Funktionelle Analyse tumorinfiltrierender myeloischer Zellen mittels Durchflusszytometrie und adoptivem Transfer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet zuverlässige Methoden zur Dissoziation solider Tumoren und zur Isolierung myeloischer Zellen in murinen intradermalen oder subkutanen Tumormodellen. Die Durchflusszytometrie ermöglicht die phänotypische Charakterisierung heterogener myeloischer Populationen innerhalb der Tumormikroumgebung und die Sortierung wird ihre Funktionalität im Rahmen des adoptiven Transfers demonstrieren.

Zusammenfassung

Das tumorinfiltrierende myeloische Zellkompartiment stellt eine heterogene Population von weitgehend immunsuppressiven Zellen dar, die vom Tumor zur Unterstützung seines Wachstums genutzt wurden. Ihre Akkumulation im Tumor- und sekundären lymphatischen Gewebe führt zur Unterdrückung der Antitumor-Immunantworten und ist somit ein Ziel für therapeutische Interventionen. Da bekannt ist, dass das lokale Zytokinmilieu die funktionelle Programmierung von tumorinfiltrierenden myeloischen Zellen bestimmen kann, wurden Strategien entwickelt, um die Tumormikroumgebung (TME) so zu manipulieren, dass eine Zytokinlandschaft exprimiert wird, die für die Aktivität myeloischer Antitumorzellen förderlicher ist. Um therapieinduzierte Veränderungen in tumorinfiltrierenden myeloischen Zellen zu bewerten, wird in dieser Arbeit das Verfahren zur Dissoziation von intradermalem/subkutanem Tumorgewebe von soliden tumortragenden Mäusen zur Vorbereitung auf die Leukozytenregeneration skizziert. Es werden Strategien für die durchflusszytometrische Analyse bereitgestellt, um die Identifizierung heterogener myeloischer Populationen innerhalb isolierter Leukozyten und die Charakterisierung einzigartiger myeloischer Phänotypen zu ermöglichen. Schließlich wird in dieser Arbeit ein Mittel zur Reinigung lebensfähiger myeloischer Zellen für funktionelle Assays beschrieben und ihr therapeutischer Wert im Rahmen des adoptiven Transfers bestimmt.

Einleitung

Die Tumormikroumgebung (TME) besteht aus schnell proliferierenden neoplastischen Zellen und einem umgebenden heterogenen Stromazellkompartiment. Da wachsende Tumoren oft schlecht vaskularisiert sind, handelt es sich bei der TME um eine periphere Lokalisation, die einzigartig durch Hypoxie, Nährstoffmangel und Azidose gekennzeichnet^{ist 1}. Um in dieser Landschaft zu überleben, führen Tumorstressreaktionen und metabolische Reprogrammierung zur Sekretion löslicher Faktoren, die den Gewebeumbau und die Angiogenese sowie die selektive Rekrutierung von Immunzellen fördern². Da myeloische Zellen eine der am häufigsten vorkommenden Arten von hämatopoetischen Zellen in der TME sind, besteht ein zunehmendes Interesse an der Untersuchung der Rolle tumorinfiltrierender myeloischer Zellen in der TME.

Myeloische Zellen sind eine heterogene und plastische Gruppe von Zellen des angeborenen Immunsystems, zu denen Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und Granulozyten gehören. Obwohl sie eine entscheidende Rolle bei der Homöostase des Gewebes und der Regulation der adaptiven Immunantwort spielen, kann ihre Funktion je nach Zusammensetzung der Aktivierungssignale in der lokalen Mikroumgebung polarisierend sein³. Tumore nutzen die Eigenschaften myeloischer Zellen durch die Sekretion löslicher Faktoren innerhalb der TME. Diese alternativen Signale können die Myelopoese in Richtung unreifer Differenzierung umlenken und die Funktion bestehender tumorinfiltrierender myeloischer Zellen verzerren³. In der Tat fördern myeloische Zellen innerhalb der TME häufig das Fortschreiten der Krebserkrankung und können die Immunantwort gegen Tumore unterdrücken, was zu unerwünschten Auswirkungen auf die Krebstherapie führt.

Obwohl gezeigt wurde, dass therapeutische Strategien, die die Depletion immunsuppressiver myeloischer Zellen fördern, das Tumorwachstum verzögern⁴, besteht aufgrund des Mangels an Zielspezifität die Gefahr der Entfernung immunstimulierender myeloischer Zellen, die im Gegensatz dazu bei der Auflösung von Krebs helfen. Diese entzündlichen myeloischen Zellen können tiefgreifende Antitumorwirkungen ausüben, einschließlich der direkten Abtötung von Tumorzellen und der Aktivierung zytotoxischer CD8⁺ T-Zellen⁵. Alternativ haben Strategien, die die Zusammensetzung und Funktion myeloischer Zellen in der TME normalisieren, therapeutischen Erfolg gezeigt⁶; Die biologischen Mechanismen, die ihrer Umerziehung zu einem Antitumor-Phänotyp zugrunde liegen, sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Letztendlich ist eine umfassende Charakterisierung der myeloischen Tumorzellen notwendig, um die Krebstherapie weiter zu verbessern.

Leider ist die reproduzierbare Disaggregation von Tumoren für die Isolierung myeloischer Zellen eine Herausforderung. Aus Tumoren stammende myeloische Zellen sind im Vergleich zu anderen Leukozyten-Untergruppen empfindlich gegenüber ex vivo-Manipulationen , und die Aggressivität der Tumorprozessierung kann zu einer enzymatischen Epitopspaltung und einer verminderten Lebensfähigkeit der wiedergewonnenen Zellen führen⁷. Der Zweck dieser Methode besteht darin, ein zuverlässiges Mittel zur Tumordissoziation bereitzustellen, um die Integrität der Oberflächenmarker für die Analyse und die zelluläre Vitalität für funktionelle Studien zu erhalten. Im Vergleich zu tumorinfiltrierenden Leukozyten (TIL)-Isolationsprotokollen, die härtere enzymatische Mischungen bevorzugen, um die reproduzierbare Freisetzung verschiedener zellulärer Untergruppen zu verbessern, begünstigt diese Methode einen konservativeren enzymatischen Verdau, um die Regeneration myeloischer Zellen zu maximieren. High-Level-Multi-Color-Flow-Gating-Strategien werden ebenfalls bereitgestellt, um Untergruppen myeloischer Tumorzellen von Maustumoren für eine weitere Charakterisierung und/oder Sortierung zu identifizieren.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche entsprachen den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und wurden vom Animal Research Ethics Board der McMaster University genehmigt.

1. Tumorentnahme und Dissoziation

1. Injikulieren Sie 6-8 Wochen alte, weibliche C57BL/6-Mäuse indermal/subkutan mit 2 × 10⁵ B16-Melanomzellen, wie von Nguyen et al. ^{beschrieben.8} Lassen Sie Tumore 7 Tage lang wachsen, bevor sie entnommen werden.
2. Euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation und achten Sie dabei darauf, den Tumor nicht zu stören. Sprühen Sie die Maus vor der Ernte mit 70% Ethanol ein.
3. Entfernen Sie mit einem Skalpell und einer Schere den intradermalen / subkutanen Tumor chirurgisch aus dem umgebenden Gewebe (einschließlich der anhaftenden tumordrainierenden Lymphknoten) und platzieren Sie die Tumore in ein vorgewogenes Mikrofugenröhrchen. Bleiben Sie auf Eis.
   HINWEIS: Führen Sie die Tumorentnahme in einer Biosicherheitswerkbank für Tiere durch. Verwenden Sie für größere Tumoren ein konisches 15-ml-Röhrchen.
4. Wiegen Sie die Tumoren und geben Sie 500 μl RPMI-1640-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in jedes Röhrchen, indem Sie die Tumore mit einer Schere innerhalb des Röhrchens oder in einer 6-Well-Platte in kleine Stücke schneiden.
   HINWEIS: Die Tumorstücke sollten klein genug sein, um nach Zugabe des Verdauungsmediums mit einer elektrischen Pipettiermaschine gemischt werden zu können.
5. Bereiten Sie die Dissoziationsmischung vor, indem Sie Kollagenase Typ IV bei 0,5 mg/ml und DNase bei 0,2 mg/ml in RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 5 mM Calciumchlorid auflösen.
   HINWEIS: Die Dissoziationsmischung muss frisch zubereitet werden, um die Kollagenaseaktivität zu maximieren.
6. Übertragen Sie die zerkleinerte Tumorsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 10 ml Dissoziationsmischung pro 0,25 mg Tumor hinzu. Stellen Sie das Rohr für 30 min bei 37 °C und 200 U/min Rührwerk in einen temperaturgesteuerten Orbitalschüttler. Neutralisieren Sie die Kollagenaseaktivität, indem Sie zwei Volumen kaltes RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen und 10 Minuten bei 4 °C kühlen.
7. Die Suspension kurz vortexen und in ein 40-μm-Sieb auf einem konischen 50-ml-Röhrchen pipettieren. Verwenden Sie einen Spritzenkolben und neutralisierende Medien, um das verbleibende Tumorgewebe zu disaggregieren, und waschen Sie es durch das Sieb. Die Suspension wird 5 min lang (500 × g, 4 °C) zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % FBS und 1 mM EDTA resuspendiert.

2. TIL-Anreicherung und durchflusszytometrische Färbung (FACS)

1. Um TILs für die Charakterisierung myeloischer Zellen anzureichern, verwenden Sie ein magnetisches Zelltrennungskit, das für die biotinpositive Selektion mit biotinylierten CD45.2-Antikörpern gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgelegt ist (siehe Materialtabelle).
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer (PBS mit 0,5 % w/v Rinderserumalbumin (BSA)) und überführen Sie sie auf eine 96-Well-U-Bodenplatte.
   HINWEIS: Eine Färbekonzentration von 1 × 10⁸ Zellen/ml darf nicht überschritten werden. Passen Sie das Volumen an und teilen Sie die Proben in mehrere Wells auf, um eine hohe Zellzahl auszugleichen.
3. Die Platte wird 5 Minuten lang (500 × g, 4 °C) zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Geben Sie 50 μl Fc-Blocklösung (1:200 Verdünnung von gereinigtem Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32 [siehe Materialtabelle] in FACS-Puffer, Endkonzentration von 2,5 μg/ml) und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren. 10 min bei 4 °C inkubieren.
4. Geben Sie 50 μl FACS-Puffer mit der 2-fachen Konzentration des oberflächenfärbenden Antikörpers (1:50 Verdünnung von CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) und fixierbaren Viabilitätsfärbung (FVS, 1:500 Verdünnung) hinzu und mischen Sie die Zellen durch Pipettieren. 20 min bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Antikörper sollten vor dem Experiment titriert werden, um die optimale Verdünnung empirisch zu bestimmen.
5. Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 200 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung geben, die Suspension zentrifugieren (5 min, 500 × g, 4 °C) und den Überstand verwerfen.
6. Geben Sie 100 μl Fixierungs-/Permeabilisierungslösung (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung, mischen Sie die Zellen durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 4 °C.
7. Geben Sie 100 μl 1x Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung, zentrifugieren Sie die Platte 5 min lang (500 × g, 4 °C) und verwerfen Sie den Überstand.
8. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung geben, die Suspension zentrifugieren (5 min, 500 × g, 4 °C) und den Überstand verwerfen.
   HINWEIS: Das Experiment kann über Nacht pausiert werden, nachdem die Zellen in Permeabilisierungspuffer resuspendiert wurden. Lagern Sie die Probe bei 4 °C und vor Licht geschützt. Nach kurzem Mischen der Zellen vor dem Zentrifugieren fortsetzen.
9. Fügen Sie 100 μl Permeabilisierungspuffer hinzu, der die 1-fache Konzentration des intrazellulären Färbeantikörpers enthält (1:100-Verdünnung von Stickstoffmonoxid-Synthase 2 (NOS2), Arginase 1 (Arg1)), und mischen Sie die Zellen durch Pipettieren. 20 min bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Antikörper sollten vor dem Experiment titriert werden, um die optimale Verdünnung empirisch zu bestimmen.
10. Geben Sie 100 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung, zentrifugieren Sie die Platte 5 min lang (500 × g, 4 °C) und entsorgen Sie den Überstand.
11. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung geben, die Suspension zentrifugieren (5 min, 500 × g, 4 °C) und den Überstand verwerfen.
12. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl FACS-Puffer. Filtrieren Sie die Probe durch ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und 40 μm Siebkappe, bevor Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durchführen.

3. Sortierung myeloischer Tumorzellen für funktionelle Studien

1. Nach der Identifizierung der gewünschten myeloischen Zellpopulationen durch durchflusszytometrische Analyse reichern Sie die myeloischen Massenzellen für die Sortierung mit einem magnetischen Zelltrennkit an, das für die CD11b- oder CD11c-positive Selektion gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgelegt ist (siehe Materialtabelle).
2. Unter Verwendung von oberflächenfärbenden Antikörpern, die spezifisch für die gewünschten myeloischen Zelluntergruppen sind (1:100 Verdünnung von CD11b, Ly6C, Ly6G), färben Sie die vorangereicherten Zellen wie in den Schritten 2.2 bis 2.5 beschrieben.
   HINWEIS: Fügen Sie einen fixierbaren Viabilitätsfleck hinzu, um die Sortierung lebender myeloischer Zellen zu gewährleisten. Eine Färbekonzentration von 1 × 10⁸ Zellen/ml darf nicht überschritten werden. Passen Sie das Volumen an und teilen Sie die Proben in mehrere Vertiefungen auf, um eine hohe Zellzahl auszugleichen.
3. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Sortierpuffer (PBS mit 1 % w/v BSA, 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 1 mM EDTA). Filtrieren Sie die Probe durch ein 5-ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden und einer 40-μm-Siebkappe. Halten Sie die Zellen auf Eis und decken Sie das Röhrchen mit Alufolie ab.
   HINWEIS: Stellen Sie die Konzentration der Zellen/des Volumens auf die gewünschte Gerätespezifikation für die Sortierung ein.
4. Bereiten Sie ein Probenentnahmeröhrchen mit Fangmedium vor (5 mL Polypropylenröhrchen mit rundem Boden, das PBS mit 50 % FBS enthält).
   HINWEIS: Beschichten Sie die Röhrchen vor der Sortierung über Nacht mit 5 mL Auffangmedium. Verwerfen Sie am nächsten Tag alle bis auf 1-2 ml des Erfassungsmediums, bevor Sie die Probe entnehmen.
5. Ändern Sie die Einstellungen des Sortiergeräts, um den Probendruck zu verringern und Störungen bei der Tröpfchenbildung zu vermeiden. Rüsten Sie die 130-μm-Düsenspitze aus und verwenden Sie die 10-psi-Einstellung. Lassen Sie die Probe bei einer niedrigen Durchflussrate mit periodischem Probenrühren bei 100 U/min laufen, wobei sichergestellt wird, dass sich die Abscheidung der Tröpfchen in der Mitte des Röhrchens befindet. Bewahren Sie die Probe nach dem Sortieren auf Eis auf.
6. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang (500 × g, 4 °C), verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem gewünschten Medium für funktionelle Assays oder den adoptiven Transfer.

4. Adoptionstransfer von gereinigten myeloischen Tumorzellen

1. Injikulieren Sie 6-8 Wochen alte, weibliche C57BL/6-Mäuse intradermal mit 1 ×^{10 6} B16-Melanom-Tumorzellen, die in 30 μl PBS resuspendiert sind.
   HINWEIS: Die Mäuse sind im Voraus so zu impfen, dass das Tumorwachstum zum Zeitpunkt des Adoptionstransfers 100 mm³ nicht überschreitet.
2. Resuspendieren Sie die sortierten myeloischen Tumorzellen in PBS mit 25 mM HEPES und 1 mM EDTA in einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml. Filtrieren Sie die Probe durch ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und einer 40-μm-Siebkappe. Bleiben Sie auf Eis.
3. Induktion und Aufrechterhaltung von Mäusen unter Narkose mit 3% Isofluran. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um Augentrockenheit/-verletzungen zu vermeiden.
4. Laden Sie eine 31 G Spritze mit 50 μl Zellsuspension. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Spritze vorsichtig schnippen. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer.
5. Heben Sie mit einer sterilen Pinzette die Haut an der Basis des Tumors an. Führen Sie die Nadel in einem leichten Winkel nach oben in den Unterhautraum ein, um von unterhalb der Haut in den Tumor einzudringen. Drücken Sie mit der Pinzette die Haut um die Nadel herum zusammen und geben Sie das Spritzenvolumen langsam ab. Kneifen Sie die Haut weiterhin mit der Pinzette ein, während Sie die Nadel langsam entfernen, und verwenden Sie ein Wattestäbchen, um mögliche Leckagen zu reinigen.
   HINWEIS: Fahren Sie auf Wunsch mit zusätzlichen therapeutischen Behandlungen fort.
6. Lassen Sie die Mäuse sich von der Narkose erholen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode eine hohe Ausbeute an myeloischen Zellen aus soliden murinen Tumoren erzeugt. Die Erhaltung der Rezeptorintegrität und der zellulären Lebensfähigkeit ermöglicht eine zuverlässige funktionelle Analyse der gewünschten myeloischen Untergruppen. Diese Verbesserungen bei der Isolierung myeloischer Zellen ermöglichten es, die sich verändernde Funktion intratumoraler myeloischer Zellen nach Normalisierung der TME mit dem Histon-Deacetylase-Inhib...

Diskussion

Obwohl tumorinfiltrierende myeloische Zellen in unterschiedlichen Aktivierungs- und Differenzierungszuständen innerhalb des Tumors existieren, wurden mehrere Untergruppen identifiziert, darunter tumorassoziierte DCs (TADCs), tumorassoziierte Neutrophile (TANs), myeloische Suppressorzellen (MDSCs) und tumorassoziierte Makrophagen (TAMs)¹². Leider macht es die überlappende Expression von Zelloberflächenmarkern, die zur Identifizierung dieser myeloischen Zellunter...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-conjugated Antibody	R&D Systems	IC5868F	1:100