ובמדיה מנטרלת כדי לפרק את רקמת הגידול הנותרת, ולשטוף אותה דרך המסננת. צנטריפוגה את התרחיף למשך 5 דקות (500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם 2% FBS ו-1 מ"מ EDTA.

2. העשרת TIL וצביעה ציטומטרית בזרימה (FACS)

1. כדי להעשיר TIL לאפיון תאים מיאלואידים, השתמש בערכת הפרדת תאים מגנטיים המיועדת לבחירה חיובית לביוטין עם נוגדנים CD45.2 ביוטיניליים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת החומרים).
2. השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS (PBS עם 0.5% w/v אלבומין בסרום בקר (BSA)), והעבירו אותם לצלחת תחתונה U של 96 בארות.
   הערה: אין לחרוג מריכוז צביעה של 1 × 10⁸ תאים/מ"ל. התאם את עוצמת הקול ופצל דגימות למספר בארות כדי לפצות על מספרי תאים גבוהים.
3. צנטריפוגה את הצלחת למשך 5 דקות (500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), והשליכו את הסופרנטנט. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת בלוק Fc (דילול של 1:200 של CD16/CD32 נגד עכבר חולדה מטוהרת [ראה טבלת החומרים) במאגר FACS, ריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל), והשהה מחדש את התאים על ידי פיפטינג. יש לדגור במשך 10 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
4. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל ריכוז פי 2 של נוגדן מכתים על פני השטח (דילול 1:50 של CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) וכתם כדאיות הניתן לתיקון (FVS, דילול 1:500), וערבב את התאים על ידי פיפטינג. יש לדגור למשך 20 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למזער את החשיפה לאור. יש לטטר נוגדנים לפני הניסוי כדי לקבוע באופן אמפירי את הדילול האופטימלי.
5. שטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר, צנטריפוגה של התרחיף (5 דקות, 500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), והשלכת הסופרנטנט.
6. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע/חדירות (ראה טבלת החומרים) לכל באר, ערבב את התאים על ידי פיפטינג ודגר במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x (ראה טבלת החומרים) לכל באר, צנטריפוגה את הצלחת למשך 5 דקות (500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), והשליך את הסופרנטנט.
8. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x לכל באר, צנטריפוגה של התרחיף (5 דקות, 500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), והשלכת הסופרנטנט.
   הערה: ניתן להשהות את הניסוי למשך הלילה לאחר השעיית התאים במאגר חדירה. אחסן את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. המשך לאחר ערבוב קצר של התאים לפני הצנטריפוגה.
9. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר חדירות המכיל ריכוז פי 1 של נוגדן צביעה תוך תאי (דילול 1:100 של תחמוצת החנקן סינתאז 2 (NOS2), ארגינאז 1 (Arg1)), וערבב את התאים על ידי פיפטינג. יש לדגור למשך 20 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למזער את החשיפה לאור. יש לטטר נוגדנים לפני הניסוי כדי לקבוע באופן אמפירי את הדילול האופטימלי.
10. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x לכל באר, צנטריפוגה את הצלחת למשך 5 דקות (500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), והשליך את הסופרנטנט.
11. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x לכל באר, צנטריפוגה של התרחיף (5 דקות, 500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), והשלכת הסופרנטנט.
12. השעו מחדש את התאים ב-300 מיקרוליטר של מאגר FACS. סנן את הדגימה דרך צינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל עם מכסה מסננת של 40 מיקרומטר לפני ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה.

3. מיון תאים מיאלואידים של גידול למחקרים פונקציונליים

1. לאחר זיהוי אוכלוסיות התאים המיאלואידים הרצויות על ידי ניתוח זרימה ציטומטרית, יש להעשיר מראש תאים מיאלואידים בתפזורת למיון עם ערכת הפרדת תאים מגנטיים המיועדת לבחירה חיובית CD11b או CD11c בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת החומרים).
2. באמצעות נוגדנים לצביעה על פני השטח הספציפיים לתת-קבוצות התאים המיאלואידיים הרצויים (דילול 1:100 של CD11b, Ly6C, Ly6G), צובעים את התאים המועשרים מראש כמתואר בשלבים 2.2-2.5.
   הערה: כלול כתם כדאיות הניתן לתיקון כדי להבטיח מיון של תאים מיאלואידים חיים. אין לחרוג מריכוז צביעה של 1 × 10⁸ תאים/מ"ל. התאם את עוצמת הקול ופצל את הדגימות למספר בארות כדי לפצות על מספרי תאים גבוהים.
3. השעו מחדש את התאים במאגר מיון קר (PBS עם 1% w/v BSA, 25 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיל-חומצה סולפונית (HEPES) ו-1 מ"מ EDTA). מסננים את הדגימה דרך צינור פוליפרופילן תחתון עגול בנפח 5 מ"ל עם מכסה מסננת של 40 מיקרומטר. שמור את התאים על קרח, וכסה את הצינור בנייר אלומיניום.
   הערה: התאם את ריכוז התאים/נפח למפרט המכשיר הרצוי למיון.
4. הכן צינור איסוף דגימות עם מדיום לכידה (צינור פוליפרופילן תחתון עגול 5 מ"ל המכיל PBS עם 50% FBS).
   הערה: מצפים צינורות עם 5 מ"ל לכידת מדיום למשך הלילה לפני המיון. השלך את כל אמצעי הלכידה מלבד 1-2 מ"ל למחרת לפני הפעלת הדגימה.
5. שנה את הגדרות מכשיר המיון כדי להפחית את לחץ הדגימה ולמנוע הפרעות בהיווצרות טיפות. צייד את קצה הזרבובית של 130 מיקרומטר, והשתמש בהגדרה של 10 psi. הפעל את הדגימה בקצב זרימה נמוך עם תסיסה תקופתית של דגימה ב-100 סל"ד, וודא שתצהיר הטיפות נמצא במרכז הצינור. לאחר המיון, שמור את הדגימה על קרח.
6. דגרו את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של הצינור למשך 5 דקות (500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס), השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיום הרצוי לבדיקות פונקציונליות או העברה לאימוץ.

4. העברה מאמצת של תאים מיאלואידים מטוהרים של גידול

1. לחסן עכברים בני 6-8 שבועות, נקבה, C57BL/6 תוך עורית עם 1 × 10⁶ תאי גידול מלנומה B16 מושעים ב-30 מיקרוליטר של PBS.
   הערה: יש לחסן עכברים מראש כך שגידול הגידול לא יעלה על 100 מ"מ³ בזמן ההעברה לאימוץ.
2. השעו מחדש את התאים המיאלואידים של הגידול הממוינים ב-PBS עם 25 מ"מ HEPES ו-1 מ"מ EDTA בריכוז של 2 ×-10⁶ תאים/מ"ל. מסננים את הדגימה דרך צינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל עם מכסה מסננת של 40 מיקרומטר. המשיכו על הקרח.
3. לגרום ולשמור על עכברים בהרדמה עם 3% איזופלורן. יש למרוח משחה עיניים למניעת יובש/פציעה בעין.
4. טען מזרק 31 גרם עם 50 מיקרוליטר של מתלה תאים. עקור בועות אוויר על ידי לחיצה עדינה על המזרק. נקה את מקום ההזרקה באמצעות ספוגית אלכוהול.
5. בעזרת מלקחיים סטריליים יש להרים את העור בבסיס הגידול. הכנס את המחט לחלל התת עורי בזווית קלה כלפי מעלה כדי להיכנס לגידול מתחת לעור. השתמש במלקחיים כדי לצבוט את העור המקיף את המחט, והוציא לאט את נפח המזרק. המשך לצבוט את העור עם המלקחיים תוך הסרת המחט לאט, והשתמש בצמר גפן כדי לנקות דליפה פוטנציאלית.
   הערה: המשך עם כל טיפול טיפולי נוסף אם תרצה.
6. אפשרו לעכברים להתאושש מההרדמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התוצאות מדגימות כי שיטה זו מייצרת תפוקה גבוהה של תאים מיאלואידים מגידולי עכברים מוצקים. שימור שלמות הקולטן והכדאיות התאית מאפשר ניתוח פונקציונלי אמין של תת-הקבוצות המיאלואידיות הרצויות. שיפורים אלה בבידוד התאים המיאלואידיים אפשרו להבחין בתפקוד המשתנה של תאים מיאלואי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

למרות שתאים מיאלואידים חודרים לגידול קיימים במצבי הפעלה והתמיינות משתנים בתוך הגידול, זוהו מספר תת-קבוצות כולל DCs הקשורים לגידול (TADCs), נויטרופילים הקשורים לגידול (TANs), תאים מדכאים שמקורם במיאלואיד (MDSCs) ומקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs)¹². למרבה הצער, הביטוי החופ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated Antibody	R&D Systems	IC5868F	1:100