JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает надежные методы диссоциации солидных опухолей и выделения миелоидных клеток в мышиных моделях внутрикожных или подкожных опухолей. Проточная цитометрия позволяет фенотипически охарактеризовать гетерогенные миелоидные популяции в микроокружении опухоли, а сортировка продемонстрирует их функциональность в контексте адоптивного переноса.

Аннотация

Инфильтрирующий опухоль миелоидный клеточный компартмент представляет собой гетерогенную популяцию широко иммуносупрессивных клеток, которые были использованы опухолью для поддержки ее роста. Их накопление в опухолевой и вторичной лимфоидной ткани приводит к подавлению противоопухолевых иммунных реакций и, таким образом, является мишенью для терапевтического вмешательства. Поскольку известно, что местная цитокиновая среда может диктовать функциональное программирование инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток, были разработаны стратегии манипулирования микроокружением опухоли (ТМЭ) для выражения цитокинового ландшафта, более благоприятного для активности противоопухолевых миелоидных клеток. Для оценки индуцированных терапией изменений в инфильтрирующих опухоль миелоидных клетках в данной статье будет описана процедура диссоциации внутрикожной/подкожной опухолевой ткани у мышей с солидными опухолями в рамках подготовки к восстановлению лейкоцитов. Будут предложены стратегии проточного цитометрического анализа, позволяющие идентифицировать гетерогенные миелоидные популяции в изолированных лейкоцитах и охарактеризовать уникальные миелоидные фенотипы. Наконец, в данной статье будут описаны средства очистки жизнеспособных миелоидных клеток для функциональных анализов и определения их терапевтической ценности в контексте адоптивного переноса.

Введение

Опухолевое микроокружение (ТМЭ) состоит из быстро пролиферирующих опухолевых клеток и окружающего его гетерогенного компартмента стромальных клеток. Поскольку растущие опухоли часто плохо васкуляризированы, ТМЭ является периферическим участком, уникально характеризующимся гипоксией, недостатком питательных веществ и ацидозом1. Чтобы выжить в этом ландшафте, реакции опухоли на стресс и метаболическое перепрограммирование приводят к секреции растворимых факторов, которые способствуют ремоделированию тканей и ангиогенезу, а также к селективному набору иммунных клеток. Поскольку миелоидные клетки являются одним из наиболее распространенных типов гемопоэтических клеток в ТМЭ, растет интерес к изучению роли инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток в ТМЭ.

Миелоидные клетки представляют собой гетерогенную и пластичную группу клеток врожденного иммунитета, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки и гранулоциты. Несмотря на то, что они играют важную роль в тканевом гомеостазе и регуляции адаптивного иммунного ответа, их функция может быть поляризующей в зависимости от состава сигналов активации в локальноммикроокружении. Опухоли используют свойства миелоидных клеток за счет секреции растворимых факторов в ТМЭ. Эти альтернативные сигналы могут отклонять миелопоэз в сторону незрелой дифференцировки и искажать функцию существующих миелоидных клеток, инфильтрирующих опухоль3. Действительно, миелоидные клетки в ТМЭ часто способствуют прогрессированию рака и могут подавлять противоопухолевые иммунные реакции, что приводит к неблагоприятным последствиям для терапии рака.

Несмотря на то, что было показано, что терапевтические стратегии, способствующие истощению иммуносупрессивных миелоидных клеток, задерживают рост опухоли4, отсутствие специфичности мишени ставит под угрозу удаление иммуностимулирующих миелоидных клеток, которые, в свою очередь, помогают в разрешении рака. Эти воспалительные миелоидные клетки могут оказывать глубокое противоопухолевое действие, включая прямое уничтожение опухолевых клеток и активацию цитотоксических CD8+ Т-клеток5. С другой стороны, стратегии нормализации состава и функции миелоидных клеток в ТМЭ показали терапевтический успех6; Однако биологические механизмы, лежащие в основе их перевоспитания в сторону противоопухолевого фенотипа, до сих пор до конца не изучены. В конечном счете, всесторонняя характеристика опухолевых миелоидных клеток необходима для дальнейшего совершенствования терапии рака.

К сожалению, воспроизводимая дезагрегирование опухолей для выделения миелоидных клеток является сложной задачей. Миелоидные клетки опухолевого происхождения чувствительны к манипуляциям ex vivo по сравнению с другими субпопуляциями лейкоцитов, а агрессивность процессинга опухоли может привести к расщеплению ферментативного эпитопа и снижению жизнеспособности восстановленных клеток7. Целью данного метода является обеспечение надежного средства диссоциации опухоли для сохранения целостности поверхностных маркеров для анализа и жизнеспособности клеток для функционального исследования. По сравнению с протоколами выделения инфильтрирующих опухоль лейкоцитов (TIL), которые отдают предпочтение более жестким ферментативным смесям для усиления воспроизводимого высвобождения различных клеточных субпопуляций, этот метод отдает предпочтение более консервативному ферментативному расщеплению для максимального восстановления миелоидных клеток. Также предусмотрены высокоуровневые стратегии многоцветного гейтирования для идентификации субпопуляций миелоидных клеток опухолевых опухолей мышей для дальнейшей характеристики и/или сортировки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследования на животных соответствовали рекомендациям Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Советом по этике исследований животных Университета Макмастера.

1. Забор и диссоциация опухоли

  1. Инокулируйте мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель внутрикожно/подкожно 2 × 105 клеток меланомы B16, как описано Nguyen et al.8 Дайте опухолям расти в течение 7 дней до забора.
  2. Усыпьте мышь при вывихе шейки матки, следя за тем, чтобы при этом не нарушить опухоль. Перед сбором урожая опрыскайте мышь 70% этанолом.
  3. С помощью скальпеля и ножниц хирургическим путем удалите внутрикожную/подкожную опухоль из окружающих тканей (включая прикрепленные лимфоузлы, дренирующие опухоль) и поместите опухоли в предварительно взвешенную микропробирку. Держите на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите забор опухолей в шкафу биобезопасности для животных. Используйте коническую трубку объемом 15 мл для больших опухолей.
  4. Взвесьте опухоли и добавьте 500 мкл среды RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в каждую пробирку, разрезая опухоли ножницами внутри пробирки или в 6-луночной пластине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки опухоли должны быть достаточно маленькими, чтобы их можно было перемешать с помощью электрической пипетки после добавления среды для пищеварения.
  5. Смесь для диссоциации готовят путем растворения коллагеназы IV типа в 0,5 мг/мл и ДНКазы в дозе 0,2 мг/мл в среде RPMI-1640 с 10% FBS и 5 мМ хлорида кальция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь для диссоциации должна быть приготовлена свежей для максимизации активности коллагеназы.
  6. Перенесите измельченную опухолевую суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 10 мл диссоциационной смеси на 0,25 мг опухоли. Поместите трубку в орбитальный шейкер с регулируемой температурой на 30 минут при температуре 37 °C с перемешиванием 200 об/мин. Нейтрализовать активность коллагеназы путем добавления двух объемов холодной среды RPMI-1640 с 10% FBS и 2 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА), и поставить в холодильник на 10 мин при 4 °C.
  7. Кратковременно переведите суспензию и пипетируйте ее пипеткой в ситечко 40 мкм на конической пробирке объемом 50 мл. С помощью поршня шприца и нейтрализующей среды удалите остаточную опухолевую ткань и промойте ее через ситечко. Центрифугируйте суспензию в течение 5 мин (500 × г, 4 °C), выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 2% FBS и 1 мМ ЭДТА.

2. Обогащение TIL и проточное цитометрическое окрашивание (FACS)

  1. Для обогащения TILs для характеризации миелоидных клеток используйте набор для магнитного разделения клеток, предназначенный для биотин-положительного отбора с биотинилированными антителами CD45.2 в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS (PBS с 0,5% w/v бычьего сывороточного альбумина (BSA)) и перенесите их в 96-луночный U-образный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте концентрацию окрашивания 1 × 108 клеток/мл. Отрегулируйте объем и разделите образцы на несколько лунок, чтобы компенсировать большое количество ячеек.
  3. Центрифугируйте планшет в течение 5 минут (500 × г, 4 °C) и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 50 мкл раствора Fc-блока (1:200 разведение очищенного антимышиного CD16/CD32 крысы [см. Таблицу материалов) в буфере FACS, конечная концентрация 2,5 мкг/мл) и ресуспендируйте клетки с помощью пипетирования. Выдерживать в течение 10 минут при температуре 4 °C.
  4. Добавьте 50 мкл буфера FACS, содержащего в 2 раза больше поверхностно-окрашивающего антитела (разведение CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) и корректируемое окрашивание жизнеспособности (FVS, разведение 1:500), и перемешайте клетки с помощью пипетирования. Выдерживать в течение 20 минут при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму воздействие света. Антитела следует титровать перед началом эксперимента для эмпирического определения оптимального разведения.
  5. Промойте ячейки дважды, добавив 200 мкл буфера FACS в каждую лунку, центрифугируя суспензию (5 мин, 500 × г, 4 °C) и выбросив надосадочную жидкость.
  6. Добавьте 100 мкл раствора для фиксации/пермеабилизации (см. Таблицу материалов) в каждую лунку, перемешайте клетки с помощью пипетирования и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C.
  7. Добавьте 100 мкл 1x пермеабилизационного буфера (см. Таблицу материалов) в каждую лунку, центрифугируйте планшет в течение 5 мин (500 × г, 4 °C) и выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Промойте ячейки, добавив 200 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую лунку, центрифугируя суспензию (5 мин, 500 × г, 4 °C) и выбросив надосадочную жидкость.
    Примечание: Эксперимент можно приостановить на ночь после ресуспендирования клеток в буфере для пермеабилизации. Хранить образец при температуре 4 °C в защищенном от света месте. Возобновите работу после краткого перемешивания ячеек перед центрифугированием.
  9. Добавьте 100 мкл пермеабилизационного буфера, содержащего 1-кратную концентрацию внутриклеточного окрашивающего антитела (1:100 разведение синтазы оксида азота 2 (NOS2), аргиназы 1 (Arg1)), и перемешайте клетки с помощью пипетирования. Выдерживать в течение 20 минут при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму воздействие света. Антитела следует титровать перед началом эксперимента для эмпирического определения оптимального разведения.
  10. Добавьте 100 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую лунку, центрифугируйте планшет в течение 5 минут (500 × г, 4 °C) и выбросьте надосадочную жидкость.
  11. Промойте клетки, добавив 200 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую лунку, центрифугируя суспензию (5 мин, 500 × г, 4 °C) и выбросив надосадочную жидкость.
  12. Ресуспендируйте элементы в 300 мкл буфера FACS. Перед проведением анализа проточной цитометрии процедите образец через полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл и крышкой фильтра 40 мкм.

3. Сортировка опухолевых миелоидных клеток для функциональных исследований

  1. После определения желаемых популяций миелоидных клеток с помощью анализа проточной цитометрии предварительно обогащают объемные миелоидные клетки для сортировки с помощью набора для магнитного разделения клеток, предназначенного для CD11b- или CD11c-положительного отбора в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Используя поверхностные окрашивающие антитела, специфичные для желаемых субпопуляций миелоидных клеток (разведение CD11b, Ly6C, Ly6G в соотношении 1:100), окрашивают предварительно обогащенные клетки, как описано на этапах 2.2-2.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите фиксируемое окрашивание на жизнеспособность, чтобы обеспечить сортировку живых миелоидных клеток. Не превышайте концентрацию окрашивания 1 × 108 клеток/мл. Отрегулируйте объем и разделите образцы на несколько лунок, чтобы компенсировать большое количество ячеек.
  3. Ресуспендируйте клетки в холодном сортировочном буфере (PBS с 1% w/v BSA, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) и 1 мМ ЭДТА). Отфильтруйте образец через полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 5 мл и крышкой фильтра 40 мкм. Держите клетки на льду, а трубку накройте алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию ячеек/объема в соответствии с желаемой спецификацией прибора для сортировки.
  4. Подготовьте пробирку для сбора проб с улавливающей средой (полипропиленовая пробирка объемом 5 мл с круглым дном, содержащая PBS с 50% FBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки с покрытием объемом 5 мл захватывают среду в течение ночи перед сортировкой. Выбросьте все, кроме 1-2 мл улавливающей среды, на следующий день перед проведением пробы.
  5. Измените настройки прибора сортировщика, чтобы снизить давление образца и предотвратить возмущения при образовании капель. Установите наконечник сопла 130 μм и используйте настройку 10 фунтов на квадратный дюйм. Прогоните пробу с низкой скоростью потока с периодическим перемешиванием образца со скоростью 100 об/мин, следя за тем, чтобы осаждение капель находилось в центре пробирки. После сортировки держите образец на льду.
  6. Инкубируйте образец в течение 10 минут при 4 °C. Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут (500 × г, 4 °C), выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в желаемой среде для функциональных анализов или адоптивного переноса.

4. Адоптивный перенос очищенных миелоидных клеток опухоли

  1. Внутрикожно инокулировать мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель 1 ×10 6 опухолевых клеток меланомы B16, ресуспендированных в 30 мкл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прививайте мышей заранее, чтобы рост опухоли не превышал 100мм3 к моменту адоптивного переноса.
  2. Ресуспендирование отсортированных опухолевых миелоидных клеток в PBS с 25 мМ HEPES и 1 мМ ЭДТА в концентрации 2 × 106 клеток/мл. Отфильтруйте образец через полистирольную пробирку объемом 5 мл с круглым дном и крышкой фильтра 40 мкм. Держите на льду.
  3. Индуцировать и поддерживать мышей под наркозом 3% изофлурана. Наносите офтальмологическую мазь для предотвращения сухости/травмирования глаз.
  4. Загрузите в шприц 31 г 50 мкл клеточной суспензии. Удалите пузырьки воздуха, осторожно взмахнув шприцем. Очистите место инъекции с помощью спиртового тампона.
  5. С помощью стерильных щипцов приподнимают кожу у основания опухоли. Введите иглу в подкожное пространство под небольшим углом вверх, чтобы войти в опухоль снизу кожи. С помощью щипцов сожмите кожу вокруг иглы и медленно выдавите объем шприца. Продолжайте зажимать кожу щипцами, медленно извлекая иглу, и используйте ватный тампон, чтобы убрать потенциальную утечку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании приступайте к любым дополнительным терапевтическим процедурам.
  6. Дайте мышам восстановиться после анестезии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результаты показывают, что этот метод дает высокий выход миелоидных клеток из солидных опухолей мышей. Сохранение целостности рецептора и жизнеспособности клеток способствует надежному функциональному анализу желаемых миелоидных субпопуляций. Эти улучшения в выд?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несмотря на то, что инфильтрирующие опухоль миелоидные клетки существуют в различных состояниях активации и дифференцировки в опухоли, было выявлено несколько подгрупп, включая опухолеассоциированные ДК (TADC), опухолеассоциированные нейтрофилы (TAN), миелоидные супре?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Эта работа была поддержана Институтом исследований рака Онтарио за счет финансирования, предоставленного правительством Онтарио, а также Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FRN 123516 и FRN 152954), Канадским онкологическим обществом (грант 705143) и Научно-исследовательским институтом Терри Фокса (TFRI-1073).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences5606931:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1BD Biosciences5606181:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11cBD Biosciences5627821:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80BD Biosciences7432821:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences5630461:100
Collagenase, Type IV, powderGibco17104019
DNase IRoche10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit IIStemcell technologies18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit IIStemcell technologies18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection KitStemcell technologies17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6CBD Biosciences5531041:100
Fixable Viability Stain 510BD Biosciences5644061:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)BD Biosciences554714
PE Rat Anti-CD11bBD Biosciences5573971:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences5527751:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6GBD Biosciences5606021:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)BD Biosciences554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APCThermo Fisher17-5920-821:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated AntibodyR&D SystemsIC5868F1:100

Ссылки

  1. Paardekooper, L. M., Vos, W., vanden Bogaart, G. Oxygen in the tumor microenvironment: effects on dendritic cell function. Oncotarget. 10 (8), 883-896 (2019).
  2. Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
  3. Jahchan, N. S., et al. Tuning the tumor myeloid microenvironment to fight cancer. Frontiers in Immunology. 10, 1611(2019).
  4. Srivastava, M. K., et al. Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lung cancer. PLoS One. 7 (7), 40677(2012).
  5. Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., Breckpot, K. Turn back the TIMe: targeting tumor infiltrating myeloid cells to revert cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 1977(2018).
  6. Strauss, L., et al. Targeted deletion of PD-1 in myeloid cells induces antitumor immunity. Science Immunology. 5 (43), 1863(2020).
  7. Cassetta, L., et al. Deciphering myeloid-derived suppressor cells: isolation and markers in humans, mice and non-human primates. Cancer Immunology, Immunotherapy. 68 (4), 687-697 (2019).
  8. Nguyen, A., et al. HDACi delivery reprograms tumor-infiltrating myeloid cells to eliminate antigen-loss variants. Cell Reports. 24 (3), 642-654 (2018).
  9. Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors. Journal of Visual Experiments: JoVE. (136), e57685(2018).
  10. Engfeldt, P., Arner, P., Ostman, J. Nature of the inhibitory effect of collagenase on phosphodiesterase activity. Journal of Lipid Research. 26 (8), 977-981 (1985).
  11. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visual Experiments: JoVE. (44), e2259(2010).
  12. Schupp, J., et al. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cellular Immunology. 343, 103713(2019).
  13. Gabrilovich, D. I., Ostrand-Rosenberg, S., Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology. 12 (4), 253-268 (2012).
  14. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  15. Roussel, M., et al. Mass cytometry deep phenotyping of human mononuclear phagocytes and myeloid-derived suppressor cells from human blood and bone marrow. Journal of Leukocyte Biology. 102 (2), 437-447 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены