单细胞级别研究形状依赖性转录组学的方法

摘要

本文介绍了不同形状、代表不同病理的心脏细胞生长方法，并基于单个细胞的形态对这些粘附性心肌细胞进行排序。拟议的平台为不同类型的心力衰竭提供了一种高通量和药物筛查的新方法。

摘要

不同类型的心脏肥大与心脏肌细胞（CM）的体积增加以及CM形态的变化有关。虽然细胞体积对基因表达的影响是众所周知的，但细胞形状的影响尚不清楚。本文介绍了一种旨在系统分析CM形态学对基因表达影响的方法。它详细介绍了一种新的单细胞诱捕策略的发展，然后进行单细胞mRNA测序。还设计了一个微板芯片，其中包含3000个矩形纤维素微模式。这使得可以以不同的长度（宽度纵横比 （AR）增长 CMs，对应于不同类型的心力衰竭 （HF）。本文还介绍了一种协议，该协议旨在使用半自动微移细胞拾取器从其模式中拾取单个细胞，并单独将它们注入单独的解合缓冲液中。这使得可以剖查具有定义几何形态类型的单个 CM 的转录组，并根据一系列正常或病理条件来描述它们:肥大性心肌病 （HCM） 或后加载/同心与扩张性心肌病 （DCM） 或预载/偏心。总之，本文提出了不同形状（表示不同病理）的CM生长方法，并基于单细胞级别的形态对它们进行附着的CM排序。拟议的平台为不同类型的高频提供了高通量和药物筛选的新方法。

引言

根据世界卫生组织，心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。CVD 极大地影响人们的生活质量，并产生了巨大的社会经济影响。心肌病，如HCM和DCM，是心肌的主要疾病，HF的主要原因与高发病率和死亡率有关。高频有很多原因，包括环境影响，如感染和接触毒素或某些药物^8。HF也可以由遗传倾向引起，即突变^9。据认为，影响细胞外基质（ECM）分子、集成蛋白或细胞骨骼蛋白的遗传成分的变化可能导致机械机能受损和各种类型心脏病^10。

HCM的主要特点是左心室^{11，有时右心}室^12的无法解释的肥大，这经常呈现与中间隔膜的主要参与。HCM还具有舒张功能障碍和肌细胞混乱和纤维化^13。在大多数情况下，心脏的收缩装置受到沙康蛋白突变的影响，导致菌细胞¹⁴的收缩性增加。相比之下，DCM的特点是一个或两个心室的分裂，并且有家族病因在30%到50%的病例^15。DCM影响广泛的细胞功能，导致肌细胞收缩受损，细胞死亡和纤维修复^16。

遗传学已经表明，某些类型的突变迫使单个CM在HCM³期间采用特定的形状特征，即长度为:宽度AR的方形细胞，几乎等于1:1^{4（AR1）。}DCM 也是如此，具有几乎等于 11:1 （AR11） 的拉长细胞也是如此。此外，HF可由后载量增加（例如高血压）引起。在这些情况下，血流动力学要求迫使CMs根据拉普拉斯定律采取方形形状，AR从7:1⁵ （AR7） 到1:1^6，7。HF 也可以由预载量增加（例如，在导致卷过载的条件下）引起。当这种情况发生时，生物物理约束强制妈妈拉长，AR 从 7:1 变化到 11:1。

膜上的信号活动取决于全局细胞几何参数，如细胞AR、大小、膜表面积和膜曲^率18。当新生儿用膜镀在基板上，这些基板被纹上以特定长度约束细胞:宽度AR时，当比例与健康成人心脏中的细胞相似时，它们表现出最佳的收缩功能。相比之下，当这些比率与失败心脏中的菌细胞的比例相似时，它们的表现^很差。在肥大的早期阶段，细胞变得更宽，这反映在横截面面积的增加上。HF 发生在肥大后期，细胞通常出现拉长。因此，毫不奇怪，在体内大鼠模型慢性肥大已经报告左心室肌细胞长度增加约^30%20，但成人CMs从转基因小鼠模型，急性治疗肥大刺激在体外显示类似的增加细胞宽度，^{而不是21。}

单细胞RNA测序，允许精确分析单细胞的转录组，目前正在彻底改变对细胞生物学的理解。在回答有关单个细胞形状如何影响基因表达的问题时，这项技术是首选方法。我们比较了形状不同的单个细胞，特别是 1:1、7:1 或 11:1 的 AR。这是通过将新生儿鼠心室CMs播种到一个特别设计的芯片上，该芯片填充了纤维素涂层^{的微面模式2，} 定义的 ARs为1:1、7:1或11:1。微模式是利用光刻技术制造的。微表层被纤维素涂层，周围是细胞恐惧症表面。因此，CMs 将仅通过生长在纤维素基材上来附加、传播和捕获微模式的固定 AR，同时避免细胞恐惧症区域。微模式不是形状良好的格式。相反，纤维素水平正好位于周围细胞恐惧症区域的相同高度。这为培养皿中生长的细胞提供了类似的条件，因为周围墙壁没有压力。此外，具有不同 AR 的微模式的表面面积相等。

实验设计有两个特别重要的方面，这导致使用单细胞RNA测序而不是批量RNA测序。首先，只有几个百分比的微模式可以由单个单元格占用。其次，有时单个单元格不能完全占据微模式表面。必须挑选完全覆盖微表层的单细胞进行单细胞RNA分析。因为只有芯片上镀有细胞的子群满足这两个标准，所以仅仅对整个芯片进行三试化并收集所有细胞进行批量RNA测序是不可行的。合格的细胞需要使用半自动细胞拾取器单独采摘。

目前尚不得而知CM形状本身是否对心肌同步体有功能内影响。本文提出的方法的主要目的是开发一个新颖的平台，研究细胞形状本身是否对转录组^17有影响。虽然体外研究不同于体内研究，但本研究的目的是研究不同细胞形状对基因表达的影响，同时铭记在体内比较不同形状的细胞是非常苛刻的。这些实验的灵感来自K kuo等人¹⁹号，他使用了类似的方法，并报告说他们观察到了由于细胞形状的变化而导致的生理参数的变化。

研究方案

所有涉及动物的程序都符合瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所动物伦理委员会的规定。

1. 微型芯片布局

1. 使用定制设计的芯片（材料表）（图1A）:19.5毫米×19.5毫米盖玻片，带活性微表，用硅酸盐玻璃的光刻打印。
   注:这些微模式被细胞恐惧症区域包围。因此，种子细胞只能附着并生长在这些微模式之一上，并捕获该微模式的AR。芯片分为三个区域，每个区域由具有特定AR的微模式组成。芯片布局如图 1B所示。已定义的 AR 的几何体见表 1。图1B中下部图像显示了纤维素微模式不同形状的 放大荧光图像。

2. 涂层微层芯片

1. 通过将 80 μg 的纤维素添加到 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS^-/-） 中，为每个芯片准备 2x 涂层蛋白溶液。
2. 将芯片转移到 35 毫米格雷纳培养皿中，并立即添加 2 mL 的 PBS^-/-。然后加入2mL的2x涂层蛋白溶液。
3. 在室温下孵育芯片2小时。
4. 使用 PBS^-/-连续稀释步骤清洗涂层溶液。芯片表面应始终为湿。然后，用2 mL的电镀介质代替PBS，在37°C下孵育，直到播种细胞。

3. 隔离 VM

1. 通过补充DMEM:M199（4:1）与10%的马血清，4%胎儿牛血清，2%HEPES（1 M）和1%青霉素/链霉素（10，000 U/mL）准备电镀介质²²。
2. 从2天大的新生儿心脏的左心室解剖组织，并转移到含有PBS的10厘米培养皿中。将组织切成大约1毫米³ 块。
3. 将收获的组织转移到转子盖管中，在组织分离的盖子中装有转子（材料表）。让组织安定下来，然后小心地取出上清液。
4. 将酶混合物1和2的混合物2.5 mL加入C管中，并紧闭盖子。
5. 将转子盖管插入分离器的套筒上，配备加热器（图 2A 和 B） （材料表）。运行孵化程序37C_mr_NHDK_1（图2C），持续约一小时。
6. 当孵育程序运行时，在PBS中准备含有2 mM EDTA和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PEB缓冲液，pH 7.2，并保持在4°C。
7. 孵化程序终止后，分离转子盖管（图2D），并添加7.5 mL预热电镀介质。
8. 重新悬浮样品，并使用 70 μm 滤株过滤细胞悬浮液。
9. 用另外 3 mL 的电镀介质清洗过滤器。
10. 以 600 x g 离 心电池悬架 5 分钟。完全吸上一道。
11. 将细胞颗粒重新在60μL的冷PEB缓冲液中。
12. 加入20μL的新生儿心肌细胞分离鸡尾酒（材料表），含有微米大小的珠子，针对非CMs。
13. 加入20μL的抗红血球珠（材料表）。
14. 在4°C下混合悬浮液并孵育15分钟。
15. 添加 400 μL 的 PEB 缓冲液。
16. 将电池悬浮液应用到LD柱（材料表）上，该柱已垂直插入磁铁支架，用PEB缓冲液洗涤良好。
17. 收集未标记的细胞，用 0.5 mL 的 PEB 缓冲液清洗柱。
18. 加入8 mL的电镀介质，将细胞悬浮液转移到75厘米² 无涂层培养瓶中，并在37°C孵育1.5小时。剩余的非CM将开始粘附于未涂覆的细胞培养，细胞悬浮液将由CM群体丰富。

4. 模式化 VM

注:我们将单个 CMs 与 1:1、7:1 或 11:1 的 ARs 进行比较。这是通过将孤立的新生儿CMs播种到一个特别设计的芯片上，该芯片填充了纤维素涂层的微模式，定义的 AR为1:1、7:1或11:1。微表层被纤维素涂层，周围是细胞恐惧症表面。因此，CMs 将仅通过生长在纤维素基材上来附加、传播和捕获微模式的已定义 AR。根据以下步骤对隔离的 VM 进行阵列。

1. 将细胞悬浮液转移到15 mL管中，通过添加适当的电镀介质，计算细胞并稀释至每mL100，000个细胞的浓度。
2. 将 2 mL 的电池悬浮液添加到芯片上，芯片已浸入 2 mL 的 2 mL 热电镀介质中，位于 35 mm Greiner Petri 盘中。
3. 在37°C下用5%CO2孵育该盘_， 使CM附着在纤维素涂层微模式上，并允许每个CM获得其基板微模式的AR。
4. 18 小时后，检查芯片。如果大多数细胞已连接，则分离并清除附着在图案细胞上的碎屑和死细胞。为此，请移除电镀介质，轻轻添加 PBS^-/- 滴，从芯片中心开始，然后向两侧移动。重复2次。
5. 通过补充DMEM:M199（4:1）与4%马血清、4%胎儿牛血清、2%HEPES（1 M）和1%青霉素/链霉素（10，000 U/mL）一起吸气PBS。

5. 挑选粘附的 VM

注:经过72小时的培养期后，使用半自动细胞拾取器（材料表）从其纤维素微模式中选取图案单一CM（图3）。单元拾取器使用软件²³来控制电动阶段（图3A）。70 μm玻璃微胶囊（图3B）用于挑选和注射有图案的新生儿大鼠CMs。细胞拾取器通过产生真空和通过施加压力对粘附细胞进行排序。使用注射器泵拉注射器（图3C）应用注射器1号中的真空。静液压基于重力，通过将注射器 2 号放在显微镜台上 87 厘米的距离来感应。注射器 1 和 2 分别通过 PTFE 管连接到嵌入控制单元中的阀门 1 和 2（图 3D）。PTFE 管完全充满无 RNase 水。然后将采摘的单细胞注入聚合酶链反应（PCR）管，其中含有3.55μL的解解缓冲液。

1. 经过72小时的培养后，取出旧介质，用温暖的^{DPBS-/-轻轻冲洗芯片表面}。
   1. 保持盘子平整，用1000μL移液器从盘子的一侧轻轻吸气旧介质。确保芯片一直保持湿润。
   2. 添加 2 mL 的 DPBS^-/- 轻轻和滴式分离连接到图案细胞的大多数死细胞，从芯片的中心开始，然后移动到其两侧。
   3. 吸气大部分的DPBS去掉尽可能多的分离的浮动细胞，从芯片的中心开始，然后移动到两侧。
   4. 再次重复步骤 5.1.2 和 5.1.3。
2. 使用倾斜钳抓住芯片的边缘，并立即将其转移到一个新的无菌35毫米Greiner Petri盘，以减少浮动细胞的数量，而采摘。
3. 立即添加 1.5 mL 的 DPBS^-/- 使芯片不会干涸。
4. 添加 1.5 μL 的"活力染料循环绿色"，以可视化活细胞的核。
5. 使用钳子尖端将芯片放在格雷纳培养皿的中心。
6. 在芯片上放一个腔室 （ 材料表 ） .腔室将芯片固定到盘子的底部，而不会阻止对细胞模式的访问。
7. 将Greiner Petri 盘安装到细胞拾取器阶段的菜架上，然后插入磁盖。
8. 校准自动喷射。
   1. 找到刻在"实时视图"窗口中图像中间的图像中间的电动舞台上的十字线。
   2. 聚焦十字线，并在 扫描和分拣窗口中 选择 自动喷射按钮的校准 。
9. 将 DPBS^-/- 更换为 1.5 mL 的 DPBS/trypsin^-/- （1:1）， 而菜台在舞台上， 以松开细胞从纤维素， 以便一个流体真空可用于采摘细胞.
10. 使用扫描和排序 窗口中的 扫描选项卡 扫描整个 芯片。在视野中找到芯片的左上角，然后单击左 上角行中的"获取 当前显微镜位置"。
    1. 然后，将电动舞台移动到芯片的右下角。聚焦显微镜，然后单击 右下角行的 "获取当前显微镜位置"。
11. 单击" 设置最锐利的 平面"按钮，在弹出的窗口上 单击"转到右上角"。聚焦显微镜并单击 "转到左下角并 设置焦点"。完成后，单击" 完成 "按钮并开始扫描。
12. 当扫描终止时，转到"分析 " 选项卡并选择通过研究标准的单个单元格。
13. 确保玻璃微胶囊位于显微镜的实时视图中间。
14. 使用软件的泵 窗口控制 注射器泵。从直径为 27 mm 的 50 mL 1 号注射器中提取 4 mL，从而产生真空。
15. 在" 排序" 选项卡中
    1. 设置阀门的喷射参数。计算出，如果阀 2 打开 120 毫秒，则交付拾取单单元的喷射量为 1 μl，则阀 1 打开 20 毫秒，在时间间隔 200 毫秒后为毫秒。由于管子的弹性，打开阀门1停止注入流量。
    2. 设置阀门的拾取参数。计算出，如果阀 1 打开 20 毫秒，然后阀 2 打开 10 毫秒，在时间间隔 10 毫秒后，可以拾取大多数图案单元。这是因为他们的纤维素结合被使用三辛治疗后松动。
    3. 单击" 计算路径" 按钮。该软件计算从细胞到细胞的最快路径，以在整个芯片中拾取和注入选定的细胞。
    4. 将显微镜聚焦在芯片表面的图案细胞上。
    5. 使用操纵手柄，小心地向下移动微胶囊，这样无需接触电池即可获得微胶囊尖端最清晰的图像。
    6. 单击微 移 管偏移 部分中的"设置" 按钮。将弹出一个新窗口，显示微缩线横截面。单击毛细管的确切中心。然后，软件将在 x、y 和 z 坐标中记录毛细管的尖端偏移。
    7. 使用"开始排序 "按钮启动 排序。

结果

组织从2天大的新生儿心脏的左心室解剖，并分为单细胞。然后，富集的CMs被播种在含有具有不同 ARs 的纤维素图案的芯片上。经过72小时的培养，该培养基被^DPBS-/-2分钟的1:1000 Vibrant染料循环绿色所取代，以可视化活细胞的核。接下来，用DPBS-/-/trypsin（1:1）对细胞进行处理，以从纤维素中松开细胞，以便使用流体真空促进细胞采摘。同时，使用连接到细胞拾取器的倒置显微镜，以10倍的放大倍率扫描整个芯片。这是由于三辛治疗而使细胞圆润之前进行的。根据扫描的图像选择合格的单元格，其坐标保存在单元格选取器软件中。只有在包含单核单细胞时，并且只有当细胞完全覆盖其纤维素微模式时，才选择微模式。细胞分拣器一个一个地挑选选定的细胞，成功挑选的每个单个细胞立即被注射到单个PCR管中，并放置在显微镜阶段。每个PCR管都含有3.55μL的解液缓冲液（表2）。从删除介质开始的排序过程在 40 分钟内完成。根据Smt-Seq2协议^24（表3），对碱化单细胞进行了补充脱氧核糖核酸（cDNA）合成、PCR预扩增和纯化。通过自动电泳分析仪检查纯化cDNA的质量。图4中介绍了一个拾取单细胞预放大cDNA的电谱图。RNA-Seq库是按照智能-Seq2协议^24编写的。

为了观察图案的CMs的沙康结构，图案的CMs沾染了沙α-行为素抗体。细胞用驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 1:800在室温下孵育1小时，进行二次染色。核被染有1微克/mL DAPI。使用倒置共体显微镜，使用 63 倍油浸（NA 1.4）目标获得免疫荧光图像（图 5）。

图1:芯片的布局与纤维素微模式。
（A） 定制设计的芯片的图像。该芯片是一个 19.5 毫米 x 19.5 毫米盖玻片，带纤维素微板，通过硅酸盐玻璃上的光刻打印。（B） 芯片布局。芯片被划分为三个区域，每个区域由具有特定AR的纤维素微模式组成。这个数字已被哈夫特拉达兰·埃斯法哈尼等人根据《第二份材料^{》http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。}请单击此处查看此图的较大版本。

图2:配备加热器装置的分离器。
（A） 用于全自动分离2天大的新生儿左心室的分离器。（B） 加热装置。（C） 转子盖管.（D） 现成的程序，用于组织分离的完全自动化工作流程。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:细胞拾取器装置。
（A） 细胞拾取器的电动阶段的放大视图。舞台上嵌入了一个用于 10 个 PCR 条的培养皿支架和 80 个孔以及一个用于校准十字线孔的孔。（B） 玻璃微胶囊的放大视图。（C） 注射器泵。（D） 控制阀 1 和 2 的打开和关闭时间窗口的控制单元安装在控制单元内。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:一个拾取的单细胞预放大cDNA的电图。
19 PCR预扩增周期用于获得15μL的1纳克/μL纯化cDNA产量。观察到凝胶状密度测量图中的透明带，与电图中1852 bp的峰值相对应。碎片的平均大小为 1588 bp。此外，短于 300 bp 的少量片段表示良好的 cDNA 库。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:具有不同AM的α（绿色）和核（蓝色）的免疫荧光染色。
染色质被 DAPI 染色了。 请单击此处查看此图的较大版本。

莫福型	Ar	长度 （μm）	宽度 （μm）	纤维素面积 （μm2）
AR1	1:1	47	47	2209
AR7	7:1	126	18	2268
AR11	11:1	155	14	2170

表 1:图案化 VM 的几何形状。

组件	体积 （+L）
无核水	0.65
（0.4% 卷/卷）特里顿 X-100	1.8
dNTP 混合 （25 mM）	0.8
RNase抑制剂 （40 U +L-1）	0.1
Oligo-dT30VN 寡核苷酸 （100 μM）	0.1
ERCC RNA 尖峰混合（2.5 x 105 稀释）	0.1
注入的单细胞	1
总体积	4.55

表2:单细胞自定义解解缓冲液。

组件	体积 （+L）
上标 II 第一链缓冲器 （5 倍）	2
DTT （100 mM）	0.5
贝塔因 （5 M）	2
Mgcl2 (1 M)	0.1
RNase抑制剂 （40 U μL-1）	0.25
上标 II 逆转录酶 （200 U μL-1）	0.5
TSO （100 μM）	0.1
总体积	5.45

表3:逆转录（RT）混合一个RT反应，从单个CM的利酸盐合成第一链cDNA。

讨论

本研究采用单细胞RNA测序，这是一种新型而强大的技术，可以检测单细胞的转录组。它结合了培养单个 CMs 的创新方法，因此它们采用不同的 AR，否则只能在体内观察到。

这项研究有一些局限性。例如，新生儿 CM 必须用于生成不同的形态型，因为以定义的形状培养足够重要的成人 CM 72 小时是异常具有挑战性的。此外，CMs在体内培养72小时，这可能对基因表达模式产生影响。然而，这种培养是必要的，以便细胞可以形成特定的形态型。此外，只有单核和完全覆盖纤维素微模式的单细胞被选择进行分选。每个芯片上的图案细胞必须只在一轮排序中排序。最后，大约50个细胞，大约是所选细胞的三分之一，成功地从每个芯片中拾取。有两个原因限制成功拾取的单元格的数量。首先，一些细胞过于紧密地附着在纤维素模式上，拾取流不够严格，无法成功拾取它们。其次，由于三辛治疗，一些细胞和纤维素之间的附着变得太松。因此，当微胶囊接近它们时，这些细胞被推开，离开它们的纤维素微模式，它们没有被拾起。作者并不声称这种设置与体内环境相同，但它被证明是一个可行的方法来回答研究问题。

该方法适用于不同的细胞类型（例如，hiPS-CMs）。但是，应优化以下因素以研究其他细胞类型。应使用用于特定细胞类型的附件的适用 ECM 粘合剂分子来涂装微模式。微模型的几何形状应根据研究问题和细胞类型进行修改。根据研究问题可以修改栽培周期。分离试剂及其孵育时间应针对研究细胞类型进行精确优化。例如，Accutase可用于分离胚胎和神经元干细胞，而不是 TryplE。阀门的打开时间参数应经过仔细审查，以成功、但轻轻地拾取电池。总之，我们设计了一个研究细胞形状的新平台，为该领域的研究人员提供了宝贵的资源。在此背景下，我们设计了一种实验方法，模拟血流动力学约束强加于体内CM的体外特征形状，以识别细胞结构与基因表达之间的相互作用。我们还报告了研究体外HF的新平台的发展，以及细胞形状作为基因表达的有力决定因素的识别。这是一个对生物学和医学具有深远影响的新观察。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis analyzer
Anti-Red Blood Cell MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-109-681
Axio Observer microscope	Zeiss	Z1	Inverted microscope
Betaine solution (5 M)	Sigma-Aldrich, MERCK	B0300
CellSorter	CELLSORTER	https://www.singlecellpicker.com/	Cell picker
CYTOOchamber	CYTOO	30-010	Custom-designed chip
CYTOOchip	CYTOO	10-950-00-18	Chamber
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31966-021	high glucose, GlutaMAX Supplement
dNTP mix (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R1122
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Abcam PLC	ab150105
DTT (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	18064071
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Fibronectin	Sigma-Aldrich, MERCK	F4759
gentleMACS C Tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Rotor-cap tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427	Dissociator with heater
Greiner CELLSTAR Petri dish	Sigma-Aldrich, MERCK	P6987
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-056
Horse Serum	Sigma-Aldrich, MERCK	H0146
LD column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	31150-022
NE-1000 syringe pump	New Era Pump Systems	NE-1000	Syringe pump
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat	Miltenyi Biotec	130-105-420
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-098-373
Oligo-dT30VN oligonucleotides	IDT Technology	5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′
RNAse inhibitor (40 U µL-1)	Clontech	2313A
sarcomeric α-actinin	Sigma-Aldrich, MERCK	EA-53
SP8 confocal microscope	Leica Microsystems	SP8	Confocal microscope
Superscript II first-strand buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Triton X-100	Sigma-Aldrich, MERCK	T9284
TryplE Express enzyme, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013
TSO (100 µM)	QIAGEN	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′
Vibrant Dye Cycle green	Thermo Fisher Scientific	V35004