Analyse fonctionnelle de cellules myéloïdes infiltrant la tumeur par cytométrie en flux et transfert adoptif

Résumé

Ce protocole fournit des méthodes fiables de dissociation des tumeurs solides et d’isolement des cellules myéloïdes dans des modèles de tumeurs murines, intradermiques ou sous-cutanées. La cytométrie en flux permet de caractériser phénotypiquement des populations myéloïdes hétérogènes au sein du microenvironnement tumoral et le tri démontrera leur fonctionnalité dans le cadre d’un transfert adoptif.

Résumé

Le compartiment cellulaire myéloïde infiltrant la tumeur représente une population hétérogène de cellules largement immunosuppressives qui ont été exploitées par la tumeur pour soutenir sa croissance. Leur accumulation dans le tissu tumoral et lymphoïde secondaire conduit à la suppression des réponses immunitaires antitumorales et constitue donc une cible d’intervention thérapeutique. Comme on sait que le milieu cytokinique local peut dicter la programmation fonctionnelle des cellules myéloïdes infiltrant la tumeur, des stratégies ont été conçues pour manipuler le microenvironnement tumoral (TME) afin d’exprimer un paysage cytokinique plus propice à l’activité des cellules myéloïdes antitumorales. Pour évaluer les changements induits par le traitement dans les cellules myéloïdes infiltrant la tumeur, cet article décrira la procédure de dissociation du tissu tumoral intradermique/sous-cutané des souris tumorales solides en préparation de la récupération des leucocytes. Des stratégies d’analyse cytométrique en flux seront fournies pour permettre l’identification de populations myéloïdes hétérogènes dans des leucocytes isolés et la caractérisation de phénotypes myéloïdes uniques. Enfin, cet article décrira un moyen de purifier des cellules myéloïdes viables pour des tests fonctionnels et de déterminer leur valeur thérapeutique dans le contexte d’un transfert adoptif.

Introduction

Le microenvironnement tumoral (TME) est composé de cellules néoplasiques à prolifération rapide et d’un compartiment cellulaire stromal hétérogène environnant. Comme les tumeurs en croissance sont souvent mal vascularisées, le TME est un site périphérique caractérisé uniquement par l’hypoxie, la privation de nutriments et l’acidose¹. Pour survivre dans ce paysage, les réponses au stress tumoral et la reprogrammation métabolique entraînent la sécrétion de facteurs solubles qui favorisent le remodelage tissulaire et l’angiogenèse ainsi que le recrutement sélectif des cellules immunitaires². Comme les cellules myéloïdes sont l’un des types de cellules hématopoïétiques les plus abondants dans le TME, il y a un intérêt croissant pour l’examen du rôle des cellules myéloïdes infiltrant la tumeur dans le TME.

Les cellules myéloïdes sont un groupe hétérogène et plastique de cellules immunitaires innées comprenant des monocytes, des macrophages, des cellules dendritiques et des granulocytes. Bien qu’ils jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie tissulaire et la régulation adaptative de la réponse immunitaire, leur fonction peut être polarisante en fonction de la composition des signaux d’activation au sein du microenvironnement local³. Les tumeurs tirent parti des caractéristiques des cellules myéloïdes grâce à la sécrétion de facteurs solubles dans le TME. Ces signaux alternatifs peuvent détourner la myélopoïèse vers une différenciation immature et fausser la fonction des cellules myéloïdes existantes infiltrant la tumeur³. En effet, les cellules myéloïdes au sein du TME favorisent souvent la progression du cancer et peuvent supprimer les réponses immunitaires antitumorales, entraînant des effets indésirables sur le traitement du cancer.

Bien qu’il ait été démontré que les stratégies thérapeutiques favorisant l’épuisement des cellules myéloïdes immunosuppressives retardent la croissance tumorale⁴, l’absence de spécificité de la cible risque l’élimination des cellules myéloïdes immunostimulantes, qui, en revanche, aident à la résolution du cancer. Ces cellules myéloïdes inflammatoires peuvent exercer des effets antitumoraux profonds, notamment la destruction directe des cellules tumorales et l’activation des lymphocytes T CD8⁺ cytotoxiques⁵. Alternativement, les stratégies normalisant la composition et la fonction des cellules myéloïdes dans l’EUT ont montré un succès thérapeutique⁶ ; Cependant, les mécanismes biologiques sous-jacents à leur rééducation vers un phénotype antitumoral n’ont pas encore été entièrement compris. En fin de compte, une caractérisation complète des cellules myéloïdes tumorales est nécessaire pour améliorer encore le traitement du cancer.

Malheureusement, la désagrégation reproductible des tumeurs pour l’isolement des cellules myéloïdes est un défi. Les cellules myéloïdes dérivées de tumeurs sont sensibles à la manipulation ex vivo par rapport à d’autres sous-ensembles de leucocytes, et l’agressivité du traitement tumoral peut entraîner un clivage enzymatique de l’épitope et une réduction de la viabilité des cellules récupérées⁷. Le but de cette méthode est de fournir un moyen fiable de dissociation tumorale afin de préserver l’intégrité du marqueur de surface pour l’analyse et la vitalité cellulaire pour l’étude fonctionnelle. Par rapport aux protocoles d’isolement des leucocytes infiltrant la tumeur (TIL) qui favorisent des mélanges enzymatiques plus durs pour améliorer la libération reproductible de divers sous-ensembles cellulaires, cette méthode favorise une digestion enzymatique plus conservatrice pour maximiser la récupération des cellules myéloïdes. Des stratégies de contrôle de flux multicolores de haut niveau sont également fournies pour identifier les sous-ensembles de cellules myéloïdes tumorales murines afin d’une caractérisation et/ou d’un tri plus poussés.

Protocole

REMARQUE : Toutes les études sur les animaux ont été conformes aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université McMaster.

1. Prélèvement tumoral et dissociation

1. Inoculer des souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines par voie intradermique/sous-cutanée avec 2 cellules de mélanome × 10⁵ B16 comme décrit par Nguyen et ^al.8 Laisser les tumeurs se développer pendant 7 jours avant la récolte.
2. Euthanasiez la souris par luxation cervicale tout en vous assurant de ne pas perturber la tumeur ce faisant. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % avant la récolte.
3. À l’aide d’un scalpel et de ciseaux, retirez chirurgicalement la tumeur intradermique/sous-cutanée des tissus environnants (y compris les ganglions lymphatiques draineurs de tumeurs attachés) et placez les tumeurs dans un tube de microfuge pré-pesé. Restez sur la glace.
   REMARQUE : Effectuez la récolte des tumeurs dans une enceinte de biosécurité à usage d’animaux. Utilisez un tube conique de 15 ml pour les tumeurs plus grosses.
4. Pesez les tumeurs et ajoutez 500 μL de milieu RPMI-1640 avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans chaque tube, à l’aide de ciseaux pour couper les tumeurs en petits morceaux à l’intérieur du tube ou dans une plaque à 6 puits.
   REMARQUE : Les morceaux de tumeur doivent être suffisamment petits pour être mélangés par une pipette électrique une fois que le milieu de digestion a été ajouté.
5. Préparez le mélange de dissociation en dissolvant la collagénase de type IV à 0,5 mg/mL et la DNase à 0,2 mg/mL dans un milieu RPMI-1640 avec 10 % de FBS et 5 mM de chlorure de calcium.
   REMARQUE : Le mélange de dissociation doit être préparé frais pour maximiser l’activité de la collagénase.
6. Transférez la suspension tumorale hachée dans un tube conique de 15 ml et ajoutez 10 ml de mélange de dissociation pour 0,25 mg de tumeur. Placez le tube dans un agitateur orbital à température contrôlée pendant 30 min à 37 °C avec une agitation de 200 tr/min. Neutraliser l’activité de la collagénase en ajoutant deux volumes de milieu RPMI-1640 froid avec 10 % de FBS et 2 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA), et réfrigérer pendant 10 min à 4 °C.
7. Agiter brièvement le vortex et pipeter la suspension dans une crépine de 40 μm sur un tube conique de 50 mL. Utilisez un piston de seringue et un produit neutralisant pour désagréger le tissu tumoral résiduel et lavez-le à travers la crépine. Centrifuger la suspension pendant 5 min (500 × g, 4 °C), jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 2 % de FBS et 1 mM d’EDTA.

2. Enrichissement TIL et coloration par cytométrie en flux (FACS)

1. Pour enrichir les TIL pour la caractérisation des cellules myéloïdes, utilisez un kit de séparation magnétique cellulaire conçu pour la sélection positive à la biotine avec des anticorps CD45.2 biotinylés selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
2. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS (PBS avec 0,5 % p/v d’albumine sérique bovine (BSA)), et transférez-les sur une plaque à fond en U à 96 puits.
   REMARQUE : Ne dépassez pas une concentration de coloration de 1 × 10⁸ cellules / ml. Ajustez le volume et divisez les échantillons en plusieurs puits pour compenser le nombre élevé de cellules.
3. Centrifuger la plaque pendant 5 minutes (500 × g, 4 °C) et jeter le surnageant. Ajouter 50 μL de solution de bloc Fc (dilution 1:200 de CD16/CD32 anti-souris purifié pour rat [voir le tableau des matériaux) dans un tampon FACS, concentration finale de 2,5 μg/mL), et remettre les cellules en suspension par pipetage. Incuber pendant 10 min à 4 °C.
4. Ajouter 50 μL de tampon FACS contenant une concentration 2x d’anticorps de coloration de surface (dilution 1:50 de CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) et de coloration de viabilité fixable (FVS, dilution 1:500), et mélanger les cellules par pipetage. Incuber pendant 20 min à 4 °C.
   REMARQUE : Couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière. Les anticorps doivent être titrés avant l’expérience afin de déterminer empiriquement la dilution optimale.
5. Lavez les cellules deux fois en ajoutant 200 μL de tampon FACS dans chaque puits, en centrifugeant la suspension (5 min, 500 × g, 4 °C) et en jetant le surnageant.
6. Ajouter 100 μL de solution de fixation/perméabilisation (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits, mélanger les cellules par pipetage et incuber pendant 20 min à 4 °C.
7. Ajouter 100 μL de tampon de perméabilisation 1x (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits, centrifuger la plaque pendant 5 min (500 × g, 4 °C) et jeter le surnageant.
8. Lavez les cellules en ajoutant 200 μL de 1x tampon de perméabilisation dans chaque puits, en centrifugant la suspension (5 min, 500 × g, 4 °C) et en jetant le surnageant.
   REMARQUE : L’expérience peut être interrompue pendant la nuit après avoir remis les cellules en suspension dans le tampon de perméabilisation. Conservez l’échantillon à 4 °C et à l’abri de la lumière. Reprendre après avoir brièvement mélangé les cellules avant de centrifuger.
9. Ajouter 100 μL de tampon de perméabilisation contenant 1x la concentration d’anticorps de coloration intracellulaire (dilution 1:100 de l’oxyde nitrique synthase 2 (NOS2), de l’arginase 1 (Arg1)), et mélanger les cellules par pipetage. Incuber pendant 20 min à 4 °C.
   REMARQUE : Couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière. Les anticorps doivent être titrés avant l’expérience afin de déterminer empiriquement la dilution optimale.
10. Ajouter 100 μL de 1 tampon de perméabilisation dans chaque puits, centrifuger la plaque pendant 5 minutes (500 × g, 4 °C) et jeter le surnageant.
11. Laver les cellules en ajoutant 200 μL de 1 tampon de perméabilisation dans chaque puits, en centrifugeant la suspension (5 min, 500 × g, 4 °C) et en jetant le surnageant.
12. Remettre les cellules en suspension dans 300 μL de tampon FACS. Filtrez l’échantillon à travers un tube en polystyrène à fond rond de 5 ml avec un capuchon de crépine de 40 μm avant d’effectuer une analyse par cytométrie en flux.

3. Tri des cellules myéloïdes tumorales pour les études fonctionnelles

1. Après avoir identifié les populations de cellules myéloïdes souhaitées par analyse par cytométrie en flux, pré-enrichissez les cellules myéloïdes en vrac pour le tri avec un kit de séparation magnétique des cellules conçu pour la sélection CD11b ou CD11c positive selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
2. À l’aide d’anticorps de coloration de surface spécifiques pour les sous-ensembles de cellules myéloïdes souhaités (dilution 1:100 de CD11b, Ly6C, Ly6G), colorez les cellules pré-enrichies comme décrit aux étapes 2.2 à 2.5.
   REMARQUE : Inclure une coloration de viabilité fixable pour assurer le tri des cellules myéloïdes vivantes. Ne pas dépasser une concentration de coloration de 1 × 10⁸ cellules/mL. Ajustez le volume et divisez les échantillons en plusieurs puits pour compenser le nombre élevé de cellules.
3. Remettre les cellules en suspension dans un tampon de tri à froid (PBS avec 1 % p/v de BSA, 25 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES) et 1 mM d’EDTA). Filtrer l’échantillon à travers un tube en polypropylène à fond rond de 5 mL muni d’un capuchon de crépine de 40 μm. Gardez les cellules sur de la glace et couvrez le tube de papier d’aluminium.
   REMARQUE : Ajustez la concentration des cellules/volume à la spécification de l’instrument souhaité pour le tri.
4. Préparez un tube de prélèvement d’échantillon avec un milieu de capture (tube en polypropylène à fond rond de 5 ml contenant du PBS avec 50 % de FBS).
   REMARQUE : Enduire les tubes d’un support de captage de 5 mL pendant la nuit avant de les trier. Jetez tout le milieu de capture, sauf 1 à 2 ml, le lendemain avant de prélever l’échantillon.
5. Modifiez les paramètres de l’instrument de tri pour diminuer la pression de l’échantillon et éviter les perturbations dans la formation des gouttelettes. Équipez la pointe de la buse de 130 μm et utilisez le réglage de 10 psi. Faites fonctionner l’échantillon à faible débit avec une agitation périodique de l’échantillon à 100 tr/min, en veillant à ce que le dépôt des gouttelettes se fasse au centre du tube. Après le tri, conservez l’échantillon sur de la glace.
6. Incuber l’échantillon pendant 10 min à 4 °C. Centrifuger le tube pendant 5 minutes (500 × g, 4 °C), jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans le milieu souhaité pour des tests fonctionnels ou un transfert adoptif.

4. Transfert adoptif de cellules myéloïdes tumorales purifiées

1. Inoculer des souris C57BL/6 femelles, âgées de 6 à 8 semaines, par voie intradermique avec 1 × 10⁶ cellules tumorales de mélanome B16 remises en suspension dans 30 μL de PBS.
   REMARQUE : Inoculez les souris à l’avance de manière à ce que la croissance tumorale ne dépasse pas 100^mm3 au moment du transfert adoptif.
2. Remettre en suspension les cellules myéloïdes tumorales triées dans le PBS avec 25 mM HEPES et 1 mM EDTA à une concentration de 2 × 10⁶ cellules/mL. Filtrez l’échantillon à travers un tube en polystyrène à fond rond de 5 mL avec un capuchon de crépine de 40 μm. Restez sur la glace.
3. Induire et maintenir les souris sous anesthésie avec 3 % d’isoflurane. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire ou les blessures.
4. Chargez une seringue de 31 G avec 50 μL de suspension cellulaire. Délogez les bulles d’air en agitant doucement la seringue. Nettoyez le site d’injection à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.
5. À l’aide d’une pince stérile, soulevez la peau à la base de la tumeur. Insérez l’aiguille dans l’espace sous-cutané à un léger angle vers le haut pour pénétrer dans la tumeur par le dessous de la peau. Utilisez la pince pour pincer la peau entourant l’aiguille et distribuez lentement le volume de la seringue. Continuez à pincer la peau avec la pince tout en retirant lentement l’aiguille et utilisez un coton-tige pour nettoyer les fuites potentielles.
   REMARQUE : Procéder à tout traitement thérapeutique supplémentaire si vous le souhaitez.
6. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie.

Résultats

Les résultats démontrent que cette méthode produit un rendement élevé de cellules myéloïdes à partir de tumeurs murines solides. La préservation de l’intégrité du récepteur et de la viabilité cellulaire facilite l’analyse fonctionnelle fiable des sous-ensembles myéloïdes souhaités. Ces améliorations de l’isolement des cellules myéloïdes ont permis de discerner la fonction changeante des cellules myéloïdes intratumorales lors de la normalisation du TME avec l’...

Discussion

Bien que les cellules myéloïdes infiltrant la tumeur existent dans différents états d’activation et de différenciation au sein de la tumeur, plusieurs sous-ensembles ont été identifiés, notamment les DC associés à la tumeur (TADC), les neutrophiles associés à la tumeur (TAN), les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les macrophages associés à la tumeur (^TAMs)12. Malheureusement, le chevauchement de l’expression des marqueurs ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated Antibody	R&D Systems	IC5868F	1:100